中青年优秀论文评奖

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中青年优秀论文评奖电针刺对手术创伤大鼠脾T淋巴细胞IL-2、IFN-y及ERK信号通路的影响哈尔滨医科大学附属肿瘤医院麻醉科（黑龙江哈尔滨150081）王坤王国年针刺疗法是我国传统医学的瑰宝，许多证据表明电针刺“足三里”和“阑尾”穴能明显改善创伤诱导的免疫抑制，但是这种作用的分子机制尚未十分明确。胞外信号调节激酶（extracellular-regulatedproteinkinasel/2,ERK1/2）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）家族一员，在细胞信号转导网络屮处于枢纽地位，与辅助性T细胞分化有关。那么，电针刺是否可以通过活化ERK信号通路，促进IL-2、IFN-y炎症因了mRNA表达和蛋白生成，进而提高脾脏T细胞免疫功能，目前尚不清楚。目的：观察电针刺“足三里”和“阑尾”穴对手术创伤大鼠脾脏T细胞内IL-2、IFN-y和ERK信号转导通路的影响，探讨其保护作用的分子机制，旨在为临床探索术后免疫功能治疗提供新思路。方法：健康雄性SD大鼠32只随机分为:正常对照组（Control组，n=8）、单纯电针组（EA组,n=8）、创伤组（Trauma组,n=8）和创伤后电针组（T+EA组,n=8)o采用手术创伤致术后免疫抑制方法造模，大鼠术前12h

1禁食、自由饮水，经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，分别沿大鼠背部中线、腹部中线作6cm和5cm的纵行切口，背部切口以暴露脊柱为度，腹部作纵行切口后，暴露腹部脏器3分钟，以检查有无病灶及损伤，然后关闭腹腔。选取双侧足阳明胃经上的“足三里”、“阑尾”穴进行电针刺激，疏密波(60Hz,1.05秒和2Hz,2.85秒交替)，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(W1mA),持续30min,每日1次，共3次。于术后3天无菌取脾，尼龙毛柱法分离脾脏T淋巴细胞，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测脾脏T淋巴细胞内IL-2JFN-Y蛋白和mRNA表达；应用Westernblot检测ERK1/2表达；ERK1/2下游核转录因了NF-zcB和AP-1表达测定,采用Trans-AMELISA-baseclkits分析法。结果：(1)EA组脾脏T淋巴细胞内IL-2>IFN-y蛋白和mRNA表达，与Control组比较没有明显改变；手术创伤后IL・2利FN・y蛋白和mRNA表达明显降低，Trauma组与Control组比较有显著差异(戶<0.001)；给予电针刺处理后IL・2、IFN-y蛋白和mRNA表达明显增加，T+EA组与Trauma组比较有明显差异(P=0.002)。(2)脾脏T淋巴细胞内total-ERKl/2及p-ERKl/2、NF-/cB和AP-1的DNA连接活性，EA组与Control组比较无明显差异；手术创伤后p-ERKl/2表达、NF-/cB和AP・1的DNA连接活性明显降低，Trauma组与Control组比较有明显差异(P<0.001)；给予电针刺处理后P-ERK1/2表达、NF-kB和AP・1的DNA连接活性明显增加，T+EA组与Trauma组比较有统计学差异(P<0.001)o结论：电针刺“足三里”和“阑尾”可以提高创伤大鼠脾脏T细胞内IL・2、IFN-y蛋白和mRNA的表达，激活其免疫功能，改善术

2后免疫抑制状态，这种保护作用与提高ERK1/2.NF-kB和AP-1活性密切和关。这一发现对于理解电针刺免疫调节机制和临床应用具有重耍意义。关键词:电针；手术创伤;IL-2；IFN-y；ERK1/2AbstractBACKGROUND:theaimofourstudywastoinvestigatetheeffectsofEAontheIL-2andIFN-yproteinandmRNAexpressions,aswellasextracellular-regulatedproteinkinase(ERK)signalingpathway,andevaluatethesignalingregulatorymechanismofEAeffects.METHODS:32maleSDratsweredividedrandomlyintofourgroups(Control,EA,Trauma,andT+EAgroup,n=8/group).Ratswerefastedovernightbutallowedwateradlibitumbeforetheexperiment.Directlypriortosurgery,ratswereanesthetizedwithanintraperitonealinjectionofpentobarbitalsodium(40mg/kg).Ratswereasepticallyincisedlongitudinallytoalengthof6cmalongthedorsalmedianlineand5cmalongtheabdominalmedianline,andtheabdominalviscerawereexposedfor3min.Aftermakingsuretherewasnobleedingintheabdominalcavity,thewoundwassutured.EAwasappliedat”Zusanli”andnLanweinacupointsafteroperation,lastingfor30minonceaday.EAparametersweresetasalternatingstringsofdense-dispersefrequencies(60Hzfor1.05sand2Hzfor2.85salternately),andtheintensitywasadjustedtoinducemoderatemusclecontractofthehindlimb(<1mA).Atpostoperativeday3,splenicTcellswereisolatedusingthenyloncolumnmethod.Interleukin(IL)-2andinterferon(IFN)-yproteinandtheirmRNAexpressionswere

