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1、胶体金标记实验步骤点击次数：13发表于：2008-08-1914:02转载请注明來自丁香园來源：丁香园1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋口的吸附主要取决丁-pH值，在接近蛋口质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢I古I的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。（1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/LpH7.0Nad溶液中4°C透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g4°C离心1h,去除聚合物。（2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/
2、LK2CO3或0.1Mol/LHCI调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9〜6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和索时，调至9〜10.由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。由丁•盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋口质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离了和硼酸根离了的存在，因为它们都可吸附于颗粒表ifli而减翦胶体金对蛋H质的吸附。2.蛋白质
3、最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定（1）根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml.（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/LpH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5pg/ml-50pg/mI,分别取1ml,加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。（3）5min后,在上述各管中加入0.1ml10%NaCI溶液，混匀后静置2h,观察结果。（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白虽达到或超过最低稳定虽的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋口质用量，
4、即为该标记蛋H质的最低用量，在实际丁•作小，可适当增加10%〜20%。将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml（禽蛋白质5〜40ug）加到1ml胶体金溶液屮，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0,1ml10%NaCI溶液，混匀厉静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋口量再加10%即为最佳标记蛋白量。3、标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/LK2CO3调pH至9.0,电磁搅样IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅样10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋H与胶体金聚介发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血淸（BSA）和1%
5、聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5%BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醉加至总溶液的1/10.在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量蚁大。下述标记步骤最为常见：①用0、1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCI调节金溶胶至所需pH（标记SPA时调到pH6.0）。②于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋H质溶液（休积为2〜3ml）,搅拌2〜3分钟。①加入5mI1%PEG20000溶液。②于10000〜100000g离心30〜60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。③将沉淀悬浮于一定体积含0.2〜0
6、.5mg/mlPEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复,浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/mI叠氮钠防腐，置4°C保存。④包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0.以上操作中应注意，一切溶液屮不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。4、胶体金标记蛋白的纯化（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋H的利啖及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。用BSA做稳定剂的胶体金一羊抗兔IgG结合物
7、可先低速离心（20nm金胶粒用1200r/min,5nm金胶粒丿U1800r/min）20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物）
8、J6000g,4°C离心1h；20nm〜40nm胶体金结合物，14000g,4°C离心1h.仔细吸出上淸，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3）,将沉淀重悬为原体积的1/10,4°C保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18°C保存一年以上。为了得到颗粒
