实体组织单细胞悬液制备方法

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1、实体组织单细胞悬液制备方法实体组织单细胞悬液制备方法实体组织单细胞悬液制备方法实体组织单细胞悬液制备方法实体组织单细胞悬液制备方法?490?临床与实验病理学杂志JClinExpPathol2007Aug;23(4)实体组织单细胞悬液制备方法任兴昌,方黎,陈洪勋关键词:实体组织;单细胞悬液;HE染色中图分类号:R446.8;R944.17文献标识码:B文章编号:1001—7399(2007)04—0490—02在实际工作中由于机器操作和手工操作均不能保证每张玻片的条件一致,因此到目前为止还没有有效可靠的对照方法,故其标准化问题日益受到大家的重视.我们以新鲜

2、组织和固定组织为标本,探讨实体组织单细胞悬液制作的具体过程,为实现一一对照式原位玻片检测技术寻求一套全面,可靠的技术方法.1材料与方法1.1标本选择杭州市中医院l临床活检标本,包括新鲜组织和固定组织,运用机械法,机械一酶消化法,机械一化学法来制备单细胞悬液.并将制备的单细胞悬液取少许进行HE染色,常规显微镜观察,以选择最优方法.1.2方法1.2.1机械打散法将新鲜组织块用生理盐水(加入10%的肝素)洗涤,然后浸泡40min;固定组织则在清水中浸泡几天后用匀浆机打散或手工磨碎.打散后的产物倒人50ml离心管中,2000r/min离心10min弃上清,加人适

3、量的红细胞裂解液,震荡后静置40min,2000r/min离心10min后弃上清.加入适量的生理盐水或PBS液冲洗后,离心弃上清,重复此步骤2～3次,沉积物加入3倍的特制保存液,4℃保存,取少许涂片进行HE染色,封片后镜检.1.2.2机械一酶消化法将组织块用生理盐水(加入10%的肝素)洗涤,然后浸泡40rain左右;固定组织用清水浸泡几天后用刀切成1.O0mm的小块或用刀在组织块表面刮出薄薄的细胞团块.加入10%福尔马林震荡后静置40min,2000r/min离心10min,去上清液,然后加人生理盐水漂洗.小块组织加适量的胶原酶Ⅱ溶液在37℃的温箱中静置

4、过夜,期间震荡数次.280目筛网过滤,取滤液,2000r/min离心10min弃上清;薄细胞团块则280目筛网过滤后,直接加入适量的红细胞裂解液,震荡后离心弃上清,然后加适量胶原酶Ⅱ溶液在37℃的温箱中静置过夜,期间震荡数次.2000r/min离心10min弃上清,加入适量的生理盐水或PBS液冲洗,重复2～3次,最后于沉淀中加入特制保存液,取少许涂片进行HE染色,封片后镜检.收稿日期:2006—11—09修回日期:2007一Ol一05作者单位:杭州市中医院病理科,杭州310007作者简介:任兴昌,男,主任医师.E-mail:xch_ren2000@yah

5、oo.corn1.2.3机械一化学法固定组织用清水浸泡几天后用刀切成1.00mm的小块或用刀在组织块表面刮出薄薄的细胞团块.切成小块的组织加适量的EDTA溶液静置过夜,期间震荡数次.280目筛网过滤,取滤液,2000r/min离心10min后弃上清;薄细胞团块则280目筛网过滤后,直接加入适量的红细胞裂解液,细胞团块则280目筛网过滤,取滤液加入适量的红细胞裂解液,震荡后静置40min,转入50ml离心管中2000r/min离心10min后弃上清.然后加适量的ED.TA溶液静置过夜,每半小时震荡1次.后续操作同机械打散法.2结果在HE染色切片中细胞核呈蓝

6、色,血红细胞呈红色,细胞碎片呈淡蓝色,微生物呈蓝色0.通过比较3种制备实体组织单细胞悬液的方法(表1),HE染色后镜检结果表明在细胞密集度方面,机械一酶消化法效果最好,机械法其次,机械一化学法较差;细胞形态保存方面,3种方法的效果相似;细胞损坏度方面,机械法造成大量的细胞损伤,其它方法的结果差不多;污染度方面,只有用酶消化一机械法制备新鲜实体组织单细胞悬液时出现了少量的杆菌污染;血红细胞数量方面,每种方法均有血红细胞存在,但机械法的较多;细胞团块方面,只有用机械一酶消化法制备固定实体组织单细胞悬液时存在一部分细胞团块.3讨论我们用新鲜组织和固定组织为标本

7、,进行实体组织单细胞悬液制作,为组织化学,免疫组织化学,原位杂交等实现一一对照式的原位玻片检测技术寻求一套全面,可靠的技术方案奠定了实践基础.目前虽然新出现了一种Medimachine系统,该系统是将实体组织制备成单细胞或单细胞核悬液的自动化系统J,但它仍不适用于l临床病理工作.机械分散法主要包括剪碎法,网搓法,研磨组织法使细胞从紧密联结的组织中释放出来.该方法操作简便快捷无污染,但常常造成大量的细胞损伤,细胞产量较低.为使细胞碎片不影响检测结果,还需采用适当的方法除去碎片.而且固定后直接绞磨所制的单细胞细胞膜破坏大,所以机械法制得对照物的阳性部分最好的

8、是细胞核和胞质’.新鲜组织的细胞形态比固定过的组织易受损坏,且前期的处理方法不同