3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究_谭剑

《3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究_谭剑》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

第52卷第2期当代化工Vol.52，No.22023年2月ContemporaryChemicalIndustryFebruary，2023生物化工3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究1,3,421,3,42谭剑，隋淼，李凡，李义（1.中粮营养健康研究院，国家能源生物液体燃料研发中心，北京102209；2.吉林中粮生化有限公司，玉米深加工国家工程研究中心，吉林长春130033；3.营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京102209；4.老年营养食品研究北京市工程实验室，北京102209）摘要：将3个不同来源的3-O-乙酰转移酶基因转入大肠杆菌表达宿主，成功实现3种3-O-乙酰转移酶的异源表达，并通过诱导条件优化提高了可溶蛋白表达量。酶活特性研究结果显示，3种不同来源的乙酰转移酶在不同温度及pH条件下活性有着显著差异，其中Fo1TRI201最适温度及pH分别为40℃及pH=5.0，有着更强的温度及pH耐受性。最后在工业物料中考察了粗酶液的脱毒效果，通过向玉米浸泡液中添加1%的Fo1TRI201-1-1粗酶液，在40℃、pH=5.0条件下24h可将玉米浸泡液中的DON从2000μg·L以上降解至500μg·L以下，降解率最高达82.64%，为呕吐毒素脱毒产品和技术开发提供了选择和参考，具有一定的商业应用价值。关键词：3-O-乙酰转移酶；呕吐毒素；酶活特性；工业物料中图分类号：Q555文献标识码：A文章编号：1671-0460（2023）02-0473-05DOI:10.13840/j.cnki.cn21-1457/tq.2023.02.027ExpressionandCharacterizationof3-O-Acetyltransferase1,3,421,3,42TANJian,SUIMiao,LIFan,LIYi(1.COFCONutritionandHealthInstitute,NationalEnergyR&DCenterforLiquidBiofuels,Beijing102209,China;2.NationalEngineeringResearchCenterofCornDeepProcessing,ChangchunJilin130033,China;3.BeijingKeyLaboratoryofNutritionHealthandFoodSafety,Beijing102209,China;4.BeijingEngineeringLaboratoryforGeriatricNutritionFoodResearch,Beijing102209,China)Abstract:Three3-O-acetyltransferasegenesfromdifferentstrainsweretransferredintotheexpressionhostofE.coli,andweresuccessfullyexpressed.Theexpressionofsolubleproteinswasimprovedbyoptimizingtheinductionconditions.TheenzymecharacteristicsstudyshowedthattheactivityofacetyltransferasefromthreedifferentstrainswassignificantlydifferentunderdifferenttemperatureandpHconditions,amongwhichtheoptimumtemperatureandpHofFo1TRI201were40℃andpH=5.0,respectively,withstrongertemperatureandpHtolerance.Finally,thedetoxificationeffectofthecrudeenzymesolutionwasinvestigatedinindustrialmaterials.Byadding1%Fo1TRI201crudeenzymesolutiontothecornsoakingsolution,theDONinthecornsoakingsolutionwasdegradedfrommore-1-1than2000μg·Ltolessthan500μg·Lundertheconditionof40℃andpH=5.0in24h,withthehighestdegradationrateof82.64%.OurstudyprovidesachoiceandreferenceforthedevelopmentofdetoxificationproductsandtechnologiesforDON,andhascertaincommercialapplicationvalue.Keywords:3-O-Acetyltransferase;Deoxynivalenol;Enzymeactivity;Industrialmaterials[4]脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,化学名3α,7α,为物理法、化学法和生物法三大类。物理和化学15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，为一种主要由禾谷法因脱除效果有限、可能造成营养物质损失、二次[5-6]镰刀菌、粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌和雪腐镰刀菌等污染等缺点，从而限制了其在生产中的应用。生镰刀菌属产生的一种单端孢霉烯族化合物，因其可物法脱毒利用微生物或酶进行毒素降解，由于其温[1-2]以引起猪的呕吐又被称为呕吐毒素。作为全球范和、高效且具有较强特异性，受到越来越多的关[7-8]围内粮食、饲料和食品的主要污染霉菌毒素之一，注。利用现代生物技术去除粮食加工副产物及饲呕吐毒素对人和畜禽的健康造成严重影响，呕吐毒料原料中的呕吐毒素研究具有良好的应用前景，但素超标也成为目前粮食、饲料加工相关产品的主要应用于粮食加工过程中存在较高温度负荷或苛刻的[3]问题。酸碱条件下效率显著降低的问题。目前，国内外针对呕吐毒素的脱毒方法主要分研究表明，在DON的合成过程中，C3位羟基基金项目：国家重点研发计划（项目编号：NO.2019YFE0197300）。收稿日期：2022-10-31作者简介：谭剑（1991-），男，北京市人，高级工程师，硕士，2015年毕业于上海交通大学生物工程专业，研究方向：食品安全与菌株开发。E-mail：tanjian1@cofco.com。通信作者：李义（1964-），男，正高级工程师，硕士，研究方向：玉米深加工技术。E-mail：li-yi1@cofco.com。

1474当代化工2023年2月的乙酰化形式可以作为中间产物抑制DON的合凝胶成像系统，美国UVP；蛋白电泳仪，[9][10]成，从而保护作物抵制DON的毒害，因此DONInvitrogen公司；高效液相色谱仪1260，Agilent；PCR乙酰化酶已经被应用在植物抗病育种中，乙酰化酶仪，Bio-Rad；恒温摇床，Thermofisher；低温离心机，类也是目前研究和报道最多的对呕吐毒素具有降解Eppendorf；高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY；分子杂[11-14]作用的酶。3-O-乙酰转移酶存在于多种镰刀菌交箱，韩国Finepcr；超净工作台。属，编码基因为TRI101/TRI201，可将呕吐毒素的1.2方法3’-OH进行修饰进而转化为3ADON。不同来源的1.2.1重组表达载体与菌株的构建TRI101/TRI201基因在序列相似性达到66%~98%，Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201基因序列[15]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，载体降解DON效果为50.5%~100%。在针对酿酒酵母基因改造降低发酵产物DDGS中呕吐毒素的研究pET30a由全式金公司提供，分别经BamHI和NotI中，两个来源的基因（FgTRI101、FfTRI201）被证双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收；T4DNA连[16]接酶将酶切后的载体pET30a和Ff1TRI201、明具有比较好的效果。SCHMALE等进一步对33种不同来源的TRI101/TRI201基因进行构建和体外Fcr2TRI101、Fo1TRI201片段连接，转化大肠杆菌[17]-1表达，详细比较分析了各种来源的乙酰转移酶的DH5α。经含有50μg·mL卡那霉素（Kanamycin，表达量、脱毒效果等。Kan）的LB平板筛选，37℃过夜培养，挑取单菌本研究通过文献调研及GenBank数据库而分析落送华大基因测序，证明连接成功。