分子标记辅助选择步骤及所需药品配方

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1、附录1：实验程序及所用溶液配方实验程序1：DNA小量提取法（SDS小量提取法）1.取每个水稻样本新鲜叶片2cm左右于1.5eppondorf管中，加入液氮磨碎。2.加入700ul已预热至650C的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴30min。3.加入200ul5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，40C8000转离心5min，将上层液倒入另一新的1.5mleppondorf管中。4.加入等体积的异丙醇，置于-200C30min，40C10000转离心4min。5.弃上清，加入70%乙醇清洗，晾干。6.

2、将风干的DNA溶于100ulTE溶液中，存于40C备用。实验程序2：DNA大量提取法（SDS大量提取法）1.准备工作：将DNA提取液放于650C的水浴锅中预热，将异丙醇放于-200C冰箱中预冷，选好50ml的离心管灭菌。2.每个水稻样本新鲜叶片取1-3g，剪碎，放入研钵，加入液氮磨碎。3.将研磨好的叶片转于50ml的离心管中，加入20ml已预热至650C的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴20min，以使反应充分完全。4.取出离心管，加入5ml5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下

3、颠倒数次。5.加入15ml氯仿，嫩叶片会起泡沫，老叶片则变成墨绿或变黑。室温下以3000（10000rmp的速度离心3min），将上层液倒入另一新的50ml离心管中。6.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。7.待DNA结块，用玻棒挑出DNA，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。8.将风干的DNA溶于500ulTE溶液中，存于40C备用。SDS抽提液1MTris-Hcl100mlPh8.00.5MEDTA100mlpH8.05MNaCl100ml10%SDS（十二烷基硫酸钠））125ml加蒸馏水定容至100

4、0ml。5MNaCl100ml在80ml水中溶解29.22gNaCl加水定容至100ml，分装后高压灭菌10%SDS（十二烷基硫酸钠））1000ml在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的PH值至7.2，加水定容至1000ml，分装备用。45MKAC混合液（100ml）60ml5M醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5mlH2O5M醋酸钾1000ml将491g醋酸钾（1M为98.2g）溶解于90ml纯水（Mill-Q水或相当级别的水）中，用2mol/L乙酸调节PH值至7.5后加入纯水定容

5、到1L，保存于-20℃。TE(pH8.0)100ml10mMTris-HCl(pH8.0)1ml(1M,ph8.0)1mMEDTA(pH8.0)0.2ml(0.5M,ph8.0)加蒸馏水定容至100ml,高温灭菌。0.5MEDTA(pH8.0)18.61gNa2EDTA-2H2O溶于80mlH2O中，用NaOH调pH至8.0，定容至100ml，高温灭菌，室温保存。1MTri-HCl(pH8.0)在800ml水中溶解121.1gTris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。（参《分子克隆》，金冬雁等，1996）实验程序4：PCR

6、扩增（一）PCR反应体系20ul体系终浓度Primerpair(4uM)2ul0.4uM10×buffer2ul1×bufferMg2+(25mM)2ul2.5uMdNTPs(10mM)0.3ul133ulTaq酶（4u/ul）0.25ul1U/20ulDNA(20ng/ul)2ul1.5ng/ulSterilewater11.45ul(二)PCR反应程序SSR94℃,5min→94℃,1min→53℃,1min→72℃,10min→4℃,保存↘↙72，1.5min(35个循环)实验程序5：聚丙烯酰胺凝胶电泳4（一）制胶30

7、%acrylamide(丙烯酰胺)胶贮存液acrylamide290gbis-acrylamide(双叉丙烯酰胺)10g先溶于总体积为600ml的水中，加热至37℃溶解，定容至1000ml。4℃保存于棕色瓶中。10%过硫酸铵（ammoniumpersulphate）超纯过硫酸铵2g超纯水18ml10×TBEbufferTrisbase54gBoricacid(硼酸)27.5g0.5MEDTA(ph8.0)18.625ml搅拌溶化，定容至500ml.40％的蔗糖上样缓冲液（100ml）蔗糖40g+60ml水+0.025g二甲苯

8、蓝+0.025g溴酚蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离A凝胶的灌制（1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。（酒精擦洗）操作中，防止两玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。（2）玻璃板的组装：将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0%的琼