3assayedbyELISAandRT-PCR,respectively.TocharacterizethemechanismforthetranscriptionregulationofEAoncytokineexpression,weexaminetheactivityofERK1/2signalingpathwayusingWesternblotanalysis,andtheDNAbindingactivityofnuclearfactor(NF)-kBandactivatorprotein(AP)-lusingTrans-AMELISA-basedkits.RESULTS:(1)TheresultsshowedthatIL-2andIFN-yproteinandtheirmRNAexpressionsinsplenicTcellsoftraumatizedratsweremarkedlydecreased3daysafteroperation(P<0.001,Traumagroupvs.Controlgroup).(2)ThiswasaccompaniedwithasignificantdepressionintheactivityofERK1/2、NF-/cBandAP-1(P<0.001,Traumagroupvs.Controlgroup).EAadministrationincreasedthesecytokineproductionandmRNAexpressions(P<0.05,T十EAgroupvs.Traumagroup),andpreventedthesuppressionofERK1/2activationaswellasNF-/cBandAP-1DNAbindingactivity(P<0.001,T+EAgroupvs.Traumagroup).CONCLUSIONS:EAregulatesIL-2andIFN-yatproteinandmRNAlevelinsplenicTcells,and,atleastinpart,involvesthesignalingpathwaysofERK1/2aswellasNF-kBandAP-1.ThesefindingssuggestthatEAmayameliorateimpairedimmunefunctioninthepostoperativestateandmaybeusedoftentoreleasetheimmunosuppressionfollowingsurgicaltraumaclinically.Keywords:Electroacupuncture;surgicaltrauma;IL-2;IFN-y;ERK外科手术作为一种临床常见的诊疗手段，在治疗疾病的同时由于手术造成的创伤，不可避免地影响了免疫系统的功能，可致机体的免

4疫功能受抑，进而引起感染、多器官功能衰竭，甚至死亡。因此如何纠正创伤后的免疫功能低下是控制伤后感染及改善预后的关键。针刺疗法是我国传统医学的瑰宝，具有经济、简便、安全、有效的优点，可用于治疗许多疾病，最为常见的作用是缓解疼痛，但针刺的作用决不仅限于此，许多证据表明电针刺“足三里”和“阑尾”穴能明显改善创伤诱导的免疫抑制⑴，但是这种作用的分子机制尚未十分明确。丝裂原活化蛋白激酶(mitogemactivatedproteinkinase,MAPK)信号通路是当今生物医学和临床医学研究的热门话题，它是将信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，参与基因表达调控、细胞功能活动(如增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程⑵。近年来研究发现，MAPK信号转导途径可以诱导初始CD4'T细胞向1型辅助性T细胞(helperTcell1,Thl)或Th2分化，从而引发不同的免疫反应⑶。ERK1/2信号通路在细胞信号转导网络中处于枢纽地位，与辅助性T细胞分化有关。那么，电针是否可以通过提高ERK信号通路的表达，促进IL-2.IFN-y炎症因子mRNA表达和蛋片生成，进而提高脾脏T细胞免疫功能，目前尚不清楚。因此，本实验观察电针刺“足三里”和“阑尾”穴对手术创伤后大鼠脾脏T细胞内IL・2、IFN-y和ERK1/2信号转导通路的影响，探讨其保护作用的分了机制，旨在为临床探索术后免疫功能治疗提供新的思路。(1)实验方法1.1实验动物雄性健康成年Sprague-Dawley人鼠，清洁级，体重200士20g,

5购于北京维通利华公司实验动物中心。由哈尔滨医科大学公共卫生学院实验动物中心饲养，每四只一组饲养于笼内，光照与熄灯各12小时，保持在安静环境中，温度维持恒温23±0.5。。湿度为40-60%,动物自由饮水、进食。动物的处理符合国际实验动物使用准则。1.2免疫抑制模型的制作采用手术创伤致术后免疫抑制方法造模叫大鼠术前12h禁食、自由饮水，经腹腔注射(i.p.)戊巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉后，分别沿大鼠背部中线、腹部中线作6cm和5cm的纵行切口，背部切口以暴露脊柱为度，腹部作纵行切口后，暴露腹部脏器3分钟，以检查有无病灶及损伤，然后关闭腹腔。术后适当保暖，无术后感染发生。1・3输穴的选择与针刺操作1.3.1输穴选择根据古典医籍理论，选取双侧足阳明胃经上的“足三里”和“阑尾”穴。“足三里”穴是针刺调节免疫的常用穴位，属足阳明胃经，阳明经为多气多血之经，脾胃乃后天之本，气血生化之源。针刺足三里穴可以疏经通络，培补后天气血阴阳，扶助正气，增强机体抗病能力。实验亦表明针刺“足三里”穴对免疫功能具有调节作用⑴；“阑尾”穴是一辅助穴。按照《实验针灸学》所附的常用实验动物的针灸穴位的方法取穴。“足三里”穴：在小腿前外侧，当犊鼻下3寸，距胫骨前缘5mm处。“阑尾”穴：在“足三里”穴下3.3mm处。1.3.2针具

626号1寸华佗牌针灸针（直径0.3mm,长50mm）,苏州针灸器械厂生产。1.3.3针刺操作“足三里”穴：直刺5mm,连接电针仪负极。“阑尾”穴：直刺5mm,连接电针仪阳极。1.3.4电针刺参数将大鼠固定于特制的鼠板上，头尾稍可活动，身体不能转动。针后接电针仪（神经肌肉刺激仪SDZ-II,苏州针灸器械厂），疏密波（60Hz,1.05秒和2Hz,2.85秒交替），强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜（W1mA）,持续30min,每日1次，共3次。（2）实验分组及处理按随机数字表将32只大鼠分为止常对照组（Control组，n二8）、单纯电针组（EA组，n二8）、创伤组（Tratima组，n二8）和创伤后电针组（T+EA组，n二8）o各组处理如下：正常对照组：不造模，于实验开始后与创伤后电针组用同样的方法，同样的时间固定，每次30分钟，但不行电针刺激；单纯电针组：仅电针，不造模，I古I定方法同正常对照组；创伤组：按照上述手术模型制作方法，于实验开始第一天，建立手术创伤免疫抑制模型，不电针。其它处理同正常对照组；创伤后电针组：于实验开始第一天首先造模，其方法同创伤组。动物

7于清醒状态下，将大鼠固定于特制的鼠板上，头尾稍可活动，身体不能转动，于实验第2天开始电针，每日同一吋辰于双侧“足三里”、“阑尾”穴连续刺激30min,持续3天。(3)标本的采集与检测3・1脾脏T淋巴细胞悬液制备将大鼠断头处死，立即消毒，在无菌工作台上，剖取脾脏进行处理。按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法⑷分离脾脏中的T细胞。酸性a-醋酸蔡酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度＞92%,台盼蓝染色试验证明分离出的T细胞活力＞95%。3.2观察指标及检测方法3.2.1脾脏T淋巴细胞内IL・2利FN・y蛋白表达测定:用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL・2利FN・y蛋白含量，按照南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行操作。3.2.2脾脏丁淋巴细胞内IL・2和IFN.ymRNA表达测定：加入Trizol提取总RNA,测定其浓度并计算其纯度。以Oligo(dt)为引物逆转录合成cDNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对转录产物扩增，GAPDH作内参。IL-2(91bp):S5JGACGCTGGAAATTTCATCAGCA-3；A5f-GCTCATCATCGAATTGGCACTC-3；IFN-y(140bp):S5‘-AGGCCATCAGCAACAACATAAGTG-3r,A5'・GACAGCTTTGTGCTGGATCTGTG-3A；GAPDH(143bp):S5r-GGCACAGTCAAG