比对，选择3个不同来源的3-O-乙酰转移酶提取重组表达载体pET30a-Ff1TRI201、Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201进行研究，通pET30a-Fcr2TRI101、pET30a-Fo1TRI201，电击转化过基因合成、表达质粒和表达菌株构建实现3种酶表达宿主Transetta（DE3）感受态细胞，涂布含有-1-1在大肠杆菌宿主中的成功表达，并通过不同温度、50μg·mL卡那霉素和20μg·mL氯霉素抗性平板pH条件下酶活特性研究确定其最适反应条件，最终进行筛选，37℃过夜培养。随机挑取抗性平板上的筛选酶活性较高、温度及pH耐受性较强的3-O-乙单菌落进行菌落PCR验证，PCR反应体系（50μL）：酰转移酶进行工业物料中DON降解评价，为后续PrimeSTARmax25μL，模板1μL，T7正、反引物DON脱毒酶开发及粮食加工过程中DON的脱除提各1μL，补水至50μL。PCR反应条件参考聚合酶供基础。说明书设置。PCR扩增产物经凝胶电泳检测及测序比对，证1材料与方法明重组表达载体成功转化Transetta（DE3）感受态1.1材料细胞，重组表达菌株构建成功。1.1.1基因、载体和菌株1.2.2重组菌株的诱导表达Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201基因序列重组菌株菌液涂布含有卡那霉素（Kan）及氯由生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因霉素（Cm）的抗性LB平板培养基上，37℃培养过-1合成；表达载体pET30a、表达宿主Transetta(DE3)夜后挑取单菌落接种于5mL含有50μg·mL卡那霉-1感受态细胞，全式金生物技术有限公司。素和20μg·mL氯霉素的LB试管培养基中，37℃、-11.1.2培养基220r·min培养过夜，以初始OD=0.01转接至含有-1LB固体培养基：胰蛋白胨10g·L，酵母提取30mL相同抗性LB培养基的三角瓶中，37℃、-1-1-1-1物5g·L，NaCl10g·L，琼脂15g·L，pH=7.0，220r·min培养菌体OD600至0.6~1.0时，降温至-1121℃高压灭菌20min。25℃并加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mmol·L，低LB液体培养基：成分除无琼脂外同LB固体培温诱导16h后离心收集菌体。取10OD菌体加入-1养基，60mL装于250mL三角瓶，121℃高压灭菌1.5mL50mmol·LTris-HClpH=8.0缓冲液重悬，超-120min。声破碎后获得粗酶液，8000r·min离心5min将粗1.1.3主要试剂和仪器酶液上清及沉淀分别用蛋白电泳检测蛋白表达呕吐毒素（DON）标准品，美国Sigma公司；情况。DONStarR免疫亲和净化柱，Romer公司；T4DNA1.2.3酶活评价及特性研究连接酶、限制性内切酶及PCR反应体系所需试剂，以酶解24h后DON降解率衡量3-O-乙酰转移Takara公司；色谱级乙腈、甲醇，ThermoFisher；其酶酶活，1mL反应体系包含100μL粗酶液、10μL他实验常规试剂。

2第52卷第2期谭剑，等：3-O-乙酰转移酶的表达及其酶活特性研究475-1DON母液（500mg·L，甲醇溶解）、890μL缓冲液；为增加目标降解酶可溶蛋白表达量，设置诱导-1分子杂交箱恒温反应24h后煮沸10min失活终止反条件为20℃、诱导剂IPTG终浓度0.5mmol·L的应。反应液经DONStarR免疫亲和净化柱回收（操实验对照组，其他条件不变，以考察诱导温度及诱作方法参考说明书），取50μL使用配备ZorbaxSB导剂对目标降解酶表达的影响。如图所示，降低诱C18柱（4.6mm×150mm，4.6mm）的高效液相色导温度及诱导剂浓度后，3种目标蛋白包涵体表达谱系统进行分析，柱温30℃，流动相20%甲醇，量减少，可溶蛋白部分均有增加。-1流速0.8mL·min，检测波长218nm，底物出峰时2.2酶活评价及特性研究[18]间8min，根据峰面积计算底物的减少量。通过对反应体系中DON标准品的降解来衡量pH对酶活影响：以上述体系考察粗酶液在粗酶液酶活。在pH=8.0缓冲液体系中，分别于30、pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0（柠檬酸磷酸盐缓35、40、45、50℃条件下酶解24h，如图2所示，冲液）条件下对DON的降解率，以确定其最适反Ff1TRI201酶活在30~40℃范围内差异不大，DON应pH。降解率达到20%以上，升温至40℃以上后酶活显温度对酶活影响：以上述体系，在pH=8.0缓冲著下降，降解率降至10%以下；Fo1TRI201耐热性液中，分别考察粗酶液在30、35、40、45、50℃较好，最适反应温度为40℃，降解率达40%以上，条件下对DON的降解率，以确定其最适反应温度。温度升至50℃后酶活迅速下降；FcrTRI101热稳定1.2.4工业物料脱毒验证性最差，30℃条件下DON降解率20%以上，随温根据酶活特性结果，选取酶活最高的粗酶液，度升高酶活显著降低。