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分类号：R331.31学校代码：10392学科专业代码：071003学号：2110101593福建医科大学硕士研究生毕业论文异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制ProtectiveEffectandMechanismofIsoliquiritigeninonDiabeticCardiomyopathyRats学位类型：理学硕士所在学院：基础医学院研究生：黎心四学科、专业：生理学导师：方秋娟教授余靖研究起止日期：2012年9月至2014年3月答辩日期：2014年6月6日2014年6月1 2 目录英文缩略词................................................................................4中文摘要....................................................................................6Abstract.....................................................................................8前言..........................................................................................11材料..........................................................................................14方法..........................................................................................17结果..........................................................................................25讨论..........................................................................................41结论..........................................................................................47参考文献..................................................................................48致谢..........................................................................................53糖尿病心肌病的研究进展......................................................543 英文缩略词英文缩略词英文全称中文名称STZstreptozotocin链脲佐菌素ISOIsoliquiritigenin异甘草素DMDiabetesmellitus糖尿病DCDiabeticcardiomyopathy糖尿病心肌病TGtriglyceride甘油三酯TCHcholestenone胆固醇HDL-CHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白LDL-Clowdensitylipoprotein低密度脂蛋白HbA1cglycosylatedhemoglobin糖化血红蛋白HRHeartRate心率LDVPLeftventriculardiastolicpressure平均左心室舒张压LVSPLeftventricularsystolicpressure平均左心室收缩压LVP+dp/dtmaxLeftventricularpeaksystolicvelocity左心室最大收缩速度LVP-dp/dtmaxLeftventricularpeakdiastolevelocity左心室最大舒张速度ASTAspartateaminotransferase天门冬氨酸氨基转移酶MDAMalondialdehyde丙二醛SODSuperOxideDismutase超氧化物歧化酶GSHGlutathione还原型谷胱甘肽GSH-PXGlutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶CATCatalase过氧化氢酶GLUT-1Glucosetransporter1葡萄糖转运体1GLUT-4Glucosetransporter4葡萄糖转运体44 IGF-1Insulin-likegrowthfactor1胰岛素样生长因子1AKTProteinkinaseB蛋白激酶BTNF-αTumornecrosisfactorα肿瘤坏死因子αERKExtracellularsignal-regulatedkinase胞外信号调节激酶pAKTPhosphorylationproteinkinaseB蛋白激酶2ECLElectro-Chemi-Luminescence化学发光液PVDFpolyvinylidenedifluoride聚偏二氟乙烯PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟TABTAKbindingproteinTAK结合蛋白5 中文摘要异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制第一部分大鼠糖尿病心肌病实验模型制备及其评价目的：采用链脲佐菌素制备实验性糖尿病心肌病模型及其评价。方法：雄性SD大鼠60只，体重200±10g，随机分2组(n=30)：正常对照组（CON），糖尿病组(DM)。CON组腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.2，5ml/kg）；模型组腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60mg/5ml/kg）。