3种死菌悬液制备方法对pma_qpcr结果的影响

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1、中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期生物技术·１５·３种死菌悬液制备方法对ＰＭＡ－ｑＰＣＲ结果的影响王慧党１，温书香１，王慧勤２，曹旭东３，陈创夫１（１．石河子大学动物科学学院，新疆石河子８３２００３；２．石河子大学生命科学学院，新疆石河子８３２００３；３．石河子大学医学院，新疆石河子８３２００３）摘要：本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法３种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法，比较不同灭菌方法制备的死菌对ＰＭＡ－ｑＰＣＲ偶联技术结果的影响，选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌；探索ＰＭＡ－ｑＰＣＲ偶联技术的适用范围和局限性。结

2、果表明，热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆菌死菌悬液影响ＰＭＡ－ｑＰＣＲ检测的Ｃｔ值的变化；紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对ＰＭＡ－ｑＰＣＲ检测的Ｃｔ值没有影响；热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法；ＰＭＡ－ｑＰＣＲ偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的检测。关键词：ＰＭＡ－ｑＰＣＲ偶联技术；热灭活；超声；紫外线照射中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００１５－０５ＰＭＡ是一种叠氮类核酸染料，它对ＤＮＡ分子Ｇｕ等，２００７），而该惰性物质并不影响后续ＰＣＲ的具有高度亲和力，在６５０Ｗ卤素灯照射条件下扩增。在细胞

3、膜受损的条件下ＰＭＡ能穿透细胞膜ＰＭＡ与ＤＮＡ分子共价交联，交联产物不能作为并与ＤＮＡ分子结合，在曝光条件下与ＤＮＡ分子共ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增。ＰＭＡ不能穿透具有完价交联从而抑制ＤＮＡ分子扩增。ｑＰＣＲ技术是近整细胞膜的细胞，因此被阻隔在细胞膜外，在光照条几年来新兴起的一门用于ＰＣＲ初始模板量定量检件下形成没有活性的惰性物质（Ｎｏｃｋｅｒ等，２００６；测的技术，研究表明其检测的灵敏度达２５ＣＦＵ／ｍＬ。ＰＭＡ与ｑＰＣＲ结合技术能选择性检收稿日期：２０１４－０６－３０测活菌（Ｓｈａｐｉｒｏ，２００１；蒋志国等，２００８），并被广泛作者简介：王慧党（１９８７－），女，河南人，硕士

4、生，研究方向：畜禽应用于食源性病原菌和其他病原菌中活菌的检测。病原分子生物学。通信作者：陈创夫。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｃｆ－ｘｂ＠１６３．ｃｏｍＰＭＡ－ｑＰＣＲ偶联技术虽能从所得样品中选择性检基金项目：国家科技重大专项（２０１３ＺＸ１０００３００３－００２）。测“活菌”，但这里所说的“活菌”是指具有完整细胞櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒ

5、ｙｏｆＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｇｎｏｆＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；３．ＪｉａｎｇｓｕＪｉｎｇｈａｉＰｏｕｌｔｒｙＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎａｎｔｏｎｇ２２６１０３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＧｎＲＨＲｇｅｎｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｏｎｌｉｎｅｔｏｏｌｓＣＵＳＰ，ＣＨＩＰＳａｎｄＣｏｄｏｎ

6、ＷｓｏｆｔｗａｒｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｄｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＧｎＲＨＲｇｅｎｅ．Ｇｎ－ＲＨＲｇｅｎｅｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｏｔｈｅｒｇｅｎｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎ，ｍｏｄｅｌａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅｓａｎｄＧｎＲＨＲｇｅｎｅｏｆｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＮｃｖａｌｕｅｏｆＧｎＲＨＲｇｅｎｅｉｎＪｉｎｇｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎｗａｓｓｍａｌｌ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｔｒｏｎｇｃｏｄｏｎｂｉａｓ．ＧｎＲＨＲｇｅｎｅｗａｓｂｉａｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｃｏｄｏｎｓｗｉｔ

7、ｈＧａｎｄＣａｔｔｈｅｔｈｉｒｄｃｏｄｏｎｐｏｓｉｔｉｏｎ．ＧＣｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎＡＴｃｏｎｔｅｎｔｉｎＣＤＳｒｅｇｉｏｎｏｆＧｎＲＨＲｇｅｎｅ．ＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＣｏｄｏｎＷｓｏｆｔｗａｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｎｃｏｄｏｎｓｏｆＧｎＲＨＲｇｅｎｅｉｎＪｉｎｇｈａｉＹｅｌｌｏｗｃｈｉｃｋｅｎ，ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＡＧＣ，ＴＣＣａｎｄＧＴＧｗｅｒｅｏｆｓｔｒｏｎｇｂｉａｓａｎｄｅｎｄｗｉｔｈＧ／Ｃ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１２ｂｉａ