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1、流式细胞术分析报告人：焦鑫艳报告时间：2014.10.20流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）定义流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。最终获得单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）。特点：检测速度快，分析样本量大；可同时分析单个细胞的多种特征；强大的分选功能。所用流式细胞仪（FlowCytometer）是
2、集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。有分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪。流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位……1.上机检测单色/双色/多色样本参数调节电压、阈值、设门、补偿2.细胞分选3.细胞表面和胞内标志检测4.细胞周期(PI单染)5.细胞凋亡（Ann
3、exinV与PI双染）举例：FACSCalibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色检测器组（激光器）所需探测器（PMT）位置带通/长通透镜适用染料488nm蓝色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5,PE-Cy7635nm红色激光FL4661/16APC搭配荧光素原则1.不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。2.每个通道只能选择1种荧光素。3.各个通道之间的荧光素可以随意搭配流式抗体荧光标记搭配将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经
4、这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。不推荐APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。推荐使用AlexFluro488和AlexFluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。数据显示1.直方图（Histogram）2.二维点图（DotPlot）3.等高线图（Conto
5、urPlot）4.密度图（Density）5.三维图（3DPlot）等“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群（细胞基本处于同一状态，有可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括在线设门和离线设门。补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干
6、扰荧光信号。使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色。实验样本：自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光同型对照：自发荧光＋非特异荧光单参数直方图分析荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目。双参数散点图分析散点图等高线图密度图FCM的主要测定指标：FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)FCM标记方法单标：一种单抗/tube--FL1,FSC,SSC（三参数）双标：两种单抗/tube--FL1,FL2,FSC,SSC（四参数）三/四标：三种单抗/tube
7、、四种单抗/tube--FL1-FL3/4,FSC,SSC分析时，使用FL2-w和FL2-A显示。FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前提是用Rnase处理去除RNA）；,FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧光峰的脉冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用,用于去除粘连细胞。流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）颗粒杂质、气泡对检测
8、的影响FSC：反映细胞相对大小及其表面积SSC：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型在线设门离线设门TB细胞分选细胞表面标