72h后测血糖，1W内随机3次血糖值≥16.7mmol/L入选模型组。2组大鼠各分3批（n=10），分别1,2-丙二醇（5ml/kg·d）灌胃10d、30d或60d。实验前禁食12h，描记心电图，左心室插管测大鼠左心室血流动力学参数（HR、LVSP、LVDP、LVP±dp/dtmax）。结果：与同一时间的CON组比较，DM组血糖增加（P0.05），体重、LVSP、LVP±dp/dtmax下降（P0.05）。结论：大鼠腹腔注射60mg/kgSTZ可制备糖尿病心肌病模型，表现为大鼠血糖升高，体重低下，左心室收缩、舒张功能下降。第二部分异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制目的：探讨异甘草素（Isoliquiritigenin，ISO）对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制。方法：雄性SD大鼠50只，体重200±10g，分CON组（n=10）和DM组（n=40）。DM组大鼠上述DM模型制备后，随机分4组（n=9~10）：DM对照组（DM）、不同剂量异甘草素处理组（ISO50、ISO100和ISO200）。CON和DM大鼠以1,2-丙二醇（5ml/kg·d）灌胃60d，ISO50、ISO100和ISO200组大鼠分别以不同剂量ISO（50、100、200mg/kg·d，等容积1,2-丙二醇为溶剂)，每天1次，记录大鼠体重，连续60d。各组大鼠末次给药后，禁食12h，描记心电图，左心室插管测大鼠左心室血流动力学指标（HR、LVSP、LVDP、LVP±dp/dtmax）；腹主动脉取血，测血糖、血脂四项（TG、TC、LDL-C、HDL-C）、天门冬氨酸氨基转移++酶（AST）；取红细胞测Na-K-ATP酶；测血浆和心肌组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、还原型谷胱甘肽（GSH）、6 过氧化氢酶（CAT）；HE染色观察心肌组织学结构；Masson染色观察心肌组织纤维化；透射电镜检查心肌细胞超微结构；免疫印迹检测心肌GLUT-1、GLUT-4、TNF-α、IGF-1、AKT和pAKT蛋白表达。结果：1、与CON组比较，DM组大鼠体重增长少；心电图心率减慢，心率变异度大；左心室血流动力学各参数（HR、LVSP、LVPdp/dtmax）降低（P0.05）；血糖升高（P0.05）；血脂四项（TG、TC、LDL-C、HDL-C）无明显差别（P>0.05）；++血浆AST升高（P0.05）；红细胞测Na-K-ATP酶活性降低（P0.05）；血浆SOD、CAT活性降低（P0.05）；心肌组织MDA增多（P0.05）、GSH-PX和GSH减少（P0.05）；HE染色显示心肌组织学结构损伤；Masson染色显示心肌组织纤维化；透射电镜检查心肌细胞超微结构显示，心肌细胞肌原纤维、线粒体结构异常；免疫印迹检测显示GLUT-1、GLUT-4表达减少（P0.05），TNF-α表达增加（P0.05）、AKT表达减少（P0.05）。2、与DM组大鼠比较，ISO适宜剂量组大鼠体重增长多（P0.05）；心率回升，心率变异度减小；左心室血流动力学参数（LVPdp/dtmax）回升（P0.05）；血糖无明显改变（P>0.05）；血脂TG、LDL-C增高（P0.05）、TC、HDL-C降低++（P0.05）；血浆AST降低（P0.05）；红细胞测Na-K-ATP酶活性升高（P0.05）；血浆SOD活性升高（P0.05）；心肌组织MDA减少（P0.05）、GSH-PX回升（P0.05）；HE染色显示心肌组织学结构损伤减轻；Masson染色显示心肌组织纤维化减少；透射电镜检查心肌细胞超微结构显示，心肌细胞肌原纤维、线粒体结构维持接近正常；免疫印迹检测显示GLUT-4表达回升（P0.05），TNF-α表达减少（P0.05）。结论：大鼠1次大剂量注射STZ饲养60天，可制备糖尿病心肌病模型表现为大鼠体重低下，心肌酶漏出，心肌功能、代谢、结构异常；适宜剂量异甘草素可保护糖尿病心肌病大鼠，改善体重增长，维持心肌功能、代谢、结构正常，其机制与增加心肌GLUT-4表达、减少心肌TNF-α蛋白表达有关。关键词：糖尿病；糖尿病心肌病；心肌保护；异甘草素；大鼠模型7 AbstractProtectiveEffectandMechanismofIsoliquiritigeninonDiabeticCardiomyopathyRatsPartOne:PreparationandEvaluationofDiabeticCardiomyopathyModelbyStreptozotocinObjective:PreparationandevaluationofexperimentalDiabeticcardiomyopathymellitusmodelbystreptozotocin.Methods:60Sprague-Dawleyrats,weighing200±10g,allmales.wererandomlydividedinto2groups(n=30).Normalcontrolgroup(CON),diabeticmellitusmodelgroup(DM).Normalcontrolgroupwereinjectedwithcitricacid-sodiumcitratebuffer(pH4.2,5ml/kg),modelgroupwereinjectedwithstreptozotocin(STZ,60mg/kg),atotalof1times.Acid-sodiumcitratebufferissolventofSTZ,testbloodsugarafter72h,random3timesaweek,bloodglucose≥16.7mmol/Lwasselectedinthemodelgroup.ControlandDMgrouporallywith1,2-propanediol(5ml/kg.d),eachdividedinto3groups(n=10):gavage10d,30d,60d;Beforetheexperiment,fastingtherats12h,Surfaceelectrocardiogram(ECG)tracings;measurementsofLeftVentricularhemodynamicsindexes(HR,LVSP,LVDP,±dp/dtmax)byLeftVentricularIntubation;Results:10d,30d,60dDMgroupthanControlgroupthebloodglucosesignificantlygrowth(P<0.05);theHR,LVDP,LVP±dp/dtmax,bodyweight,significantlydecreased(P<0.05).Conclusion:LargeinjectedwithstreptozotocincanpreparedDiabeticcardiomyopathymellitusmodel,bloodglucosesignificantlygrowth,inducemyocardialinjuryinratsandleftventricularfunction.Parttwo:ProtectiveEffectandMechanismofIsoliquiritigeninonDiabeticCardiomyopathyRatsObjective:Toexploretheprotectiveeffectandmechanismofisoliquiritigenin8 onexperimentalDiabeticcardiomyopathymellitusrats.Methods:50Sprague-Dawleyrats,weighing200±10g,allmales.wererandomlydividedinto5groups.Afterdiabeticcardiomyopathymellitusmodelgroupestablish.Modelgroupwererandomlydividedintofourgroups(n=9~10):themodelgroup(DM),isoliquiritigenin(ISO)treatmentgroups(ISO50,ISO100andISO200):ControlandDMgrouporallywith1,2-propanediol(5ml/kg•d),isoliquiritigenintreatmentgroupstreatedwithdifferentdosesofISO(50mg/kg•d,100mg/kg•d,200mg/kg•d),allgavage60d.1,2-propanediolissolventofISO.Beforetheexperiment,fastingtherats12h,Surfaceelectrocardiogram(ECG)tracings;measurementsofLeftVentricularhemodynamicsindexes(HR,LVSP,LVDP,±dp/dtmax)byLeftVentricularIntubation;Abdominalaorticbloodmeasuredthelevelsoractivityoffourlipids(TG,TC,LDL-C,HDL-C),aspartateaminotransferase(AST),take++measurementsoferythrocyteNa-K-ATPenzyme,measuredinplasmaandthemyocardialtissuemalondialdehyde(MDA),superoxidedismutase(SOD),glutathioneperoxidase(GSH-PX),reducedglutathione(GSH)andcatalase(CAT);HEstainingofmyocardialhistology;Massonstainingofmyocardialfibrosis;western-blotdetectionofmyocardialGLUT-1,GLUT-4,TNF-α，IGF-1,AKT,andpAKTproteinexpression.Results:LeftventricularbloodflowinDMratsdynamicsindicators(HR,LVSP,LVDPandLVP±dp/dtmax)wassignificantlylowerthantheCONgroup(P<0.05);lipidsTGandLDL-CwassignificantlyhigherthanCONgroup(P<0.05),lipidsTCHontherisecomparedtotheCONgroup;plasmaindicatorsCAT,SOD,tissue++GSH,GSH-PX,erythrocyteNa-K-ATPenzymesignificantlylower(P<0.05)thantheCONgroup;plasmaAST,GSH-PX,tissueMDA,CATrisecomparedwithCONgroup(P<0.05);immunoblottingdetected,comparedwiththeCONgroup,themyocardialtissueDMgrouppAKTandTNF-αproteinexpressionincreased(P<0.05),AKT、GLUT-4andGLUT-1proteinexpressionreduction(P<0.05).HEstainingDMmodelgroup,myocytedisarray,dissolvedstatecytoplasm,thecellgapwidened,myocardialfibrosisobvious.Isoliquiritigenintreatedventricularhemodynamics±dp/dtmaxcomparedwithDMgroup,+dp/dtmaxwassignificantlyincreasedcomparedwithDMgroup(P<0.05),low-doseISO(50mg/kg·d)treatment9 