胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究

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1、胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究作者：张召辉李玺夏安周路逵阳陈复兴【关键词】胰腺摘要：目的：寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。方法：以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本，分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率，并进行流式细胞术分析。结果：剪碎法细胞形态较完整、存活率高；两种方法细胞凋亡水平（APO）、CV值有显著性差异（P<0.01）。结论：胰腺组织单细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。关键词：单细胞悬液；胰腺；流式细胞术parativeStudyoftechanicalmethodsformakingpancreatictissueintosinglece

2、llsuspension.Method：Allofthesamplesforthisexperimentpancreasofraticinjury.Singlecellsuspensiongotby“cut”and“homogenator”etry）.Thecellviabilityorphologicchangesofcellethodof“cut”ethodof“cut”akingrenaltissueintosinglecellsuspensionogenator”.Keyetry流式细胞术（Floetry，FCM）是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，具有快速、精确、高灵

3、敏、多参数等特点［1］。在这项技术中，细胞的分析检测均以单个细胞为基础，因此单细胞悬液样品的制备是关键的环节，细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多均可造成分析失败，而实体组织的单细胞悬液制备尤为困难。本实验采用剪碎法和研磨法制备新鲜胰腺实体组织单细胞悬液，旨在通过胰腺细胞活力测定，流式细胞术分析比较两种方法优劣。1材料和方法1.1试剂与仪器：FACSCalibur型流式细胞仪（美国B.D公司）；XD-101倒置显微镜（江南制造厂）；台盼蓝和碘化丙啶（均为Sigma公司）。1.2测定标本：10只Sprague-Da3两新鲜组织块，分别用剪碎和研磨2种方法制备组织悬液。1.3

4、.1剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量PBS；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10mlPBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500prm×3min，再用PBS洗3次，每次以500prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×106/ml。常温下放置,待测细胞的活力。1.3.2匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70ml组织研磨器内，加入2mlPBS；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用10mlPBS冲洗研器；收集细胞悬液，经300目尼龙网过滤；离心沉淀800prm×2min，再用PBS洗3次，离心沉淀。

5、以下处理同剪碎法。1.4形态学观察及细胞活性测定：取制备好的胰腺细胞悬液，在相差倒置显微镜下观察其形态学变化；取9滴各组细胞悬液,加一滴台盼蓝溶液混匀后，于4℃冰箱静置20min，用血小板记数板在光镜下分别记数活细胞和死细胞。1.5荧光染色：取细胞悬液，用70%预冷乙醇固定过夜，然后用4℃PBS洗涤2次。加入0.5mlPBS悬浮细胞，再加入50μg/ml碘化丙啶染色，4℃避光染色，过200目尼龙网，上FCM检测。应用CellQuest软件自动获取10000细胞/样品，ModFitLT软件进行DNA含量分析。主要检测指标：细胞凋亡水平（APO）、G0/G1细胞比率、DNA指数（DNA

6、index，DI）、S期细胞比率（SPF）、CV值。1.6统计学处理：所有数据用均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验做差异显著性分析。2结果2.1细胞形态：在相差倒置显微镜下观察，剪碎法所得的胰腺细胞形态完整、分散度好、背景较干净、杂质少，而研磨法视野中有较多的细胞碎片，完整细胞相对较少。台盼蓝排斥实验分别检测两种分离方法所得细胞存活率，剪碎法平均为78%，研磨法则为52%。2.2FCM检测结果：从DNA直方图上可见，匀浆法图形比剪碎法的图形差，表现为G1峰明显加宽，G1峰前出现较宽的碎片峰。DNA含量各参数的对比（表1）：2种方法G0/G1细胞比率、DI、SPF无显著性差异（

7、P>0.05），而细胞凋亡水平、CV值匀浆法明显高于剪碎法（P<0.01），见表1。表1不同制备法对细胞APO、DI、G0/G1、S和CV值的影响（略）3讨论流式细胞术是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，广泛应用细胞凋亡等方面的研究，具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点。而单细胞悬液的制备又是进行流式细胞术分析的关键环节，尤其在实体组织分散细胞悬液的制备方面，还有很多问题有待解决，至今尚无一个合适通用的方法。采用何种方法能够获得产率高、活性高、功能强的