分子克隆实验标准步骤

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1、分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程：二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：1.PCR扩增目的基因（编号CloneSOP-1）以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例体系（50ul）：10×KODbuf5uldNTP(2mM)5ulMg2+3ulPrimer11ulPrimer21ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH2Oupto50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞1.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号CloneSOP

2、-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TB

3、E（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。2.试剂盒回收DNA片段（编号CloneSOP-3）以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝

4、胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心

5、30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。⑥重复操作步骤⑤。⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或ddH2O，室温放置

6、2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。3.酶切反应（编号CloneSOP-4）以本实验室常用酶FastDigestrestrictionenzymes（Thermo）为例双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：10×FastDigest®bufferor10×FastDigest®Greenbuffer5ulFastDigestrestrictionenzyme10.5-1ulFastDigestrestrictionenzyme20.5-1ulDNANddH2Oupto50ul酶切体系混合均匀后置于37℃条件下

7、反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。4.酶切产物的回收（编号CloneSOP-5）以本实验室常用Axygen®AxyPrep™PCRClean-UpKit（Axygen）为例①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A不足100ul，加至100ul），混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000g离心1min，弃滤液。②将制备管置回2ml离心管，加700ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。③将制备管置回2ml离心管，加400

8、ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。④将制备管置回2ml离心管，12000