group(ISO50group)-dp/dtmaxsignificantlyincreasedcomparedwithDMgroup(P<0.05);inthehigh-doseISO(100mg/kg·d,200mg/kg·d)treatmentgroup(ISO100,ISO200group)lipids(TG,LDL-C)comparedwithDMsignificantlyincreasedgroup(P<0.01),ISO5O,ISO200grouplipids(TCH)wassignificantlyreduced(P<0.05)comparedwithDMgroup;erythrocyteNa+-K+-ATPenzymecomparedwithDMgroupontherise,andtheISO200grouperythrocyteNa+-K+-ATPenzymeincreasedsignificantlycomparedwithDMgroup(P<0.05);plasmaSODupwardtrendcomparedwithDMgroupandDMgroupthanISO100significantlyincreased(P<0.05);plasmaGSH-PX,ISO200groupthanintheDMgroupdecreased(P<0.05);isoliquiritigeninmyocardialtissueMDAtreatmentgroupwassignificantlylowerthantheDMgroup(P<0.01);tissueGSH,ISO50groupcomparedwithanincreaseofDMgroup(P<0.05);myocardialtissueCAT,ISO200groupthanintheDMgroupdecreased(P<0.05);immunoblotdetectionofmyocardialISOtreatedgroupcomparedwiththeDMgroup,pAKT,TNF-αproteinexpressionwasdecreased(P<0.05);GLUT-4,ISO100andISO200groupshistoneexpressionincreased(P<0.05).HEstainingISOtreatedcardiachistologicalstructurerecoverytrend,andrestorenear-normalhigh-dosegroup;MassonstainingISOtreatedtoreducemyocardialfibrosis;transmissionelectronmicroscopeobservationshowedthatISOgroupimprovedtrend,andISO100grouprecoverynormal.Conclusion:LargedosesofdiabeticcardiomyopathymodelSTZprepareddiastolicleftventricularsystolicfunctiondecreasedmyocardialinjury,increasedmyocardialfibrosis,myocardialmetabolism.ISOfortheDiabeticcardiomyopathyhasaprotectiveeffect;improvemyocardialcontractilityinratdiabeticcardiomyopathyanddiastolicfunctionandreducemyocardialinjuryandfibrosis.Itsprotectionmechanismisoliquiritigenininhibitmyocardialoxidativestress,improvemyocardialcellmetabolism,mayreductionpAKTandTNF-αproteinexpression;increaseGLUT-4proteinexpression.Keywords:DiabetesMellitus;DiabeticCardiomyopathy;MyocardialProtection,Isoliquiritigenin;RatModel10 前言一、糖尿病心肌病近年来，糖尿病的发病率逐年增高，流行病学研究显示，继发于糖尿病的心血管并发症已成为糖尿病患者死亡的主要原因。70%糖尿病人死于心血管疾病【1】【2】，预期寿命减少。糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DC）是糖尿病患者主要心脏并发症。早期研究发现，血糖代谢正常者心力衰竭发病率为3.2%，【1】而糖代谢异常者和糖尿病患者心力衰竭发病率分别是6.0%和11.8%。糖尿病心肌病，早期表现为心肌顺应性降低和舒张功能不全，晚期以收缩功【3】【4】能不全为主，最终发展为心力衰竭、心律失常，甚至猝死。心脏多普勒检查发现，无高血压和冠心病的2型糖尿病患者中，约60％存在心室舒张功能减【5】低。有研究显示，糖尿病心肌病早期收缩功能障碍最早出现在模型成功复制6【6】周以后。心室间隔厚度和左心室重量增加的1型糖尿病患者随着基础糖化血【7】红蛋白(GHb)的降低，室间隔厚度和左室重量可有所恢复。糖尿病心肌病是糖尿病患者特有的心肌损伤，目前尚无专门针对糖尿病心肌病的治疗药物。豆科植物甘草(GlycyrrhizaRoot或GlycyrrhizaUralensisFisch)是一味重要的传统中药，是中医临床使用率最高的药材之一，有“十方九草”之说。【8】章红英从《千金要方》等9部经典医著中归纳了275味治疗糖尿病的常用中【9】药，按用药频率高低排序，甘草居诸药之首。张山广等发现《太平圣惠方》收载的消渴证方药所用药物（167味）中，甘草应用频率居前3位。二、甘草类药物在糖尿病治疗中应用研究甘草是治疗糖尿病及其并发症最常用的中药之一。现代研究表明，甘草类药【10】【11】【12】【13】【14】物可改善糖尿病及其并发症，其可能机制包括：改善糖脂代谢；【15】抑制α-葡萄糖苷酶的活性；与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ配体结合，提高机体对胰岛素的敏感性【15】【17】；抑制醛糖还原酶的活性，改善糖尿病神经病变【17】【18】【19】和糖尿病肾病；清除自由基，抗脂质过氧化，抑制氧化诱导的内皮细胞凋亡，抑制炎症介质表达，抗血小板聚集，保护糖尿病引起的血管内皮失能和【20】【21】【22】【23】【24】血管并发症；抑制系膜纤维化，改善糖尿病肾病等。