重组DNA的构建、筛选及鉴定分析

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1、第十章重组DNA的构建、筛选及鉴定分析1.重组DNA导入宿主细胞2.重组子的筛选3.阳性重组子的验证与分析一目的基因的获取5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’锚定引物逆转录5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’变性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延长dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AA

2、AAAAAAAAA3’变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上mRNA差别显示技术在寻找新基因工作中起到积极的作用发育机理研究杂种优势机理研究二重组DNA的构建重组DNA的概念将目的基因（外源DNA分子）用DNA连接酶在体外连接到适当的载体上，即DNA分子的体外重组，这种重新组合的DNA称为重组DNA重组DNA的构建方法1．平末端分子的连接①连接效率还是很低；②连接常常破坏原有的限制性核酸内切酶识别序列，可能改变原

3、有DNA的读码顺序；③由于平末端分子两个末端都是平的，因而在连接反应中外源DNA分子在载体中的插人方向有正反两种可能，增加了假阳性；④由于都是平末端分子，可能出现多个平末端分子串联后再插人到载体中的多片段“叠连”现象，增加了假阳性的概率人工改造实现平末端分子转化为粘性末端分子2粘性末端分子的连接相同的粘性末端，在进行连接时，这两个DNA片段在DNA连接酶作用下就可以共价地连接起来，形成重组DNA三重组DNA分子导入受体菌转化是感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达DNA分子的基因转化方法转导是指通过噬菌体将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基

4、因重组现象显微注射技术是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注人细胞质或细胞核的基因转化方法电转化法也称为电穿孔法在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，结果在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者在膜孔自行修复闭合时伴随膜组分的重新分布而进人细胞质中基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带人细胞进行表达的基因转化方法。宿主细胞原核生物细胞大肠杆菌枯草杆菌真菌细胞酵母菌细胞植物细胞动物细胞转化的目的一是大量产生重组DNA在完成连接反应后，重组DN

5、A往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析二是对重组DNA进行纯化。在构建重组DNA过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子第二节重组子的筛选一、遗传表型筛选法遗传表型筛选法利用抗药性基因的筛选方法b一半乳糖昔酶显色互补筛利用抗药性基因的筛选方法抗性标记直接筛选法载体DNA上携带有宿主细胞敏感的抗生素的抗性基因，pBR322质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四环素抗性基因抗性基因插入失活筛选法当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插人外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌

6、并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状况便可筛选出阳性重组子质粒载体抗性标记筛选利用抗药性基因的筛选方法b一半乳糖苷酶显色互补筛选蓝-白筛选β-半乳糖苷酶可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下β-半乳糖苷酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝营养缺陷互补营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素(氨基酸，维生素，核酸等)的功能，若在培养基上培养必须添加相

7、应的营养素才能生长如果外源基因能够实现其功能的表达,重组DNA转化到大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即可作为重组子筛选的标记当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转人缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子二、快速裂解菌落鉴定重组DNA分子DNA分子由于外源目的基因片段插人到质粒载体上，所以重组质粒的相对分子量一定比非重组质粒要大核酸分子杂交检测法其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在一定的复性条件下，可

8、按碱基互补原则退火形成双链分子杂交方法可分为固相液相杂交、液相分子杂交和原位杂交固相液相杂交，亦称膜上印迹杂交提取重物重组