byl无细胞系统对植物rna病毒翻译复制机制的研究进展

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1、BYL无细胞系统对植物RNA病毒翻译复制机制的研究进展安梦楠吴元华沈阳农业大学植物保护学院无细胞翻译系统是高效表达重组蛋白质的体外分子研宄系统，BYL是一种通过密度梯度离心法脱去液泡的烟草BY-2裂解液无细胞系统。BYL系统可支持外源mRNA以及多种植物RNA病毒的蛋白质表达，由于BYL系统中保留植物RXA病毒复制所需的胞内膜结构，所以该系统可支持RNA病毒核酸负义链、正义链和亚基因RNA的合成。综述了BYL系统应用于植物RNA病毒翻译和复制等机理以及RNA干扰机制方面的研究进展，并对其研究前景进行展望，旨在便于更多的研究者系统了解BYL无细胞系统，

2、将其更广泛地应用于其他RNA病毒的翻译复制机制研宂中。关键词：无细胞体系;BYL;蛋白质表达;植物RNA病毒;与体内(invivo)蛋白质表达体系相比，无细胞系统突破了细胞的限制，具有反应时间短、蛋白质表达迅速、不易于被蛋白酶降解、可表达对细胞有毒性的蛋白质等诸多优点m。无细胞系统中的粗裂解液中包括核糖体、翻译起始因子等翻译所需的基础因子，通过外源加入蛋白酶抑制剂、氨基酸、能量再生物质及底物等可实现短时间内表达目标蛋0质位1。无细胞系统的开发和研宄进展为蛋白组学的研宄及高通量药物筛选提供了便捷的手段［1-3］。目前，已被开发和利用的无细胞系统有原核和

3、真核系统两种类型，以大肠杆蘭为代表的原核无细胞系统被广泛应用多年，其优点在于成本相对低廉II蛋闩质产量较高U1。20世纪屮期，人类首次采用细胞裂解液或抽提物介导蛋0质的体外合成，随后，无细胞系统在破解遗传密码子的研宄中发挥重要作用边1。近年来，真核生物无细胞系统发展迅速，具有代表性的有麦胚芽抽提物（Wheatgermextract,WGE)系统、兔网织红细胞裂解液(Rabbitreticulocytelysate,RLL)以及昆虫细胞抽提物(Insectcellextract,ICE)M其中WGE系统和RLL系统已经商品化并广泛应用在科学研究中m。由

4、于WGE系统和RLL系统中不含胞内膜结构以及缺乏病毒复制过程所需的寄主蛋Q质，所以植物病毒无法完成复制m，故上述商品化的无细胞系统无法用来详细研宄病毒复制的分子机理。因此，急需开发出新的同时支持植物RNA病毒翻译和复制的体外植物病毒研究系统。BY-2Lysate(BYL)系统是很好的研究植物病毒翻译复制的无细胞体外系统M。本文首先介绍丫BYL系统的开发和制备过程，并对该系统与其他几种无细胞研宄体系特点进行了比较;其次，探讨了BYL系统在植物RNA病毒翻译和复制机理的研宄以及在植物RNA干扰机理方面的研宄进展;最后，对BYL系统在植物病毒学及分子牛.物

5、学方面的应用前景进行展望，旨在希望更多的研究者系统的了解BYL无细胞系统。1BYL无细胞系统的开发植物KNA病毒的细胞内复制过程包括:通过微伤口进入细胞内后脱去外壳，释放核酸RNA并劫持寄主翻译系统来进行复制蛋白质的表达。接下来，病毒核酸RNA被招募至对应的细胞内膜结构进行复制复合体的装配，并进行负义链RNA和正义链RNA的合成M。在体内研究体系中，侵入细胞的病毒核酸经过翻译，负义链合成以及正义链合成的数次反复循环后才能检测到病毒的累积。在上述蛋白质翻译和核酸复制的循环中的任何过程出现问题，最终结果均异致无法检测到病毒的积累。早期对烟草花叶病毒(To

6、baccomosaicvirus,TMV)研宄中，构建的TMV5’UTR碱基缺失突变体RNA无法在原生质体中进行自我复制，其结果说明5’UTR的序列对于TMV的复制重要，但无法明确该序列对于负义链合成或正义链合成屮的哪一环节起关键作用UQ1。相比体N的研究体系，无细胞体外系统在RNA病毒的蛋白质表达和核酸复制机理的研宄方面具有明显的优势，通过向体外系统中加入一种或多种外源RNA(mRNA、病毒RNA及人工RNA等)，短时间内可迅速表达对应蛋白质，非常适合于核酸以及蛋白质的互作的相关研宄。因此，无细胞体外系统可以将病毒的蛋白质表达、负义链RNA合成，以

7、及正义链RNA合成的过程的机制进行独立研允，可很好的解决上述问题。无细胞系统最早应用在动物病毒方而，通过海拉(HeLa)细胞抽提物的研宂表明：脊髓灰质炎祸毒(poliovirus)不仅可以在HeLa细胞抽捉物中进行蛋白质表达，甚至可以进行复制及形成病毒粒子［11-12］。通过HeLa细胞抽提物体外系统的研宄发现，促使核糖体脱离翻译抑制剂嘌呤霉素(Puromycin)促进了poliovirus的负义链合成，抑制核糖体的移动的翻译抑制剂cycloheximide则极大的抑制了poliovirus的负义链合成却不对正义链合成产生影响，该研光通过体外系统首次

8、揭¥了poliovirus蛋白质翻译和核酸复制之间的转换关系IM。与动物细胞相比，植物细胞中存在占据很大体积