三、异甘草素药理活性异甘草素(isoliquiritigenin，ISO)是从中药材甘草中提取分离得到的黄酮类化11 合物，在肉豆盆(肉豆盆科)、红血膝(豆科)、板蓝根(十字花科)等11种药用植物中也存在，其分子结构属于羟基查耳酮类化合物。它在甘草中的含量非常微量,平均占万分之七左右,但它的生物活性较强,具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗糖尿病并发症等活性,由此成为药学界的研究热点之一。图1异甘草素（isoliquiritigenin，ISO）分子结构1、抗肿瘤作用【25】异甘草素可以抑制致癌剂的致癌作用。KimSC等报道异甘草素通过抑制Bad易位于线粒体，降低细胞色素C的表达，减少多聚聚合酶的清除，实现其对【26】镉诱导细胞凋亡的保护作用。IwashitaK等证实了异甘草素可诱导小鼠黑色素瘤细胞系细胞的凋亡，其作用机制是阻止葡萄糖的跨膜转运和促进Bax的表达。2、抗氧化作用【27】章道华等以CCl4诱导大鼠急性肝损伤模型，发现异甘草素对大鼠肝损伤具有保护作用，其机制与清除肝组织中的自由基和抗脂质过氧化有关。3、抗炎作用异甘草素作为甘草黄酮类物质中的一种单体成分，可抑制上皮细胞中TNF-α诱导的活性氧ROS生成，阻止、TNF-α诱导的血管细胞黏附分子VCAM-1和E-选择蛋白mRNA的积累，减弱肿瘤坏死因子TNF-α诱导的血小板-内皮细胞黏【28】【29】附分子的表达，治疗炎症反应。具有类似阿司匹林抗血小板聚集作用，可抑制环氧合酶，减少凝血栓烷A2(TXA2)。异甘草素可抑制上皮细胞中TNF-α诱导的活性氧ROS生成，阻止、TNF-α诱导的血管细胞黏附分子VCAM-1和E-选择蛋白mRNA的积累，减弱肿瘤坏死[30]因子TNF-α诱导的血小板-内皮细胞黏附分子的表达，治疗炎症反应。4、其他作用[31]异甘草素具有类似阿司匹林抗血小板聚集作用，可抑制环氧合酶，减少凝血栓烷A2(TXA2)。炙甘草水提物和甲醇提取物RLW和RLE可以抑制高糖12 [32]诱导的人肾脏系膜细胞增殖和基质聚集。异甘草素也有类似作用，可用于防[33]治糖尿病肾病系膜纤维化和肾小球硬化。1-20mM异甘草素共孵育3天可以剂量依赖地在转录水平抑制高糖培养的肾小球系膜细胞胶原分泌表达增加，使高糖引起的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达骤降得以回升，抑制高糖引起的组织型MMP-2抑制剂（TIMP-2）的表达增加,促进系膜基质降解，其机制可能是阻滞了TGF-β1-SMAD信号通路的转导。然而，异甘草素对糖尿病心肌病是否具有保护作用及其机制尚未见研究报道。本研究采用大鼠腹腔注射大剂量链脲佐菌素（STZ），建立大鼠糖尿病心肌病模型及评价方法，观察不同剂量异甘草素对糖尿病心肌病大鼠保护效应及机制，为异甘草素应用防治糖尿病心肌病提供实验和理论依据。13 材料1动物清洁级Sprayue-Dawley(SD)大鼠60只(福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(闽)2010-0001)，体重200±10g，雄性。2实验器材与药品试剂2.1实验器材表1实验器材多道生理信号采集处理系统成都仪器厂RM6240BD型压力换能器YPJ01H型成都仪器厂聚乙烯导管PE50、PE10美国BectonDickinson公司低速台式离心机TDL-40B上海安亭科学仪器厂台式酸度测定仪PH213HANNAinstruments超低温冰箱MDF-382E三洋电器公司冷冻离心机美国热电公司酶标仪Elx800BioTek公司医用超声波清洗器KQ-250E昆山市超声仪器有限公司雪花制冰机XB70GRANT公司双头磁力加热搅拌器HJ-2常州国华电器有限公司电子天平BP221德国Sartorius电子天平T2000德国Sartorius漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司生物安全柜HFsafe1200上海力申科学仪器有限公司低速台式离心机TDL-40B上海安亭科学仪器厂倒置显微镜CKX41日本奥林巴斯株式会社紫外分光光度仪DN-1000美国NanoDrop公司电泳仪北京六一仪器厂湿转槽北京六一仪器厂水平电泳槽北京六一仪器厂14 塑料封接机SF-300江苏连云港微波电器厂脱色摇床WD-9405A北京六一仪器厂水平摇床WD-9405B北京六一仪器厂三诺安稳血糖仪长沙三诺生物传感技术有限公司ImageQuantLAS4000mini凝胶成像仪美国GE公司2.2药品试剂表2药品试剂苦味酸广东台山粤侨试剂有限公司异甘草素Sigma公司链脲佐菌素Sigma公司1,2-丙二醇上海试剂总厂NaCl西垅化工股份有限公司NaOH西垅化工股份有限公司水合氯醛天津市致远化学多聚甲醛天津市大茂化学试剂厂柠檬酸天津市大茂化学试剂厂柠檬酸三钠天津市大茂化学试剂厂超氧化物歧化酶试剂盒南京建成生物工程研究所丙二醛试剂盒南京建成生物工程研究所天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒南京建成生物工程研究所谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒南京建成生物工程研究所还原型谷胱甘肽试剂盒南京建成生物工程研究所过氧化氢酶试剂盒南京建成生物工程研究所++Na-K-ATP酶试剂盒南京建成生物工程研究所甘油三酯试剂盒浙江东瓯生物有限公司低密度脂蛋白浙江东瓯生物有限公司高密度脂蛋白浙江东瓯生物有限公司总胆固醇浙江东瓯生物有限公司15 伊红染液碧云天生物技术研究所Masson染液南京建成生物工程研究所组织防脱载玻片江苏省海门神鹰实验器材厂显微镜载玻片海门市世泰实验器材制造有限公司甲叉双丙烯酰胺北京经科公司丙烯酰胺上海生工生物BCA蛋白定量试剂盒碧云天生物技术研究所RIPA裂解液碧云天生物技术研究所PMSF碧云天生物技术研究所SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)碧云天生物技术研究所一抗稀释液碧云天生物技术研究所二抗稀释液碧云天生物技术研究所ECL发光液碧云天生物技术研究所一抗兔抗大鼠AKTSantaCruz公司一抗兔抗大鼠TNF-α凯基生物一抗兔抗大鼠pAKTSantaCruz公司一抗鼠抗大鼠β-actinSantaCruz公司二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgGSantaCruz公司二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgGSantaCruz公司一抗兔抗大鼠GLUT-4Millpore公司一抗兔抗大鼠GLUT-1Millpore公司一抗鼠抗大鼠IGF-1Millpore公司Tris-baseBiosharp公司SDSBiosharp公司甘氨酸Biosharp公司PVDF膜Biosharp公司甲醇天津博迪化工股份有限公司二甲苯衡阳市凯信化工有限公司无水乙醇天津市福晨化学试剂厂16 