濒危药用植物盘龙参rdnaits序列分析

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1、—30—江苏农业科学2014年第42卷第5期李家敏，周秀玲，姜琼．濒危药用植物盘龙参rDNAITS序列分析［J］．江苏农业科学，2014，42(5):30－33．濒危药用植物盘龙参rDNAITS序列分析李家敏，周秀玲，姜琼(宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春336000)摘要:采用改良CTAB法提取2份江西省盘龙参总DNA，利用通用引物对rDNAITS序列进行PCＲ扩增，克隆后测序，应用MEGA5．2软件进行序列分析和构建系统发育树，以研究盘龙参ITS片段遗传多样性，分析该片段在盘龙参DNA分子鉴别和绶草属植物

2、系统学研究中的意义。结果表明，盘龙参样本的rDNAITS长度为766～767bp;该样本与GenBank中绶草属的rDNAITS对比分析，ITS1、ITS2长度分别为214～245、256～367bp，变异位点分别为16．17%、3.50%，ITS总变异位点为9．27%;基于ITS序列，用p－distances法计算遗传距离和NJ法建立系统发育树，2段序列在绶草属种内保守，中间有较大变异，可作为盘龙参分子鉴定标记，而绶草属的系统发生关系尚须进一步研究。关键词:绶草属;盘龙参;ITS序列;遗传多态性;药用植物中图分

3、类号:S567．230．1文献标志码:A文章编号:1002－1302(2014)05－0030－04盘龙参为兰科绶草属植物绶草［Spiranthessinensis1材料与方法(Pers．)Ames］的根或全草，为多年生草本植物，以全草入药，味甘，性温，入肺、肝、肾三经，具有滋阴益气、凉血解毒、润肺1．1材料［1］止咳的功效，主要含有二氢菲类、黄酮类、苯丙素类、甾醇1．1．1试验材料2013年3月，于江西宜春和赣州2个不类、三萜类和脂肪酸等多种化学成分，属于名贵药材，具有较同生态群采集样本，经课题组周秀玲副教授鉴

4、别为兰科绶草高的药用价值。Peng等在盘龙参根中发现一种新的二氢黄属植物盘龙参，样本凭证保存于江西省天然药物活性成分研酮，对肺癌细胞A549、肝癌细胞BEL27402、食管癌细胞究重点实验室。来源于Genbank的绶草属rDNAITS序列相HT－29、乳腺癌细胞MCF－7、胃癌细胞SGC－7901、白血病关信息见表1。［2］细胞K562和肾癌细胞A498等多种癌细胞具有一定毒性。表1来源于GenBank的绶草属rDNAITS序列盘龙参现为国家二级保护植物，已列入《濒危野生动植登录号物种来源地发布者［3］物种国际贸

5、易公约》，为国际濒危植物。董必慧等对江苏AJ539489Spiranthescernua美国Salazar沿海滩涂湿地的盘龙参资源进行调查，并提出有关盘龙参资AF301443Spiranthesdiluvialis美国Szalanski［4］。笔者在江西宜春和赣州调查时发现野生HE575517Spiranthesnebulorum美国Szalanski源保护的策略AF301441Spiranthesromanzoffiana美国Szalanski种盘龙参零星分布，对其采样进行驯化，在种植过程中发现盘HE57551

6、8Spiranthessinensis美国Szalanski龙参种子萌发率低，长势弱，成活极少，且植株结实不饱满，明AY364888Spiranthesspiralis西班牙Bernardos显不如野外生长旺盛。对采样进行回访，采样点的盘龙参数AB740173Spiranthessinensisvar．amoena日本Ohga量变少或不见踪迹，这对盘龙参的遗传多样性研究造成困难。AB740174Spiranthessinensisvar．amoena日本Ohga物种的濒危与其遗传结构和遗传多样性有关，遗传多样AB

7、740175Spiranthessinensisvar．sinensis日本OhgaAB740176Spiranthessinensisvar．sinensis日本Ohga性的高低是物种生存能力的具体体现。目前，在研究遗传结构方面常采用DNA分子标记技术，rDNAITS序列分析技术1．1．2主要仪器超低温冰箱(7010702，Thermo);水浴锅是其中之一。rDNAITS序列是核糖体内转录间隔区，位于(HH－4);离心机(Eppendorf－G5415Ｒ，德国);XP基因扩增18S和26SrDNA基因之间，包括

8、了ITS1－5．8SrDNA－ITS2仪(BYQ602101－174，杭州博日);双稳定时电泳仪(DYY－区段，具有较好的保守性。本研究首次通过rDNAITS序列的6C，北京六一);紫外分光光度计(UV－2000);凝胶成像系统遗传分析为盘龙参种间鉴定和种内遗传多样性提供生物学理(GelMediaSystem，北京创美伟业)。论依据，并根据序列碱基差异、G+C含量差异和片