川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶（LCCOMT）的固定化及结构生物学研究

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1、国内图书分类号：Q71密级：公开国际图书分类号：西南交通大学研究生学位论文川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶（LCCOMT）的固定化及结构生物学研究年级二零一五级姓名朱建全申请学位级别医学硕士专业药学指导老师廖海副教授二零一八年五月ClassifiedIndex:Q71U.D.C:SouthwestJiaotongUniversityMasterDegreeThesisStudiesonImmobilizationandStructuralBiologyofLigusticumchuanxiongCaffeicacid-3-O-Methyltransferase(LC

2、COMT)Grade:2015Candidate:JianquanZhuAcademicDegreeAppliedfor:MasterofMedicineSpeciality:PharmacySupervisor:HaiLiao,AssociateProfessorMay,2018√西南交通大学硕士研究生学位论文第I页摘要川芎（LigusticumchuanxiongHort）以根茎入药，为四川省著名道地药材，主要用于治疗偏头痛、风湿性关节痛、月经失调、跌打损伤、心血管疾病等，其指标成分为阿魏酸。现代研究证明阿魏酸及其衍生物有保护神经系统、镇痛、抗氧化、抗血栓、抗

3、动脉粥样硬化、抗癌等功效。川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶（L.chuanxiongcaffeicacid-3-O-methyltransferase，LCCOMT）以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基基团供体，能催化咖啡酸形成阿魏酸。前期研究中，实验室构建了LCCOMT-pET28a重组质粒，转入BL21菌株中，优化了重组菌株的表达纯化条件，并通过HPLC检测LCCOMT活性。首先，本研究在最佳条件下诱导表达LCCOMT重组蛋白，利用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化的LCCOMT蛋白浓度进行测定。选用LiCl、NaCl和KCl为效+++应物，证明碱金属离子Li、N

4、a和K浓度在0-1.0mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。选用CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Pb(NO3)2、NiSO4·6H2O、CdCl2、2+2+FeSO4·7H2O、CaCl₂·2H2O、BaCl2·2H2O和MnCl2·4H2O为效应物，证明Co、Cu、2+2+2+2+Zn、Pb、Ni和Cd浓度在0-1.0mM范围内均能使LCCOMT酶活力降低，其中以2+2+2+2+2+Cu最为明显；而Fe、Ca、Ba和Mn浓度在0-1.0mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。选用Bi(NO3)3·5H2O、Al(NO3)3·9

5、H2O、FeCl3·6H2O和CrCl3·6H2O为效应3+3+3+3+物，证明Bi浓度在0-1.0mM范围内能使LCCOMT酶活力降低；而Al、Fe和Cr2+2+浓度在0-1.0mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。通过研究Cu、Zn对LCCOMT2+2+紫外可见吸收光谱和荧光光谱的影响，发现Cu、Zn确实能使LCCOMT的三维结构发生改变。这些都为LCCOMT的后续固定化研究及工业化使用提供指导。其次，实验采用包埋固定化法，选用海藻酸钠作为载体固定化LCCOMT，以固定化酶的相对酶活力作为固定化效率的衡量指标。先后通过单因素实验和正交试验确定最佳固定化工艺条

6、件为：海藻酸钠质量分数为2.0%，CaCl2浓度为2.5g/L，固定化时间为1h，海藻酸钠溶液与酶质量比为35000：1，固定化效率可达75.43%。实验比较了游离LCCOMT和固定化LCCOMT的最适反应pH、最适反应温度、pH稳定性、热稳定性和米氏常数，结果为：游离LCCOMT和固定化LCCOMT的最适反应pH分别是7.0和7.5，固定化LCCOMT的最适反应pH升高0.5；游离LCCOMT和固定化西南交通大学硕士研究生学位论文第II页LCCOMT的最适反应温度均是37℃，其最适反应温度没有变化。虽然固定化LCCOMT对pH的稳定性没有提高，且对底物的亲和力有

7、所降低，但对热稳定性有所提高。在操作稳定性实验中发现固定化LCCOMT连续进行6次反应，固定化LCCOMT的相对酶活力可保留50％；在连续进行12次操作以后，固定化LCCOMT的相对酶活力仍可保留30％左右，说明制备的固定化酶的操作稳定性良好，能达到多次使用的目的。最后，利用聚乙二醇4000的亲水性，制备具有多孔结构的固定化酶，使固定化LCCOMT的相对酶活力比对照组提高33％左右。实验达到使固定化酶与反应产物容易分离、便于工业生产中自动化操作和降低酶的使用成本的目的。最后，构建了LCCOMT-pET28TEV-pccdB重组质粒，转入大肠杆菌Rosetta，成功

8、2+表达了