2.3试剂配制30%Acr-Bis(29:1)：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g、ddH2O定容至100ml；37℃加热溶解，过滤，4℃避光保存。1MTris-HCl8.8：Tris-base30.29g、ddH2O200ml；1mol/LHCl调pH值至8.8，ddH2O定容至200ml。1MTris-HCl6.8：Tris-base30.29g、ddH2O200ml；1mol/LHCl调pH值至6.8，ddH2O定容至200ml。10%SDS：SDS10g、ddH2O100ml；55℃加热溶解，室温保存。10%AP：过硫酸铵1g、ddH2O定容至10ml。1×电泳缓冲液：Tris-base3.03g、甘氨酸18.8g、SDS1g、ddH2O定容至1L；4℃保存。1×转膜缓冲液：Tris-base3.03g、甘氨酸14.4g、甲醇200ml、Tween-202ml、ddH2O定容至1L；4℃保存。10×TBS：NaCl80g、Tris24.2g，ddH2O至990ml，用浓盐酸调PH至7.6，加ddH2O定容到1L；4℃保存。1×TBST：10×TBS100ml、Tween-201ml，ddH2O定容至1L；4℃保存。封闭液：TBST2ml、脱脂奶粉1g、ddH2O定容至20ml；4℃保存。0.1M柠檬酸溶液：柠檬酸10.505g,ddH2O定容至500ml。0.1M柠檬酸三钠溶液：柠檬酸三钠14.706g,ddH2O定容至500ml。柠檬酸缓冲液（PH4.2）：0.1M柠檬酸溶液31.5ml,柠檬酸三钠溶液18.5ml。方法第一部分大鼠糖尿病心肌病实验模型制备及其评价1.1大鼠糖尿病心肌病模型制备清洁级雄性SD大鼠60只，体重200±10g，随机分2组(n=30)：CON组、DM组。CON组腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.2，5ml/kg）；DM组腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60mg/kg，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为溶剂）1次，72h后测血糖，1W内随机3次血糖≥16.7mmol/L入选DM组。CON组、DM组各随机分3组(n=10)，分别饲养10d、30d、60d，每日灌以1，2-丙二醇5ml/kg1次，记录体重。17 1.2检测大鼠心功能大鼠实验前禁食12h，腹腔注射10%水合氯醛4ml/kg。采用RM6240BD型多道生理信号采集系统描记大鼠体表心电图1min，量化分析HR和ST偏移程度。大鼠记录心电图后，经右颈总动脉行左心室插管，RM6240BD型多道生理信号采集系统记录左心室内压10min（采样频率3kHz），量化分析左心室血流动力学指标（HR、LVSP、LVDP、LVP±dp/dtmax）。第二部分异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制2.1制备大鼠糖尿病心肌病及不同剂量异甘草素（ISO）干预实验模型清洁级雄性SD大鼠50只，(200±10)g，随机分2组：CON组(n=10)，DM组（n=40）。适应性喂养1W，禁食12h，CON组腹腔注射0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5ml/kg；DM组腹腔注射STZ60mg/kg。注射后72h剪尾、采血测血糖，DM组大鼠1W内随机血糖至少3次≥16.7mmol/L的，入选DM大鼠。入选的DM大鼠继续随机分4组(n=9~10)：DM对照组(DM)，低、中、高剂量异甘草素干预组（ISO50、ISO100、ISO200）。上述CON、DM对照组大鼠均灌服1,2-丙二醇溶液（5mL/kg），ISO50、ISO100、ISO200组大鼠分别灌服含异甘草素50、100、200mg/kg的等容积1,2-丙二醇溶液，每天1次，连续60d。2.2检测大鼠心功能实验前禁食12h，腹腔注射10%水合氯醛4ml/kg。采用RM6240C型多道生理信号采集系统描记大鼠体表心电图1min，量化分析HR和ST偏移程度。大鼠记录心电图后，经右颈总动脉行左心室插管，RM6240C型多道生理信号采集系统记录左心室内压10min（采样频率3kHz），量化分析左心室血流动力学指标。大鼠左心室测压后留取左心室心肌，分成3份液氮保存，留做相关检测。2.3检测大鼠血脂四项2.3.1甘油三酯(TG)TG与水在脂蛋白酯酶的作用下生成甘油，后者与ATP在甘油激酶作用下生成甘油磷酸，进而与O2生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林生成醌亚胺，紫色醌亚胺色泽强度与甘油三酯成比例。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血清甘18 油三酯含量。2.3.2总胆固醇(TCH)血清中胆固醇酯与H2O在胆固醇脂酶作用下生成胆固醇，胆固醇与O2在胆固醇氧化酶作用下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林生成醌亚胺。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血清总胆固醇(TCH)含量。