以1%的比例加入到1L玉米浸泡液（pH=5.0）中，并在最适条件下搅拌充分反应，分别于0、3、6、24h取样，净化处理后检测残余DON含量。2结果与讨论2.13-O-乙酰转移酶的表达将细胞破碎后获得的粗酶液进行SDS-聚丙酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳检测分析，结果如图1所示。图2温度对3-O-乙酰转移酶的影响Fig.2Effectoftemperatureon3‐O‐acetyltransferase在35℃条件下，分别于pH=8.0~3.0缓冲液中酶解24h，如图3所示，3种酶在中性及碱性条件下活性均较低，DON降解率＜20%；Ff1TRI201及Fcr2TRI101降解酶在pH=6.0条件下酶活最高，DON降解率分别达到60%及40%，并随pH降低酶活迅速下降，pH=4.0条件下DON降解率即降低至10%-1A—25℃、1.0mmol·LIPTG诱导，1~6依次为Fcr2TRI101、Ff1TRI201、Fo1TRI201粗酶液上清及沉淀；B—20℃、0.5mmol·L-1IPTG及以下；Fo1TRI201酶活在pH=5.0时达到最高，DON诱导，7~12依次为Fcr2TRI101、Ff1TRI201、Fo1TRI201粗酶液上清及降解率为65%左右，且pH=4.0~6.0范围内降解率维沉淀。持在40%~60%，由此可见Fo1TRI201降解酶具有更图13-O-乙酰转移酶蛋白电泳强的耐酸性。Fig.1SDS-PAGEanalysisofthe3‐O‐acetyltransferase2.3工业物料脱毒验证3个目标蛋白理论大小均为51.7kD左右，粗酶通过3种粗酶液特性研究，选取酶活最高且对液中出现大小相符的蛋白条带，其中Fcr2TRI101蛋不同温度及pH适应性更强的Fo1TRI201粗酶液，在40℃、pH=5.0的最适条件下考察其对工业物料白主要以包涵体形式存在，Ff1TRI201及Fo1TRI201玉米浸泡液中DON的降解效果，如图4所示，玉米可溶蛋白及包涵体均有表达。-1浸泡液中DON初始质量浓度为2126μg·L，加入

3476当代化工2023年2月-1粗酶液反应3h后降至1100μg·L左右，6h后降高温、酸性的粮食加工及副产物脱毒中具有更好的-1低至500μg·L以下，24h降解率最高达82.64%，应用前景。在本研究的基础上，未来可通过表达元说明在此条件下加入粗酶液可有效去除玉米浸泡液器件的筛选、发酵条件优化提高酶表达量；通过理中的DON。性设计、定向进化等先进技术对降解酶进行改造，进一步降低应用成本；也可通过食品安全菌株的构[19]建及筛选拓宽应用领域。呕吐毒素的污染问题在粮食、饲料加工领域长期存在，威胁着人类和畜禽健康，3-O-乙酰转移酶的研究为呕吐毒素脱毒产品和技术开发提供了选择和参考，具有一定的商业应[20]用价值，未来与生物浸泡、固态发酵等工艺结合，为真菌毒素污染综合解决方案的开发打下了良好的基础。图3pH对3-O-乙酰转移酶的影响参考文献：Fig.3EffectofpHon3‐O‐acetyltransferase［1］KARLOVSKYP.Biologicaldetoxificationofthemycotoxindeoxynivalenolanditsuseingeneticallyengineeredcropsandfeedadditives[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2011,91:491-504.［2］LIDDELLCM,LEONARDKJ,BUSHNELLWR.SystematicsofFusariumspeciesandalliesassociatedwithFusariumheadblight[R].2003.［3］YAOYZ,LONGM.Thebiologicaldetoxificationofdeoxynivalenol:areview[J].FoodandChemicalToxicology,2020,145:111649.［4］LIUM,ZHAOL,GONGGX,etal.Remedationstrategiesformycotoxincontrolinfeed[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,2022,13:19.［5］唐语谦，刘晨迪，潘药银，等.呕吐毒素降解微生物的研究进展[J].食品与生物技术学报，2021，40（6）：1673-1689.［6］GUOHY,JIJ,WANGJS,etal.Deoxynivalenol:maskedforms,fateduringfoodprocessing,andpotentialbiologicalremedies[J].