8GCTGAGAATG-3'A5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3\扩增产物先经1.5%琼脂糖凝胶电泳，再用澳化乙锭染色，扫描仪成像后采用凝胶图像分析处理系统分析，以IL・2、IFN*与GAPDH的积分光度比值进行半定量，此即相对积分吸光度,籍此对比各组IL-2.IFN-YmRNA的相对表达量。3.2.3脾脏T淋巴细胞内ERK1/2表达测定：应用Westernblot检测MAPK信号通路ERK1/2总蛋白(total-ERKl/2)及磷酸化ERK1/2(p-ERKl/2)的表达变化。取脾脏T淋巴细胞悬液，加入裂解液A(W/V:20%),4°C下18000r/min离心lOmin。取上清测定BCA蛋白含量。将上清加至已配好的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶加样孔，进行电泳。电泳结束后，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜。室温震荡封闭1小时后，加入1:1000兔抗大鼠的total-ERKl/2及p・ERKl/2单克隆抗体孵育，4°C过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育lh后，TBS洗三次，用BCIP/NBT显色。弘actin为内参照，用KadakdigitalScienceID扫描及分析系统分析膜上蛋白条带积分吸光度值，以total-ERKl/2或p-ERK1/2与相应B-actin蛋白的比值反映total-ERK1/2及p-ERK1/2的表达量。3.2.4脾脏T淋巴细胞内ERK下游核转录因子(nuclearfactor-/cB,NF・kB)和活化蛋白・1(activatorprotein-1,AP-1)表达测定：提取细胞核蛋白，采用Trans-AMELISA-basedkits分析法测定NF讥B和AP-1的表达。用核蛋白提取试剂盒(ActiveMotif,Carlsbad,CA)提取细胞核内蛋白后，加入NF我B和AP-1生物索酰化双链寡聚核昔酸包被的96

9孔板，活化的转录因子连接到寡聚核昔酸上，通过抗NF・kBp65、c・Fos、cJun辣根过氧化物酶连接二抗，进行检测。(3)统计学处理数据经SPSS10.0软件进行统计分析，以均数土标准差(刁±$)表示。所测数据均进行正态检验和方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，后用PostHocTests最小有意义差杲t检验(1eastsignificantdifference-t,LSD-t)进行均数间的多重比较。戶<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)脾脏T淋巴细胞内IL-2>IFN-y蛋白和mRNA表达EA组脾脏T淋巴细胞内IL・2和IFN・y蛋白表达,与Control组比较没有明显改变；手术创伤后脾脏IL・2利FN・y蛋口含量明显降低，Trauma组与Control组比较有显著性差异(P<0.001;Fig.1A)；创伤后给予电针处理后IL-2和IFN*蛋白含量明显增加，T+EA组与Trauma组比较有明显差异(P=0.002;Fig.lA)。EA组脾脏丁淋巴细胞内IL・2和IFN・ymRNA表达，与Control组比较无明显变化；手术创伤后脾脏IL・2和IFN・ymRNA表达明显降低，Trauma组与Control组比较有明显差异(P<0.001)；创伤后给予电针处理后增加IL・2和IFN*mRNA表达，T+EA组与Trauma组比较有显著性差异(P=0.008;Fig.IB)。

10□IFN-y30ControlEATraumaT+EA□IL.2□IFN-y84o.o.01―1―___l—1—_―1ControlEATraumaT+EAFig.l创伤后3天大鼠脾脏T淋巴细胞内IL・2和IFN-y蛋白表达(2)脾脏T淋巴细胞内ERK1/2、NF-zcB和AP・1表达EA组脾脏T淋巴细胞内total-ERKl/2及p-ERKl/2表达，与Control组比较无明显差异；total・ERKl/2在Trauma组和T+EA组也没有显著性变化，但其磷酸化ERK1/2(p-ERKl/2)的表达在Trauma组明显降低，与Control组比较有统计学差异(戶<0.001)；给予电针处理后磷酸化ERK(p-ERKl/2)的表达明显增加，T+EA组与Trauma组比较有显著性差异(P<0.001;Fig.2A)o脾脏丁淋巴细胞内NF-/cB和AP・1的DNA连接活性，EA组与Control组比较，无明显差异;Trauma组比Control组明显降低(P<0.001)；与Trauma组相比，T+EA组NFwB和AP-1的DNA

