重组yegfp发光酵母细胞检测牛尿中雌激素类药物

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1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：６１－６４ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ重组ｙＥＧＦＰ发光酵母细胞检测牛尿中雌激素类药物达剑森１，２，李湘鸣３＊，刘宗平１＊（１．扬州大学兽医学院，江苏扬州２２５００９；２．扬州市邗江区畜牧兽医站，江苏扬州２２５００２；３．扬州大学医学院，江苏扬州２２５００９）摘要：用重组人雌激素受体（ｈＥＲ）基因酵母细胞（Ｗ３０３－１Ａ／ｈＥＲ－ＥＲＥ－ｙＥＧＦＰ），分别对成年奶牛和犊牛尿样的雌激素药物残留进行检测测定。该重组酵母细胞是一种发光酵母细胞，其发光度与雌激素化合物具有剂量效应关系。结果显示，成年奶

2、牛尿样中的雌激素类化合物高于犊牛尿样，分别为１．０００×１０－４和－５雌二醇当量，但经统计分析无显著差异（Ｐ＞０．０５）。本研究所建立的方法高效、快速、高通量，２．５１８×１０可用于牛尿样中雌激素类药物残留分析。关键词：１７β－雌二醇；重组基因ｙＥＧＦＰ发光酵母细胞；牛尿中图分类号：Ｓ８５９．８４文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００６１－０４随着经济水平的不断提高，消费者对于畜产品器材有限公司产品；循环水式真空泵（ＳＨＢ－ⅢＡ），巩的质量提出了更高的要求，越来越多的儿童性早熟、义市予华仪器有限责任公司产品；超声波清洗器激素水平异常

3、现象以及由于激素而导致的各类疾病（ＫＱ－２５０Ｂ），南京国思源商贸有限公司产品；电热鼓的出现，使得人们对畜产品中激素种类与水平的关风干燥箱（ＤＧＧ－９０７０Ｂ），上海森信实验仪器有限公注日益密切。我国农业部、卫生部、国家药品监督管司产品；多功能酶标仪（Ｓｙｎｅｒｇｙｚ），美国Ｂｉｏｔｅｋ仪器理局于２００２年３月２１日联合发布公告，公布了《禁有限公司产品；干式氮吹仪（ＮＤＫ２００－２），上海皓庄止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》，其仪器有限公司产品。中有雌激素类药物己烯雌酚、雌二醇、戊酸雌二醇、１．１．２试剂雌二醇（优级纯级），美国Ｍｅｒｃｈ公苯甲酸雌

4、二醇、氯烯雌醚、炔诺醇等。由于受经济利司产品；甲醇，乙腈、ＮａＡｃ、三氯甲烷均为国药集团［１］益驱使，为促进畜禽生长，提高饲料转化率，某些化学试剂有限公司产品；无水乙醇为上海苏懿化学不法分子在畜禽养殖过程中违法使用雌激素类药物试剂有限公司产品；重组基因酵母细胞（Ｗ３０３－１Ａ／屡禁不止，并且新的同类药物不断的出现，这种危害ｈＥＲ－ＥＲＥ－ｙＥＧＦＰ），扬州大学医学院李湘鸣教授提有进一步扩大的趋势，将成为威胁动物和人类繁衍供；从扬州大学农牧场采集初生１０日龄犊牛尿液１１［２］生息的潜在危险因素之一。本研究正是利用具有份和成年牛尿样１０份，置－２０℃冷冻保存。特

5、定传感器的重组基因绿色荧光蛋白（ｙＥＧＦＰ）酵母１．２方法细胞，对４月龄怀孕母牛和犊牛尿样中雌激素类药１．２．１样品前处理用定性滤纸将尿液过滤至干物水平进行了检测，结果报道如下。净玻璃瓶中。取２ｍＬ牛尿液分别加入２０μＬ葡萄１材料与方法糖苷酶和硫酸酯酶使酶浓度为３Ｕ／ｍＬ，于３７℃水１．１材料浴过夜，进行酶解，然后加入０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ２１．１．１主要仪器设备Ｃ１８固相萃取柱（ＬＣ－ｍＬ，使其ｐＨ为４．８，准备用Ｃ１８吸附。阳性对照与Ｃ１８），德国ＣＮＷＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司产品；生化培养尿样阴性对照：随机选取犊牛尿样２ｍＬ，加入０．０５箱（Ｈ

6、ＷＳ－２５０），上海森信实验仪器有限公司产品；ｍｍｏｌ／Ｌ１７β－雌二醇（Ｅ２）４０μＬ，作为阳性对照，另恒温水浴锅（ＨＨ－Ｓ４），南京新中惠科学器材有限公取２ｍＬ加入４０μＬ无水乙醇作为尿样阴性对照，目司产品；高压灭菌锅（ＬＳ－３０），上海博迅实业有限公的是进行质量控制，确定该方法的可靠性，同时取２司产品；恒温振荡器（ＳＫＹ－２１１Ｃ），南京新中惠科学ｍＬ双蒸水作为试剂空白对照，其余操作同尿样。收稿日期：２０１４－０７－１８基金项目：江苏省扬州市科技攻关项目（ＹＺ２０１１０９２）作者简介：达剑森（１９８２－），男，江苏南通人，博士，主要从事临床兽医研究和动

7、物食品安全性评价。＊通讯作者６２动物医学进展２０１４年第３５卷第１２期（总第２５８期）１．２．２吸附与洗脱将酶解过夜尿样置于经甲醇体积（２ｍＬ），Ｖ２为测试时所取尿样的体积（２ｍＬ），［３］活化的５００ｍｇＣ１８柱进行吸附，结束后用循环水Ｖ３为加入样品洗脱液的体积（０．０１ｍＬ），Ｖ４为洗式真空泵抽气５ｍｉｎ，尽量除去Ｃ１８柱中残留的水脱液最后定容的体积。分，用乙腈洗脱Ｃ１８吸附柱２次，每次４ｍＬ，将洗脱２结果液洗收集于玻璃试管中，挥干，用乙腈定容至０．２２．１时间剂量效应ｍＬ，此溶液１ｍＬ相当于２０ｍＬ尿样。封口编号，不同浓度的Ｅ２作用于Ｗ３０３－１Ａ／ｈ

8、ＥＲ－ＥＲＥ－冷冻备用。ｙＥＧＦＰ后，４ｈ时于１０－