图4玉米浸泡液中DON降解效果ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety,2020,Fig.4DegradationofDONincornsteepliquor19(2):895-926.［7］FEIZOLLAHIE,ROOPESHMS.Mechanismsofdeoxynivalenol3结论（DON）degradationduringdifferenttreatments：areview[J].CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition,2021,62（21）：本研究对3个不同来源的3-O-乙酰转移酶5903-5924.Ff1TRI201、Fcr2TRI101、Fo1TRI201进行考察，实［8］何伟杰，刘易科，朱展望，等.镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇现了在大肠杆菌宿主中的异源表达，并通过诱导条脱毒菌剂脱毒酶研究进展[J].植物病理学，2019，49（5）：577-589.［9］KIMURAM,KANEKOI,KOMIYAMAM,etal.Trichothecene件优化提高了目标酶可溶蛋白表达量，SDS-PAGE3-O-acetyltransferaseprotectsboththeproducingorganismand显示目标蛋白大小与理论值51.7kD一致；进一步transformedyeastfromrelatedmycotoxins[J].TheJournalofBiologicalChemistry,1998,273（16）：1654-1661.通过不同温度、pH条件下的粗酶液活性评价对酶活［10］CHENY,KISTLERHC,MAZH.Fusariumgraminearum性质进行研究，确定了3种酶最适反应条件，其中trichothecenemycotoxins:biosynthesis,regulation,andFo1TRI201粗酶液具有更强的耐热性及pH耐受性；management[J].Annu.Rev.Phytopathol,2019.57:1.1-1.25.［11］JIC,FANY,ZHAOLH.Reviewonbiologicaldegradationof最后在工业物料中考察了粗酶液的脱毒效果，通过mycotoxins[J].AnimalNutrition,2016,2(3):127-133.向玉米浸泡液中添加1%的Fo1TRI201粗酶液，在［12］ANDREWGT,GULNARAF,GARIFULLINA,etal.Novelregulatorygene,tri10,controlstri-chothecenetoxinproductionand40℃、pH=5.0条件下24h可将玉米浸泡液中的geneexpression[J].AppliedAndEnvironmentalMicrobiology,-1-1DON从2000μg·L以上降解至500μg·L以下，降2001,67(11):5294-5302.解率最高达82.64%［13］OKUBARAP,BLECHLA,MCCORMICKS,etal.Engineeringdeoxynivalenolmetabolisminwheatthroughtheexpressionofa实验结果表明，可通过重组菌株构建实现fungaltrichotheceneacetyltransferasegene[J].Theoretical&3-O-乙酰转移酶的异源表达，3种不同来源的乙酰AppliedGenetics,2002,106(1):74-83.（下转第480页）转移酶在不同温度及pH条件下活性有着显著差异，其中Fo1TRI201具有更强的温度及pH耐受性，在

4480当代化工2023年2月[11]易溶出；其透光率从36.2%提升至91.7%，分析多的性能，可与聚乳酸共混制成可降解食品餐具等。原因为淀粉分子间的氢键作用力被破坏，分子间缔随着行业变性淀粉技术发展，蜡质淀粉变性将成为合作用减弱，降低光的散射和反射强度；抗凝沉性变性淀粉行业重点关注和研究的热点。从6.9%提升至12.2%，说明向支链淀粉中引入的乙参考文献：酰基团空间位阻较大，抑制了淀粉颗粒的聚集和凝［1］韩斐.醋酸酯玉米淀粉的制备、表征及性能研究[D].兰州：兰州大学，2013.沉，阻止了分子链间的重结晶，使抗凝沉性进一步［2］陈渊，黄祖强，谢祖芳，等，机械活化醋酸酯淀粉的制备及其生提升。物降解塑料膜性能[J].农业工程学报，2011，27（5）：298-304.［3］XUY,MILADINOVV,HANNAMA.Synthesisandcharacteriztionof3结论starchacetaeswithhighsubstitution[J].CeralChemistry,2004,81(6):735-740.