(硕士论文)波纹唇鱼神经肽y和芳香化酶基因的克隆及原核表达

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1、学校代码：10589学号：11090801210015分类号：密级：硕士学位论文题目：波纹唇鱼神经肽Y和芳香化酶基因的克隆及原核表达作者：佘长宁指导教师：骆剑副教授专业：水产养殖时间：二○一四年五月CloningandProkaryoticExpressionofNPYandP450aromGenesofCheilinusundulatusAThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheMasterDegreeinAquacultureBySheChangningSupervisor:LuoJianMajor：Aquac

2、ultureSubmittedtime:May,2014海南大学硕士学位论文摘要本文实验材料为波纹唇鱼，运用了RACE技术，克隆得到了神经肽Y基因（npy），性腺型芳香化酶基因（cyp19a1a）和脑型芳香化酶基因（cyp19a1b）的cDNA全长序列，对npy，cyp19a1a,cyp19a1b的cDNA全长序列及推导出的蛋白质氨基酸序列进行了序列分析。构建了NPY前体的原核表达重组子，获得了表达菌株，优化了原核表达的诱导条件，并对重组蛋白进行了可溶性分析。本文结论如下：1.波纹唇鱼npy基因的cDNA克隆从波纹唇鱼中克隆出的npy基因的cDNA全长为645bp（不含poly(A)）：

3、59bp的5’端非翻译区（5’UTR），编码99个氨基酸的300bp的开放阅读框(ORF)，和286bp的3’端非翻译区（3’UTR）。据其他已知物种的NPY前体的结构，可推测出波纹唇鱼NPY前体从氨基端到羧基端依次可划分为：28个氨基酸组成的信号肽、36个氨基酸组成的NPY成熟肽、翻译后加工位点Gly-Lys-Arg和最后32个氨基酸组成的羧基末端侧翼肽段(CPON),推导出的蛋白质分子量为11.2719kDa。对波纹唇鱼的NPY前体氨基酸序列与已知物种的NPY前体氨基酸序列进行了多重比对、同源性分析和分子进化分析，结果显示了不同物种NPY前体氨基酸序列间有明显的差别，近缘物种间的同源

4、性相对较高，远缘物种间则相对较低,但NPY成熟肽在进化上相当保守。2.波纹唇鱼cyp19a1a,cyp19a1b基因的cDNA克隆从波纹唇鱼中克隆出的cyp19a1a的cDNA全长为1791bp（不含poly(A)）：53bp的5’端非翻译区（5’UTR）、编码518个氨基酸的1557bp的开放阅读框(ORF)和181bp的3’端非翻译区（3’UTR）。推导出的蛋白质分子量为59.3404kDa,从波纹唇鱼中克隆出的cyp19a1b的cDNA全长为2123bp（不含poly(A)）：85bp的5’端非翻译区（5’UTR）、编码505个氨基酸的1518bp的开放阅读框(ORF)和520bp

5、的3’端非翻译区（3’UTR）。推导出的蛋白质分子量为57.3598kDa。cyp19a1a编码性腺型芳香化酶（P450aromA），cyp19a1b编码脑型芳香化酶（P450aromB），对波纹唇鱼的P450aromA和P450aromB的氨基酸序列与已知物种的P450aromA和P450aromB的氨基酸序列进行同源比对和分子进化分析，结果显示了波纹唇鱼P450aromA与鱼类P450aromA的同源性最高（84.2%-87.8%），与鱼类P450aromB的同源性较低（62.4%-65.2%）。波纹唇鱼P450aromB与鱼类P450aromB的同源性最高（81.1%-86.2%）

6、，与鱼类P450aromA的同源性较低（61.5%-62.8%)。波纹唇鱼P450aromA与P450aromB的同源性也较低（62.4%），表明了波纹唇鱼存在两种芳香化酶P450aromA和P450aromB，且P450aromA和P450aromB各自在进化上均相当保守。I波纹唇鱼神经肽Y和芳香化酶基因的克隆及原核表达3.波纹唇鱼NPY前体的原核表达及诱导条件的优化用限制性内切酶BglII和EcoRI分别对波纹唇鱼的含npy基因开放阅读框的插入片段与pET-32a(+)分别进行双酶切，然后用T4DNALigase进行插入片段与pET-32a(+)的连接，将连接后的重组质粒转化入Tra

7、nsetta菌株中，以IPTG诱导重组质粒在Transetta菌株中表达出重组蛋白，SDS-PAGE显示，在约28.2KDa处，诱导表达出一条蛋白条带。以获得最大量的可溶性重组蛋白为目的，对原核表达的诱导条件进行了优化。得到获得最大量的可溶性重组蛋白的诱导条件：在32℃下，0.6mMIPTG诱导8h。并对重组蛋白进行了可溶性分析，显示重组蛋白主要以可溶形式存在，此研究为后续的NPY前体重组蛋白的纯化回收和NPY前体的功能研究等奠定了