四环素调控的重组酵母细胞的构建及对猪尿中四环素类残留的筛检研究

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1、分类号学号Ｍ１５０８２７ＵＤＣ密级爆叫大聲ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ｜Ｊ碩士学位於文（学术型）四环素调控的重组酵母细胞的构建及对猪尿中四环素类残留的筛检研究徐秀举：李湘鸣教授，２２５００９指导教师姓名，扬州大学，江苏扬州申请学位级别：硕士学科专业名称：流行病与卫生统计学论文提交日期：２０１８年４月５日论文答辩曰期：２０１８年５月３１日学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２０１８年６月３０日答辩委员会主席：李国才教授２０１８年５月Ｉ徐秀举：四环素

2、调控的重组酵母细胞的构建芡对猪尿中四环素类残留的筛检研究四环素调控的重组酵母细胞的构建及对猪尿中四环素类残留的筛检研究摘要目的：（Ｔ）构建四环素反应元件ｅｔｒａｃｃｌｉｎｅＲｅｓｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔＴＲＥ调控的重组基因酵母细胞，ｙｐ，十快速检测动物食品中四环素类抗生素的残留。方法：－－－．３磷酸１ｉ汕醛脱氢酿，Ｇｌｃｅｒａｌｄｅｈｄｅ３１用ＰＣＲ方法从酵母ＤＮＡ提取液中扩增ＧＰＤ（ｙｙ？ＰｈｏｓｈａｔｅＤｅｈｙｄｒｏ－ｅｎａｓｅ）雄因后动子．ＹＥＳＴｒｐｇ，将Ｋ插入到酵母表达载体ｐｐ２，从而构建ＧＰＤ

3、Ａ动子驱动的酵母农达载体ＧＰＤ。ｐ２．人工合成双股Ｖ５抗说表位ＤＮＡ，将其插入ｐＧＰＤ载体；以质粒ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ为模板丨（ＴｅｔｒａｃｃｌｉｎｅＲｅｒｅｓｓｏｒＰｒｏｔｅｉｎ，ｔｅｔＲ）基因，并与ＧＰＤ载，ＰＣＲ扩增四环素阻逆蛋广ｙｐｐ体的Ｖ５抗原表位ＤＮＡ相融合，，构建成ＧＰＤ驱动的ＴＲ酵母表达载体并转化于酵母细－胞Ｗ３０３１Ａ，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法鉴定ｔｅｔＲ基因的表达。３．人工合成四环素反应元件（ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ，ＴＲＥ），将其插入ｐＭＰ２０６ａｃＺ（－半乳糖苷

4、酶基因酵母报告载体的ＣＹＣ１启动子与报告基因Ｌｐ）之间，构建成ＴＲＥａｃＴ－ＬＺ。调控的ＬＺ酵母报告载■体ｐｙｅｔｏｎａｃ（？４．以ｐＹＥＳＴｒｐ２栽体为模板，ＰＣＲ扩增ＧＡＬ１ｔ乳糖诱导型启动子蕋因）启动子，－取代ＴｅｔｏｎＬａｃＺ载体上的ＣＹＣ１（细胞色素氧化４＿１）Ａ动子，构建成ＧＡＬ１驱动ＴＲＥｐｙ调控的ＬａｃＺ酵母报告载体，并转化于可高效表达ＴＲ的酵母细胞中，对阳性克隆用四环素进彳ｆ诱导，分析其灵敏度和特异度。５．从扬州市某养猪场收集１４６例猪尿样本，以ＥＬＩＳＡ方法作为金标准，用重组酵母细，与金

5、标准方法进行比较分析研宂胞方法对其尿液中四环素类抗生素进行检测。结果：已成功转化于Ｗ－ＰＤ启动子、ｔｅｔＲ基因３０３１Ａ酵母细胞，片段大．经ＰＣＲ鉴１定发现Ｇ一ｅｒｎｂｌｏ，ｔｅＲ基因己成功在酵母细胞中表小与预期的基因片段大小致；用Ｗｅｓｔｔ方法分析ｔ达，蛋白大小为２２ＫＤ。２．经ＰＣＲ鉴定发现ＧＡＬ１驱动的ＴＲＥ调控的重组ＬａｃＺ酵母细胞构建成功；所构建的四环素调控的重组酵母细胞与四环素类抗生素有明显的剂量效应关系，而与非四环素类抗ＩｉｉＩ扬州大学碩士学ｉｉ仑文生素无剂量效应关系，说明有良好的灵敏性和特异性

6、。３．重组酵母方法与ＥＬＩＳＡ方法比较发现，两种方法测定的阳性率有统计学差异２－６＝（＝２２．５６８８＞＜＜．．乂，户丨．１丨〇〇〇１）。经１１〇（：曲线分析，发现重组酵母方法的灵敏度为７６３６％，但是，其特异度和符合率不高，分别为４３．９６％和５６．１６％；约登指数为０．２０３，阳性似然比＋（－（ＬＲ）为１３６３，ＬＲ）为０．５３８，阳性预测值为４５．１６％，阴性预测值为７．４７％；．阴性似然比５重组酵母方法与ＥＬＩＳＡ法均可发现混合四环类抗也素之间的联合效应，但是，重组酵母对四环类抗生素混合物联合作用相对较敏感。结论：

7、－－－所构建的重组酵母细胞３０３－１Ａ／ＴＲＧＡＬ１ＴｅｔＬＺ）对四环类抗生素混合物联（Ｗｏｎａｃ一合效应较敏感，对家畜尿液中四环类抗生素残留有定程度的快速筛检作用，但是，其特一异度和灵敏度还需进步研究提高。关键词：重组酵母细胞四环素类抗生素ＥＬＩＳＡ检测食品安全徐秀举１Ｕ：四环素调控的重组酵母细胞的构建及对猪尿中四环素类残留的筛俭研究Ｔｈｅｓｔｕｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅａｓｔｃｅｌｌｓｙｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅａｎｄｔｈｅ

8、ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｉｕｒｉｎｅｐｇＡＢＳ