纳豆激酶热稳定性的突变及其在基因工程菌中的表达

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1、分类号：单位代码：１０１４０密级：公开学号５３５６：４０３１１８，－（￡￥每ＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＦＯＲＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ纳豆激酶热稳定性的突变定性的突变及其在基因工程菌中的表达Ｉｍｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｆｂｒｉｎｏｌｔｉｃａｃｔｉｖｉｔａｎｄｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｏｆｔｈｅｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅｂｐｉｙｙｙｙ－ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｅｎｅｓｉｓｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｅｎｅｔｉｃａｌｌｅｎｉｎｅｅｒｅｄｂａｃｔｅｒｉａ

2、ａｓｅｂｙｇｐｇｙｇ论文作者：蒙新睿指导教师：刘宏生教授专业：微生物学完成时间二○一八年四月：辽宁大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注的内容外，不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中进行了标注，并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名以年ｔ月Ｖ日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学

3、位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权辽宁大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国博士学位论文全文数据库》和《中国优秀硕士学位论文全文数据库》并通过网络向，社会公众提供信息服务。学校须按照授权对学位论文进行管理，不得超越授权对学位论文进行任意处理。保密（），在年后解密适用本授权书。（保密：请在括“”号内划Ｖ）

4、授权人签名：指导教师签名：日期：年铲月０日日期：工叫９年穸月日ｙ申请辽宁大学硕士学位论文纳豆激酶热稳定性的突变及其在基因工程菌中的表达Improvementoffibrinolyticactivityandthermostabilityofthesubtilisinnattokinasebysite-directedmutagenesisexpressedingeneticallyengineeredbacteria作者：蒙新睿指导教师：刘宏生教授专业：微生物学答辩日期：2018年5月23日二○一八年五月·中国辽宁摘要摘要在发酵纳豆类食物的过程中，纳豆发

5、酵菌能够生产出一种碱性丝氨酸蛋白酶，即纳豆激酶（Nattokinase，NK）。纳豆激酶能够有效的溶解纤维蛋白(人体内血栓的主要成分)，其作为一种新型溶栓类药物或者保健食品，与同类尿激酶等产品相比具有着生产原料价格低廉、安全性高等优势，具有广阔的市场前景。在纳豆激酶工业生产过程中，由于蛋白质分子的结构的破坏会出现热损耗高、酶活性低等现象。通过分子生物学手段，对纳豆激酶进行改造以提高其热稳定性和酶活性，以获得适应纳豆激酶大规模工业化生产的基因工程菌。本实验选择使用pET-26b原核表达载体，分别构建了含有纳豆激酶成熟肽、前导肽+成熟肽的原核表达载体，并将其转化到大肠杆

6、菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声破碎菌体，SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示，纳豆激酶成熟肽及前导肽+成熟肽在大肠杆菌中均可成功表达；成熟肽表达的上清液和沉淀，均未表现出纤溶活性；前导肽+成熟肽表达的上清液表现出纤溶活性，而沉淀未表现出纤溶活性。通过文献阅读和生物信息学预测，筛选出166位甘氨酸，xxx(具体位点涉及保密内容，暂不公布)位丝氨酸可能对纳豆激酶热稳定性产生影响。利用重叠延伸PCR技术将166位甘氨酸突变为精氨酸、xxx位丝氨酸突变为脯氨酸。分别构建了原核表达载体pET-26b-NKt166、

7、pET-26b-NKtxxx，并转入大肠杆菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声破碎菌体，SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示，NKt166和NKtxxx在大肠杆菌中均可成功表达；NKt166表达的上清液和沉淀，均未表现出纤溶活性；NKtxxx表达的上清液表现出纤溶活性，而沉淀未表现出纤溶活性。经过不同温度处理后，同野生型相比，NKtxxx的热损失率降低了15.23%，而且其完全失活温度从63℃提高至65℃；同时，其纤溶活性提高了18.10%。本实验选用高效毕赤酵母表达载体pGAPZα-a，构建了含有纳豆激酶