微rna-365调控骨肉瘤细胞增殖迁移的作用及机制分析

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1、微RNA-365调控骨肉瘤细胞增殖迁移的作用及机制分析卫江华许刚梁智中步鹏山西省肿瘤医院骨肿瘤科山西省肿瘤医院病理科2017-05-22Received：2017-05-22骨肉瘤(osteosarcoma)是一种骨髓腔实体肿瘤，起源于间叶组织，是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤U1，多数为溶骨性，也有少数为成骨性，骨端肿瘤约占肿瘤的3%-4%和恶性骨肿瘤的30%［2,3］。由于其血行转移发生比较早并且容易发生肺部转移，所以病情恶化程度极高。微RNA(miRNA,idR)是近年来研宄非常火热的非编码小分子RNA，长度约为22nt，它的作用机制

2、是通过与FI的mRNA的3'-非翻译区(UTK)结合抑制或降解目的mRNA£il。很多研究表明，miR参与了骨肉瘤的发生、发展的一系列生理过程，包括侵袭和转移。其中miR-365被证明肿瘤发生等疾病关系密切，与炎性反应调控相关性极高。文献［5］发现miR-365可以通过Spl和转录因子核因子kB下调白细胞介素(TL)_6的表达水平,达到调控机体免疫防御能力的A的。我们通过观察miR-365对骨肉瘤细胞增殖及凋亡能力的影响，探讨其作用机制，为将miR-365作为靶向基因治疗骨肉瘤提供依据。1材料和方法1.1材料不同转移能力的骨肉瘤细胞系(D1

3、、H2)由我院病理实验室构逑并保存，均起源于购买自第四军医大学唐都医院骨肿瘤研宄所的S0SP-9607骨肉瘤细胞系，miR反转录试剂盒及SYBGreen实时定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自H木TaKaRa公司；armexinV-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(FTTC/PT)细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD生物公司。RNA提取试剂TRIzol、胎牛血淸、细胞瞬时转染液Lipofectamine2000、四甲基偶氮P坐盐(methylthiazolyltetrazolium,MTT)均购自美国Invitrogen公司。1.2方法1.2.1miR

4、-365引物:由苏州金唯智生物技术有限公司合成，正向引物为5'-UAAUGC-CCCUAAAAAUCCUUAU-37,反向引物为5'-AAGGAUUUUU-AGGGGCAUUAUU-37;并构建pcD-NA-miR-365重组质粒。1.2.2骨肉瘤细胞培养和转染：采用含10%胎牛血清（EBS）的KPM11640培养DI、H2，置于培养箱中培养（37°C、5%CO2）。转染前24h细胞融合度达到约50%时，收集对数生长期细胞并接种于24孔板，然后按Lipofectamine2000Reagent说明•节进行转染操作。1.2.3实时定量PCR检

5、测细胞转染效率：转染48h,采用TRTzol法提取细胞总RNA并进行定量，然后通过miR逆转录试剂盒逆转录得到定量PCR模板。再选择U6作为内参，正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，通过实时定量PCR检测细胞转染效率。1.2.4MTT法检测骨肉瘤细胞增殖能力:通过MTT法绘制细胞的生长曲线观察骨肉瘤细胞的增殖能力。首先将转染的阴性对照的骨肉瘤细胞重悬为细胞密度5X10/ml，再以每孔200u1的量接种于96孔细胞培养板，设空白对照组同时实验组均设6个重复。在细

6、胞贴壁后每隔24h取出1块细胞培养板，每孔加入5mg/ml的MTT液20P1，继续避光孵育6h;吸净细胞培养孔内液体，每孔加入150yl二甲基亚砜（DMS0）,摇床摇避光震荡15min,在490mn处测定每孔的吸光度（A）值，取每组各孔的A值的平均值为生长曲线的纵坐标，时间（d）为横坐标，绘制标准曲线。1.2.5细胞周期检测:转染48h后消化细胞，终止消化后磷酸盐缓冲液（PBS）把细胞洗涤1次，离心去上清。加入1ml70%乙醇固定液重悬细胞4°C固定过夜。离心5min去除固定液。加入1mlPBS重悬细胞，室温静置15min，离心取细胞沉淀，

7、加入PT染色液重悬，室温避光30min,激发波长488nm，流式细胞仪检测。1.2.6Transwell细胞迁移试验：制备细胞悬液时为了去除血清的影响，先将细胞在无血清培养基里培养12h再进行消化细胞，将骨肉瘤细胞制成悬液，用PBS洗2遍后调整出约（2~3）X10个细胞，重悬于100PlRPMT1640培养基中（含0.2%牛血清白蛋白（BSA）的无血清）。再在24孔板下室内接种细胞，加入600ul的RPMI1640培养基（含5%的FBS），取100u1制备好的细胞悬液加入Transwell小室培养12〜14h后,4%多聚甲醛染色30min,

8、0.2%tritonX-100处理15min,用甲苯胺蓝染5min,再随机挑选10个视野在显微镜下进行贴膜细胞计数。1.2.7AnnexinV法检测骨肉瘤细胞的凋亡:通过Anne