重组lac z酵母细胞构建及对化学诱变原的高通量筛选研究

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4、手段之。，ｍｅｓ试验、目前，人们己经提出多种对致突变化学诱变原毒性评价的试验方法如Ａ一微核和染色体试验等。随着科学技术的发展，些常规的评价检测方法的缺点逐渐突显出来：，耗时较长敏感度低，操作繁琐化及成本过高等方面成为了影响对化学诱变原毒性评价的因素。本课题利用生物传感器技术，与其中的微生物传感器技术相结合，用重沮的酵，用ＬａｃＺ巧细胞作为宿主细胞作用为报告基因，利用经化学诱巧原作用后表达产物可催一。化底物显色这特性，特性作为信号转换的标识，评价致突变化学物的毒性作用强度化学诱变物主要分为两类：直接化学诱变物和间

5、接化学诱变物，前者对ＤＮＡ具有直接损伤作用，后者自身对ＤＮＡ无损伤作用，但其进入机体内可经某些反应转化为具有基因毒性作巧的物质。本课题利用构建重组酵母细胞分别对直接和间接化学诱变物进行高通量筛选研究。３－－１產组薛母细胞Ｗ３０１Ａ／ＲＮＲ３ＬａｃＺ的构建及对直接诱变物的筛选目的：建立由ＲＮＲ３调控重组ＺｏｃＺ基因酵母细胞Ｗ筛选直接化学诱变物。方法：利用ＰＣＲ方法从酵母基因组中扩増ＲＮＲ３后动子，将其插入到ＰＭＰ２０６／ＥＲＥ酵母报告载体，３ａｃ－３构建成砂瓜调控的ＬＺ酵母报告载体，将该载体转入Ｗ３０３１Ａ

6、酵母细胞，构建成ＲＮＲ调控的重沮Ｚｏｃ２基因酵母细胞。用数种化学诱变原作用于该重组基因薛母细胞，观察其对ＲＮＲ３的诱导表达，用Ｅｘｃｅｌ软件进行分析。结果：放线菌素Ｄ、丝裂霉素Ｃ、阿非迪－－４－Ｎ、霉素和漠乙锭不能诱导ＲＮＲ３的表达，而甲横酸甲脂、瘤可宁、顺钻、硝基氧化哇肺２扬州大学硕主学位论义－ＲＮＲ３表达有明显的剂量效博来霉素、福来霉素、５氣尿瞎巧、喜树碱和哲基腺诱变原与。应关系。结论：该重组酵母可用于对多种化学诱变原的快速筛选－－ＣＹＰ１Ａ１的构２．重组薛母细胞Ｗ３０３１Ａ／ＲＮＲ３丄ａｃＺ／ＧＰＤＶ５建

7、及对间接诱变物的筛选目的：建立由防化３调控重组心ｃＺ基因及可表达ＣＹＰ１Ａ１基因的重组酵母细胞Ｗ筛选间接化学诱变物。方法：利用ＰＣＲ方法从ＧＶ１４２质粒上扩增ＣＹＰ１Ａ１基因，将其插入ＤＶ－到ｐＧＰＳ酵母表达载体上，构建成Ｐ徘ＤＶ５ＣＹＰ１Ａ１酵母表达载体，将该载体转入所建－－组酵母细胞Ｃ立的Ｗ３０３１Ａ／ＲＮＲ３ＬａｃＺ重，构建成可表达ＣＹＰ１Ａ１及受ＲＮＲ３调拴的心－Ｚ基因酵母细胞。用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的试剂盒检测ＣＹＰ１Ａ１表达，并用间接诱变原２氨基巧ＲＮＲ３的诱导表达，用Ｅｘｃｅｌ软件进行分析。结果；

8、作用于该重组基因酵母细胞，观察其对ＧＰＤＶ５－ＣＹＰＤＮＡ测序表明Ｐ１Ａ１酵母表达载体构建成化并经ＰＣ民鉴定己经成功重组于－酵母细胞１Ａ１活性较低，细胞经２，与ＬａｃＺ表