家蚕自噬相关蛋白bmatg8结构的研究和保幼激素环氧水解酶初步晶体学的研究

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1、中国科学技术大学硕士学位论文家蚕自噬相关蛋白BmAtg8的结构研究和保幼激素环氧水解酶的初步晶体学研究姓名：胡晨申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：周丛照20100501摘要1．家蚕自噬相关蛋白At98结构与功能的研究自噬是真核生物中一种广泛存在的代谢过程，饥饿和发育等信号可以开启自噬通路，促进细胞内的单层膜融合形成自噬小体，吞噬需要被代谢的细胞器以及细胞质，自噬小体而后与溶酶体融合，被其吞噬的物质就会被释放到溶酶体内被水解酶消化并供细胞再次利用。家蚕Bombyxmori是一种重要的农业经济生物以及昆虫模式生物，自噬在家蚕的变态发育中起着重要的作用。自噬中有两

2、个重要的类泛素化结合系统，分别是At98呻E系统和Atgl2-At95-At916系统。At98-PE系统中，半胱氨酸蛋白酶At94作用于细胞内新生的At98，切除了At98的C一末端残基Arg，暴露出保守的Gly残基，而后At98G被类El蛋白酶At97和类E2蛋白酶At93的作用下，与PE之间形成共价键，据研究发现，此系统在自噬小体的形成中有重要的作用，控制了自噬小体前体的扩张并且决定了自噬小体的大小。对比不同种属的At98，发现At98在真核生物中是结构保守的，暗示了At98在真核生物的自噬中起到了关键的作用，为了进一步了解At98系统在家蚕自噬中的作用方式，本文构建了B

3、mAt98-pET28a表达质粒，利用原核表达系统表达了重组蛋白并进行了纯化，解析了BmAt98的晶体，分辨率为2．40A，空间群为P41，晶胞参数为a=96．77，b=96．77，c=44．3l，a=D=丫=900。BmAt98的整体结构包含4条D折叠片(p卜134strands)，在其两侧分别有2对0【螺旋结构(a1一Q2和0【3一a4helices)。2．保幼激素环氧水解酶的初步晶体学研究保幼激素(juvenilehormone，JH)是一种重要的昆虫激素，在昆虫的幼虫生长，蛹期变态，成虫生殖等生长和发育过程中发挥了非常重要的作用。在鳞翅目昆虫的幼虫期，JH维持着幼虫的性

4、状，阻止蜕皮激素(ecdysteroids，Ecd)起始变态。保幼激素环氧水解酶(JHEH)是家蚕保幼激素代谢中的一个重要酶，它将保幼激素代谢为保幼激素二醇。研究保幼激素环氧水解酶的结构与功能，有助于进一步理解昆虫激素代谢和昆虫生长发育的调控机制。本文纯化了家蚕的JHEH蛋白，并对蛋白进行甲基化修饰，利用悬滴气相扩散法优化JHEH的晶体，但是衍射能力暂不能达到X～Ray的衍射要求。目前，仍在对蛋白纯化和晶体生长条件进行优化，以得到衍射能力高的晶体。关键词：家蚕；自噬：At98；保幼激素；环氧水解酶；X～Ray衍射：晶体结构。AbstractABSTRACT1·Structura

5、lanalysisofBombyxraoriAt98Autophagyisubiquitousinalltheeukaryotes．SignalssuchaShungryanddevelopmentcallstartautophagy,andpromotetheformationofautophagysome．Autophagosomedocksandfuseswiththelysosome，thentheinnercontentoftheautophagosomeareliberatedinsidethelysosome，consumedbyhydrolasesandreus

6、edbythecell．SilkwormBombyxmoriisallimportantorganismbothforeconomyandacademicresearch．Autophagyisimportantinthedevelopmentofsilkworm．Therearetwoimportantubiquitinlikesystemsintheautophagy(At98一PEsystemandAtgl2一At95一At916system)．IntheAt98一PEsystem，theC—terminalarginineofnewlysynthesizedAt98is

7、removedbyacysteineproteaseAt94，exposuringaglycineresidueattheC—terminus．AndthenAt97andAt93whichareEl-likeandE2一likeenzymesmakeat98utobeactivatedandconjugatedtophosphatidyrlethanolamine(PE)byacovalentbond．TheAt98一PEsystemcontrolstheexpansionofautoph