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1、学号00811047内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程大实验开题报告论文题目：纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名：燕孟娇年级：2008专业：生物技术指导教师：苏慧敏2011年8月7日张婷1990年8学生姓名民族汉性别女出生年月月论文题目纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间2011年8月1日结题时间2011年8月7日项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据“纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌
2、蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilislnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶(NarroKunase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，并可由肠道，吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。纳豆激酶的物理、生化特点：1)纳豆激酶是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilislnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶（单链多肽酶），分子
3、量为27728道尔顿。2)纳豆激酶在温度超过50℃时迅速变性失活，但反复冻融对其影响不大。3)纳豆激酶在PH值从7升至12时，10min内稳定；PH值低于5时，迅速变性失活。胃酸环境中的PH值只有1.2到2之间，纳豆激酶根本无法通过。4)纳豆激酶与粘性物质混合后，在PH值2-3的酸性环境中，还能保持不超过7.5%的活性。5)纳豆激酶是大分子的单链多肽酶，可被肠道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小肠液等）分解成氨基酸片段或分子量更小的肽链。同其它生物活性物质一样，纳豆激酶的分秘表达受多种因素的影响。纳豆激酶基因在体外转录有两个启动位点，之间被15个核苷酸隔开；体内转录也在这两个位点或其附近。下游
4、位点(P：)具有一个独特的d”识别序列。Moran等人对该基因的d”启动子和其它两种枯草芽孢杆菌的d”启动子做了比较，比较了它们的保守碱基序列，在一35区．P：启动子的共有序列为5个碱基；在一10区共有序列为8个碱基．两区之间被15个碱基隔开。另外两个碱基区可能调节该基因的表达．一个是在启动子上游35bp处的二分体对称区，另外就是mRNA上核糖体结台位点，mRNA上核糖体结台位点序列为：pppAA．A—A—G一00A_000U。此外．在纳豆激酶基因的105-336bp处编码了一段有77个氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能参与调节纳豆激酶的活性。纳豆激酶的表达同其它枯草杆菌蛋白酶
5、一样受葡萄糖阻遏和被许多SpoO孢子形1成突变株阻断，另外CatA、hpr、Scoe突变株位点可以提高其表达。参考文献[1]谢秋玲,孙奋勇,廖美德,张玲,汪炬.纳豆激酶原基因的克隆及表达[J]华南理工大学学报(自然科学版),2002,(06).[2]朱立成,张耀洲.纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备[J]浙江大学学报(理学版),2006,(04).[3]Hong-BoHu,Shan-JingYao,Le-HeMei,Zi-QiangZhu,Byung-KiHur.PartialpurificationofnattokinasefromBacillussubtilisbyexpanded
6、bedadsorption[J]BiotechnologyLetters,2000,22,(17).[4]付利，杨志兴.纳豆激酶的研究与应用[J],生物工程进展.1995,15(15):46-49.[5]陈丽娟,沙长青,任永春等.纳豆激酶溶解血栓机制[J],中国生物工程杂志,2003,23(4):53-56.[6]丁贵平,蔡正森,王正刚.纳豆激酶的分离纯化及生化研究[J],氨基酸和生物资源,2001,23(3):13-16.[7]闫达中，许芳，李洁.纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究[J],湖北大学学报（自然科学版）,2003,25(1):69-72.[8]NaKamuraT,Y
7、amagataY,IchishimaEJ.NucleotidesequenceofthesubtilisinNATgene,aprNofBacillusSubtilis(natto)[J].BiosciBiotechBiochem,1992,56(11):1869-1871.2二、实验方案1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：1.1实验内容：①、PCR扩增NK。②、将NKPCR产物与克隆载体pMD19-T连接成过渡质
