紫花苜蓿叶蛋白正交提取工艺模式的研究

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1、牧草2014·11/12SPECIALISSUEFORFORAGE专辑紫花苜蓿叶蛋白正交提取工艺模式的研究李锦锋，李庆龙，铁云华，王文（云南省种羊繁育推广中心，寻甸 655204）中图分类号：S823.4文献标识码：A文章编号：1004-4264（2014）11/12-0025-03摘要：为优选紫花苜蓿叶蛋白的提取工艺条件，对不同品系的苜蓿叶蛋白进行差异性分析，本试验利用单3因素极差分析，以280nm紫外光测测定并计算提取率，L9(3)正交试验设计确定最佳提取工艺。结果表明，通过单因素试验确定的各因素影响能力大小为：pH>浸泡时间>料液比>温

2、度，正交试验最佳组合为A2B1C1。结果中三得利（兰州）对照和MA-7中叶蛋白的含量相对较高，分别为21.91%和19.42%。关键字：紫花苜蓿；叶蛋白；正交设计紫花苜蓿(Medicago.sativa.L.)又名苜蓿、紫苜蓿，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸铵、牛血清白蛋素有“牧草之王”的美称。紫花苜蓿在我国已有两千多白，其余试剂均为国产或进口分析纯。年的栽培历史，全国各地均有种植，但主要分布在西北1.2方法[1]和华北地区。苜蓿的营养价值很高，其粗蛋白含量通1.2.1.标准溶液配制及曲线绘制[2]常在22%左右，含有20种以上的氨基酸。本试验

3、对紫准确称取25mg牛血清白蛋白，用无离子水定容至[3]花苜蓿中叶蛋白进行正交提取工艺设计，优选出最佳提25mL，配制成1mg/mL的溶液。另取12支试管，配取方案，为今后我国紫花苜蓿的研究提供一些借鉴。制标准溶液梯度为0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL，平行做两1材料与方法份。于280nm下测吸光值，以牛血清白蛋白的含量为横坐1.1材料标，OD280nm值为纵坐标，作出牛血清白蛋白标准曲线，21.1.1.药材得其回归方程为：Y=0.3109X－0.0071，

4、R=0.9984。不同品系紫花苜蓿（采自天水市国家级高新农业园1.2.2.单因素试验区神州绿鹏航天育种基地）。通过查阅资料和单因素预试验，初步拟选出影响苜1.1.2.仪器蓿叶蛋白提取率的主要因素有：pH、温度、料液比、[4]UV-9200型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器浸泡时间，然后进行以下试验。公司）、PHS-3D型精密PH计（上海精密科学仪器有限称取5份样品，每份2g，加入石英砂研磨，按料液公司）、TDZ5-W型多管架自动平衡离心机（湘仪离心比1∶7分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓[5]机仪器有限公司）、TG1

5、6-W型微量高速离心机（湘仪冲液，浸泡40min。40min后，在多管架自动平衡离离心机仪器有限公司）、AUY220型电子天平、电热恒心机4.000r/min离心10min，取上清液于两个5mL离心温水浴锅、漩涡混合器等。管中，在微量高速离心机中12.000r/min离心5min。将1.1.3.试剂.上清液转入另两个离心管中，按照硫酸铵饱合度50%、60%、70%、80%分级分离苜蓿叶蛋白，将每次所得收稿日期：2014-05-10作者介绍：李锦锋（1964.-），男，云南临沧人，兽医师，研究方向为蛋白再溶解，总共体积为4mL，装入同一离心管中

6、，畜牧生产与管理。吸取0.4mL加入新的离心管中，再加入3.6mL的pH值25牧草2014·11/12专辑SPECIALISSUEFORFORAGE7.0的缓冲液。经测定OD280后固定pH，再依次选取15、表2温度对提取效果的影响20、25、30、35℃恒温水浴加热，1∶4、1∶7、1∶10、温度（℃）1520253035OD280—0.5490.5760.4320.5121∶13、1∶16.mL/g料液比，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h浸提取率（%）—12.5213.139.6811.69由表2可知，温度对提取率的影响不显著，在

7、30℃泡时间，逐次选取一个单因素后再固定，直至选取结束。时提取率最低，所以一般选择室温即可，而且加热将耗1.2.3.不同品系紫花苜蓿叶蛋白的提取费大量的电能，增加成本。因此不选择加热或保温，一按照单因素和正交设计所确定的工艺来提取紫花苜般在室温下进行。蓿叶蛋白。在待测的40个样品中，选择长势较好的26个2.2.3.料液比对苜蓿叶蛋白提取率的影响样品，清洗后晾干，准确称取2.00g，研磨，装入写有表3液料比对提取效果的影响标签的50mL离心管，按料液比1:7加入pH值5.0的缓冲液料比（mL/g）1:41:71：101:131:16液14mL，

8、浸泡2h。平衡后，在多管架自动平衡离心机OD2800.6710.6670.4240.2860.2244.000r/min离心10min，取上清液于两个5mL离心管中