家蚕细胞自噬相关蛋白bmatg8的多克隆抗体制备与组织表达分析

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1、ScienceofSericulture蚕业科学2014，40(5):0818－0823ISSN0257－4799;CN32－1115/SE-mail:CYKE@chinajournal．net．cn家蚕细胞自噬相关蛋白BmATG8的多克隆抗体制备与组织表达分析1112111杨晓冰李洪建吴永鹏刘庆洪张敏娟钱永华焦锋12(西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所，陕西杨凌712100;中国农业大学生物学院，北京100193)摘要自噬是细胞固有的一种降解机制，在生物体的生长、发育以及感染免疫、衰老、死亡等过程中发

2、挥重要作用。进行家蚕细胞自噬相关蛋白基因的克隆和重组蛋白表达，分析细胞自噬相关蛋白在5龄幼虫不同组织的表达水平和同一组织中随5龄发育时间的表达变化，有助于从分子水平了解家蚕细胞自噬的功能。根据GenBank登录的家蚕细胞自噬相关蛋白基因Atg8(BmAtg8)的序列设计引物，以家蚕5龄幼虫中肠cDNA为模板克隆了BmAtg8的354bp编码区序列，并成功将其连入pET32a(+)质粒中。将重组质粒转化E.coliＲosseta菌株继而诱导表达重组BmATG8蛋白，将该蛋白质纯化后强化免疫新西兰大白兔

3、3次，获得效价达1∶512000的多克隆抗血清。以此多克隆抗体杂交家蚕组织总蛋白，检测到BmATG8及其与磷脂酰乙醇胺偶联的BmATG8-PE2条免疫印迹条带。Western杂交表明BmATG8蛋白在家蚕5龄第2天幼虫丝腺、中肠和脂肪体中的表达水平较高，其中在5龄第1～2天和第7～8天丝腺组织的表达水平较高，说明家蚕5龄幼虫这3个组织尤其是这2个时间段的丝腺组织中细胞自噬活性极高，反映出家蚕变态发育前这些组织器官细胞内的代谢活动旺盛。关键词家蚕;细胞自噬;BmATG8蛋白;多克隆抗体;组织表达中图分

4、类号S881.2;Q786文献标识码A文章编号0257－4799(2014)05－0818－06DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2014.05.009PreparationofPolyclonalAntibodyandTissueExpressionAnalysisofBmATG8inSilkworm(Bombyxmori)11121YANGXiao-BingLIHong-JianWUYong-PengLIUQing-HongZHANGMin-Juan1*1*QIANYong-Hu

5、aJIAOFeng12(InstituteofSericultureandSilk，NorthwestA＆FUniversity，YanglingShaanxi712100，China;CollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)AbstractAsaninherentdegradationmechanismofcell，autophagyplayscrucialrolesintheproce

6、ssesofgrowth，devel-opment，immune，senescenceanddeathoforganisms．Ｒesearcheffortsmadetoclonesilkworm(Bombyxmori)autoph-agyassociatedproteingenes，toexpresstherecombinantproteins，andtoanalyzeexpressionalvariationsofautophagyassociatedproteinindifferentlarva

7、ltissuesanddifferentdevelopmentalstageswouldhelpunderstandthefunctionsofsilk-wormcellautophagyatmolecularlevel．Inthisexperiment，primersweredesignedaccordingtosilkwormautophagyrelat-edgeneAtg8(BmAtg8)registeredinGenBank，anda收稿日期:2014－04－22接受日期:2014－05－2

8、4354bpcodingregionofsilkwormautophagyrelatedgene资助项目:现代农业产业技术体系建设专项(No．CAＲS-35)，公益性BmAtg8wasamplifiedusingcDNAofmidgutfromthe5thin-行业(农业)专项(No．201303057)，西北农林科技大学基本科研业务费专项(No．ZD2012008，XNY2013-27)。starsilkwormlarvaeastemplateandsubseque