11连接活性明显降低,两组间比较有统计学差异(P<0.001;Fig.2B)O

12p-ERKtotal-ERK□p-ERKj*|3-actin□total-ERK43-actinB-actin5OO.2.81.6□NF-kB口c-FosFig.2创伤后3天大鼠脾脏丁淋巴细胞内ERK1/2、NF-zcB和AP・1的表达讨论.46O本实验结果表明，手术创伤后3天大鼠脾脏T淋巴细胞内IL-2>IFN-y蛋白和mRNA表达降低，同时p-ERK1/2>NF・kB和AP-1DNA连接活性也伴随减低，电针刺“足三里”和“阑尾"穴能够增加IL-2、IFN-y蛋口和mRNA表达，同时也增加p・ERKl/2、NF-/cB和AP-1DNA连接活性，这些结果表明，电针刺在提高创伤后大鼠脾脏T细胞内IL・2、IFN-y表达和ERK1/2信号通路活性及其下游核转录因子NF+B、APJ表达上存在内在的机制联系。

13手术创伤模型是模拟临床外科大手术及腹腔探查术而建立的，能诱导T细胞及NK细胞活性的显著抑制⑸，可作为一种免疫抑制模型可以被用来探讨术后免疫调节机制。术后3天大鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力最弱，IL・2活力和含量最低，表明免疫抑制最明显出现在术后3天⑹。因此，本实验仅选择单个时间点（术后3天）来研究电针刺的免疫调节功能及其信号转导机制。研究证实，外科手术能广泛抑制机体多种免疫功能，包括对T淋巴细胞、巨噬细胞的影响和细胞因子的产生。这充分表明手术改变多种免疫系统功能⑺。实验观察到，创伤大鼠淋巴细胞转化功能、IL-2诱生活性降低，这表明手术创伤抑制免疫细胞因子产生[8]oIL-2对维持免疫功能起着重要作用。创伤后IL・2诱生活性降低将直接导致机体细胞免疫功能的下降[9]oIFN-y是另外一个介导细胞免疫功能的关键因子。在手术创伤后，大鼠脾脏T细胞中IL-2蛋白和mRNA表达明显降低，最低水平出现在术后3天[10J1]o脾脏组织中IFN*蛋口和mRNA表达在创伤后也出现降低趋势[1233]o我们的实验结果也有同样表明，在手术创伤后3天，大鼠脾脏T细胞内IL-2、IFN-y蛋白和mRNA的表达明显降低。动物实验表明，电针刺“足三里''和“阑尾''穴能明显改善创伤诱导的免疫抑制[14][，4]o对大鼠手术创伤模型的观察指出，在相当于人体“足三里”穴部位，每日予以电针刺激，可以提高创伤机体IL・2活性水平，改善免疫抑制状态，促进创伤机体免疫功能的恢复[6]oYuetal[15J6J报道针刺“足三里”穴可显著提高脾组织H4FN-Y水平。本实验结果也进一步证实，手术创伤导致免疫功能降低的大鼠，予以电针刺可通过提高脾T

14细胞内IL・2利FN-丫的含量，激活其免疫功能。为了阐明电针刺对细胞因了基因表达的调控机制，我们进一步探讨ERK1/2信号通路在这一过程中的作用。MAPK信号通路磷酸化后一个主耍的结果就是使MAPK信号通路下游的核转录因子（如NFwB和AP・1）活化。然后NF・kB和AP-1调节参与免疫和炎症反应的各种基因表达［17'18］o持久激活的ERK可部分转入核内，在核内聚集后，使相应的转录因子磷酸化，通过Elk・l活化AP・1组成元件c・Fos、Fra-1和Fra-2DNA连接活性［⑼彳。】及nF・kB家族的c-Rel核转位，以此來上调IL・2的表达。实验表明，创伤岀血后ERK1/2信号通路活性降低，NF-/cB和AP-1DNA连接活性也受到抑制0忑］。本实验结果表明，在手术创伤后3天，大鼠脾T细胞内ERK1/2活性降低，NF・kB和AP・1DNA连接活性也降低，予以电针治疗后ERK信号通路活性有所提高，NF-kB和AP-1DNA连接活性也显著增加。这些新的发现提示我们，ERK1/2信号通路可能是电针刺发挥免疫调节作用的分子机制之一。总之，电针刺“足三里"和“阑尾，'穴可以提高创伤大鼠脾脏T细胞内IL・2、IFN-y蛋白和mRNA表达，改善术后免疫抑制状态。这种保护作用与捉高ERK1/2、NF-kB和AP・1活性密切相关。这一发现对于理解电针刺免疫调节机制和临床应用具有重要意义。参考文献1.WangJ,WangYQ,YuJ,CaoXD,WuGC.Electroacupuncturesuppressessurgicaltraumastress-inducedlymphocyteapoptosisinrats.NeuroscienceLetters2005;383:68-72.

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