2.3.3高密度脂蛋白(HDL-C)2+磷钨酸盐与Mg做沉淀剂能沉淀血清中的LDL、VLDL和CM，上清液中只含有HDL，用酶法测定其中上清液胆固醇含量，即血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶作用下生成胆固醇，胆固醇与O2在胆固醇氧化酶作用下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林生成醌亚胺。用总胆固醇减去上清液中胆固醇，即得高密度脂蛋白的含量按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血清高密度脂蛋白(HDL-C)含量。2.3.4低密度脂蛋白(LDL-C)用聚乙烯硫酸盐选择性沉淀血清中低密度脂蛋白，上清液中只含有极低密度与高密度脂蛋白。用总胆固醇减去上清液中胆固醇，即得低密度脂蛋白的含量。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血清低密度脂蛋白(LDL-C)含量。++2.4检测大鼠红细胞Na-K-ATP酶ATP酶存在于红细胞的膜上，ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠红++细胞Na-K-ATP酶活2.5检测大鼠血浆心肌酶及氧化抗氧化代谢指标2.5.1天门冬氨酸氨基转移酶（AST）AST能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆AST含量。2.5.2丙二醛（MDA）过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆MDA19 含量。2.5.3超氧化物歧化酶（SOD）通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色使测定管的吸光度低于对照管的吸光度值，可计算出SOD活力，按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆SOD活性。2.5.4谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）GSH-PX可以促进过氧化氢（H2O2）与GSH反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应所引起的速度来表示，测定此酶促反应中还原性谷胱甘肽的消耗，则可算出酶的活力。按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆GSH-PX活性。2.5.5还原型谷胱甘肽（GSH）GSH可与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成一种黄色化合物，可在405nm下进行比色定量测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量，按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆GSH含量。2.5.6过氧化氢酶（CAT）CAT分解H2O2可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm出测定其生成量，可计算CAT活力，按照试剂盒说明书操作，并计算大鼠血浆CAT活性。2.6检测大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH、CAT取2.2留取的心肌标本制备心肌组织匀浆，取上清测定蛋白浓度，取等量蛋白上清液稀释至所需浓度。按照试剂盒说明书操作（原理方法同上述2.4~2.5），++计算心肌匀浆MDA、GSH含量及SOD、GSH-PX、CAT、Na-K-ATP酶活性。2.7检测大鼠心肌组织学结构取2.2留取的大鼠心肌标本，4％多聚甲醛固定24h，70％、80％、90％、95％、95％、100％和100％酒精各6min脱水，两缸二甲苯各20min透明，三缸石蜡各30min浸蜡，最后一缸石蜡包埋组织，蜡块4℃保存，5μm切片，50℃展片，4℃冰箱保存备用。20 2.7.1HE染色观察心肌组织学结构60℃烤箱烤片2h，取切片入二甲苯两缸各1min脱蜡；100％、100％、95％、95％、90％、80％和70％酒精各30s，自来水1min，蒸馏水1min复水；苏木素染色30s，自来水充分冲洗，上架泡水5min；1％盐酸酒精分色数秒钟，自来水充分返蓝；伊红染色30s，梯度酒精脱水,70％、80％、90％、95％、95％、100％和100％酒精各30s。二甲苯两缸各1min，中性树胶封片拍照观察。2.7.2Masson染色观察心肌纤维化程度60℃烤箱烤片2h，取切片入二甲苯两缸各1min脱蜡；100％、100％、95％、95％、90％、80％和70％酒精各30s，自来水1min，蒸馏水1min复水,核染液染色1min,倒掉，冲洗液冲洗30s左右，浆染液染色30~60s左右，倒掉，冲洗液冲洗30s左右，1％盐酸酒精分色数秒钟，弃去分色液，蓝色复染液染色5min左右，倒掉，无水乙醇冲洗干净，吹干后，直接用无毒环保封固剂封片、镜检。按照试剂盒说明书操作。2.8透射电镜观察大鼠心肌细胞超微结构32.8.1取材大鼠心肌左心室标本，切成1mm大小。2.8.2前固定3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1MPBS(pH7.2)4℃数天（2h以上），0.1MPBS(pH7.2)漂洗3次。2.8.3后固定1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾4℃1.5h；0.1MPBS(pH7.2)漂洗3次。2.8.4脱水50%酒精10min，70%酒精饱和醋酸铀染液4℃过夜，90%酒精10min，90%酒精-丙酮10min，90%丙酮10min，无水丙酮10min（3次）。2.8.5浸透无水丙酮+环氧树脂618包埋剂（1:1）1.5h，纯618包埋剂35℃3h。2.8.6包埋、聚合35℃12h，45℃12h，60℃3d。2.8.7修块、半薄切片、定位2.8.8切片、染色用LeicaUC-6型超薄切片机切成100nm的超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5～15min，蒸馏水水洗。