以蜡质玉米淀粉为原料实验制备乙酰化变性淀［4］安鸿雁，赵国兴，梁颖，等.改性麦芽糊精在低温肠中的应用[J].当粉，当酯化剂加量质量分数为3.8%、反应时间及温代化工，2021，50（11）：2745-2748.度分别为2.1h和38℃、pH=8.5时，样品的乙酰基［5］安鸿雁，李义，吴延东，等.水介质法木薯淀粉乙酰化的工艺优化[J].广州化工，2019，27（5）：58-60.质量分数可达3.95%，取代度0.121%，淀粉的特性［6］杨明杰，沈艳琴.取代度对醋酸酯淀粉结构与性能的影响酯[J].现代黏度及表观黏度都有较大程度的改善，淀粉的溶解纺织技术，2016，25（4）：1-5.度提升至73.6%，糊液透光率提升至91.7%，抗凝［7］张昊，王建坤，王瑞，等.微波辅助制备乙酰化玉米淀粉的理化性能[J].材料研究学报，2014，28（4）：286-291.沉性能也从6.9%提升到12.2%。［8］安鸿雁，赵国兴，曹雪，等.半干法磷酸酯淀粉的制备[J].食品工普通玉米淀粉支链淀粉质量分数约75%，直链业技，2018（5）：226-228.淀粉质量分数约25%，在加热和冷却过程中黏度变［9］陈杭.乙酰基糯米淀粉的制备、性质及琥珀酸酯化改性研究[D].四川化较大，糊液的稳定性差，限制其应用领域，而蜡农业大学，2007.［10］ZHENGGH,HANHL,BHATTYRS.Functionalpropertiesof质玉米淀粉支链淀粉含量高，几乎不含直链淀粉，cross-linkedandhydroxypropylatedwaxyhull-lessbarley糊液稳定性很好，不易老化，透明度及成膜效果相starches[J].CrealChem,1999,76(2):182-188.对较好，将其乙酰化后其黏度特性更佳，糊液透明［11］ANILG,HAROLDC.Influenceofprioracidtreatmentonacetyoationofwheat,potatoandmaizestarches[J].FoodChemistry,2007,105:度、抗凝沉性进一步提升，更适合高端食品行业及917-925.药品行业。而高取代度的乙酰化蜡质淀粉将赋予更（上接第476页）［14］OHSATOS,OCHIAI-FUKUDAT,NISHIUCHIT,etal.Transgenic［17］KHATIBIPA,NEWMISTERSA,RAYMENTI,etal.riceplantsexpressingtrichothecene3-O-acetyltransferaseshowBioprospectingfortrichothecene3-o-acetyltransferasesinthefungalresistancetotheFusariumphytotoxindeoxynivalenol[J].PlantCellgenusfusariumyieldsfunctionalenzymeswithdifferentabilitiestoReports,2007,26(4):531-538.modifythemycotoxindeoxynivalenol[J].AppliedandEnviromental［15］KARLOVSKYP.BiologicaldetoxificationofthemycotoxinMicrobiology,2011,77(4):1162-1170.deoxynivalenolanditsuseingeneticallyengineeredcropsandfeed［18］谭剑，杨硕，苏会波，等.一株降解呕吐毒素枯草芽孢杆菌的鉴additives[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2011,定与降解效果研究[J].当代化工，2018，47（3）：548-551.91:491-504.［19］杜稳，常晓娇，赵一凡，等.降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇直投菌剂［16］KHATIBIPA,MONTANTIJ,NGHIEMNP,etal.Conversionof发酵制备工艺研究及初步应用[J].粮油食品科技，2020，28（4）：deoxynivalenolto3-acetyldeoxynivalenolinbarley-derivedfuel152-158.ethanolco-productswithyeastexpressingtrichothecene［20］田祖光，高恺玥，周蕾，等.降解呕吐毒素益生菌的筛选及在发3-O-acetyltransferases[J].BiotechnologyforBiofuels,2011,4:26.酵麸皮中的应用[J].饲料研究，2021，44（5）：84-87.