酵素催化水解反应

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1、酵素催化水解反應萃取橘子皮的酯化酵素進行位置專一的酯水解反應一、實驗目的：酵素催化在有機合成課程中是很重要的課題，由於酵素催化反應具高轉換率及高度立體專一的特性，近年來普遍用於不對稱合成，且已獲致相當好的結果，使得仿生合成儼然成為有機合成的一種新潮流。本實驗以橘子皮分離出來的酯化酵素，進行位置專一性的酯水解反應，並觀察其活性，使學生能學習從天然物萃取出的酵素，進而對酵素催化的原理有一定的認識。二、實驗方程式：OOOCCOCH3+CH3OHOCH2OHOCOCH3orOrangepeelH3COOOesteraseCOH+CH3COHOCH3三、實驗

2、原理：酵素催化反應依所使用的酵素類型可區分為:1、氧化還原酵素（Oxidoreductases）2、傳遞酵素（Transferases）3、水解酵素（Hydrolases）4、分解酵素（Lysases）5、異構酵素（Isonerases）6、結合酵素（Ligases）酵素的活性可藉測量其化學變化而測定之，如連續追蹤反應過程，可發現反應速率很快降低，可能由於受質與生成物的平衡，pH值改變或生成物對酵素的抑制。溫度的影響：~1~酵素催化水解反應溫度每增10℃，約可使反應速率增加一倍，但也使酵素因變性而致失去活性，在此情形下，最適溫度決定於反應時間。

3、pH值影響：酵素的接觸活性在一狹窄的pH範圍，大部分酵素的最適pH值在5~7間，在此pH值下呈最穩定狀態，一般以緩衝溶液控制其pH值穩定。受質的影響：在固定條件下，反應速率決定於酵素與受質的濃度，Michaelis&Menten假定酵素（E）與受質（S）先形成一複合體（ES），然後再轉變成生成物與酵素。E+S→ES→P+E以豬肝酯化酵素（PLE）為例，受質先與酵素的活性位置結合形成複合體，再由其上的親核基攻擊完成水解。圖一為豬肝酯化酵素（PLE）的Serine活性位置，＊PLE（豬肝酯化酵素）之立體專一性:HL：大的親水性結合點SerPBHS：小

4、的親水性結合點HLHSPF：前端極性基結合點PB：後端極性基結合點PFSer：活性位置SerOOOH3CO~2~酵素催化水解反應OSerH3COO圖一O其中HL為大的親水性結合點，HS為小的親水性結合點，PF為前端極性基結合點，PB為後端極性基結合點。具對位取代受質，芳香環可置於HL，－OCOR’置於Serine活性位置，R’位於HS，主要產物為（圖二2）。而若為鄰位取代受質，則芳香環可置於HS，R’位於HL，－COOR置於Serine活性位置，主要產物為（圖二3）。由於受質不同，酵素催化可選擇水解其中一個酯基，由此證實酵素催化的專一性。一般以4~

5、6個學生為一組並用相同的羥基苯甲酸，但每位學生使用不同的試劑，這樣便可合成一系列的雙酯衍生物，接著每一種雙酯以橘子皮酯化酵素（粗萃取物）、買來的豬肝酯化酵素（PLE）以及PorcinePancreatic水解酵素（PPL）進行酵素催化水解反應並以薄膜層析法偵測水解產物、測定水解速率，進而比較每種酵素催化的專一性。OOOCCOCH3+CH3OHOCH2OHO？？？COCH3orOrangepeelH3COOOesteraseCOH+CH3COHOCH3四、實驗步驟：1、雙酯的合成：羥基苯甲酸在酸催化下與不同的醇反應便可合成單酯，其中對位及間位產物為固

6、體可以再結晶純化之，鄰位產物為液體以減壓蒸餾純~3~酵素催化水解反應化，羥基苯甲酸之醯化反應可於氫氧化鈉水溶液中，0℃下快速加入合適的醯氯化合物製得，所有產物均為固體以再結晶純化，產率一般為20~50%，如圖二所示。圖二雙酯的合成可利用單酯在比啶中，加入合適的醯氯化合物迴流1小時，以水終止反應，主要產物為液體，產率一般為60~90%，如圖三1所示。純度可以氫核磁共振光譜（H-NMR）檢定之。圖三~4~酵素催化水解反應2、橘子皮萃取物的製備：每位同學用刀子刮下一顆橘子皮，合起來的橘子皮加到50~60毫升的50mM內含2.3%氯化鈉的檸檬酸鈉緩衝溶液（

7、pH=5.5），在混均器中2分鐘直到為勻相，將此混合物放在12,000轉速的離心機內離心10分鐘，橘色的上層澄清液倒入燒杯中，將此萃取液放在冰浴儲存，可保存至少24小時。3、酵素催化水解反應的分析：同學們先準備合適的薄膜層析沖堤系統，用以分開雙酯（4）、單酯（2）及醯化後的酸（3），一般以乙酸乙酯/石油醚，二氯甲烷或二氯甲烷/10%甲醇當成沖堤液，接著將0.1克的雙酯溶於5毫升丙酮配製下列各組:A：0.1毫升的雙酯（4）+0.9毫升50mM檸檬酸鈉緩衝溶液（pH=5.5）B：0.1毫升的雙酯（4）+0.9毫升橘子皮萃取物C：0.1毫升的雙酯（4）+

8、0.9毫升豬肝酯化酵素儲存液（1.0單位/毫升於50mM磷酸鉀溶液，pH=7.0）D：0.1毫升的雙酯（4）+0.9毫升P