2.8.9PHILIPSEM208型透射电镜下观察并拍照21 2.9WesternBlotting检测GLUT-4、GLUT-1、IGF-1、AKT、TNF-α和pAKT蛋白表达2.9.1测定蛋白浓度用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，步骤如下：①配制适量BCA工作液，50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)，充分混匀。BCA工作液室温条件下可稳定24h。②稀释蛋白标准品，终浓度为0.5mg/ml。取10μl用ddH2O稀释至100μl，。③稀释后的蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl依次加到96孔板的标准品孔中，各孔加ddH2O补足20μl。④加1μl样品到96孔板的样品孔中，每个样品做1个副空，加ddH2O19μl。⑤各孔加200μlBCA工作液，37℃放置30min。2⑥测定A570，根据标准曲线(R≥0.99)计算出蛋白浓度。2.9.2提取心肌组织细胞总蛋白冰上操作，步骤如下：①留取的心肌组织标本，液氮充分研磨。②100mg心肌组织加500μlRIPA(强)全细胞裂解液。③移入1.5mlEP管，冰上裂解20min，4C16000g/min离心15min。④取上清液为总蛋白。⑤取1μl上清液测细胞总蛋白含量。⑥其余上清液加1/5体积5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，-20℃保存。2.9.3免疫印迹分析心肌组织蛋白表达量免疫印迹分析（WesternBlottingAnalysis）心肌组织全细胞蛋白，具体步骤如下：①制胶：根据目的蛋白分子量，确定分离胶浓度（表），配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶（表），双蒸水覆盖。常温下放置30min，待分离胶与双蒸水之间形成清晰界面时，倒去双蒸水并用滤纸小心吸干。配制并加入5%浓缩胶（表5），至玻璃板口，立刻将梳子轻轻插入，避免气泡。约20min后，凝胶聚合。②上样：将凝胶放入电泳槽。缓慢加入电泳缓冲液，排净胶底部气泡，小心22 拔出梳子，冻存的蛋白样品，沸水中煮沸1min，微量进样器进样。每孔上样蛋白量50～100μg。③电泳：SDS-PAGE胶80V恒压电泳，至溴酚蓝刚跑出时结束电泳。④转膜：电泳结束后，拆卸玻璃板。将凝胶取出，切去浓缩胶，制作转移“三明治”。恒流300mA，转移50～120min，将蛋白转移至PVDF膜上。⑤封闭：PVDF膜置封闭液中摇床上摇动封闭2h（室温）。⑥杂交：将一抗用一抗稀释液稀释至适当浓度，均匀覆盖PVDF膜，摇床上摇动孵育2h（室温）或过夜（4℃）。⑦二抗结合：用TBST洗膜4次，每次10min。将二抗用二抗稀释液稀释至适当浓度，均匀覆盖PVDF膜，摇床上摇动孵育2h。⑧化学发光、显影、定影：用TBST洗膜4次，每次10min。用保鲜膜将PVDF膜包裹好，PVDF膜与ECL化学发光试剂反应30s。表3SDS-PAGE分离胶浓度SDS-PAGE分离胶浓度蛋白分子量8%30-90KD10%20-80KD12%12-60KD15%10-40KD表4分离胶配制方法不同浓度分离胶配制方法SDS-PAGE成分（10ml）分离胶浓蒸馏水30%Acr-bis1MTris,pH10%SDS10%APTEMED度(29:1)8.88%3.32.73.80.10.10.00610%2.73.33.80.10.10.00412%2.04.03.80.10.10.00415%1.05.03.80.10.10.00423 表55%SDS-PAGE浓缩胶配制方法5%SDS-PAGE浓缩胶配制方法SDS-PAGE成分（4ml）浓缩胶蒸馏水30%Acr-bis1MTris,pH10%SDS10%APTEMED(29:1)6.85%2.70.670.50.040.040.0043统计学处理采用SPSS17.0统计分析软件，计量资料数据检验正态性和方差齐性。若数据呈正态且方差齐，用均数±标准差(xs)描述。多组间均数比较采用多样本单因素方差分析，两两组间均数比较采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。24 结果1大鼠糖尿病心肌病实验模型制备及评价1.1大鼠生长情况及空腹血糖大鼠饲养60天期间，CON组大鼠一般生长情况良好，体重逐渐增加；与CON组比较，DM组大鼠食量和尿量增多，明显消瘦，体重增加少（P<0.05），血糖增高（P<0.05~0.01）（表6，图2）。提示大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ,60mg/kg）造成大鼠糖尿病，表现为大鼠血糖升高、消瘦，体重不增。表6大鼠体重增长和血糖情况（n=10）组别饲养天数体重增长空腹血糖（d）（比率）（mmol/L）CON0.18±0.025.3±0.610**DM0.13±0.0810.4±2.1CON0.42±0.056.4±0.530***DM0.12±0.1019.9±1.6CON0.59±0.066.5±0.260***DM0.05±0.0421.8±1.3*P<0.05,**P<0.01vsCON图2大鼠体重增长和血糖（n=10）***P<0.05,P<0.01vsCON1.2大鼠心功能1.2.1大鼠体表心电图检测大鼠体表心电图（图3），结果表明：与CON组比较，DM组ST段呈25 压低趋势；心率趋低，其中DM组饲养60d后心率降低有统计学意义（P<0.05）。提示糖尿病大鼠心率降低。500ControlControl.03DMDM400.02300*ST(mv).01HR(bpm)2000.00100-.01010d30d60d10d30d60d图3大鼠饲养10d、30d和60d心电图ST和HR（n=10）*P<0.05vsCON1.2.2大鼠在体左心室血流动力学参数大鼠左心室插管记录大鼠左心室压力(图4)，分析在体左心室血流动力学参数（图5），结果表明：与CON组比较，DM大鼠HR和LVDP无明显差别（P>0.05）,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低（P<0.05），提示DM组大鼠心脏舒张收缩功能降低。说明腹腔注射链脲佐菌素（STZ,60mg/kg）制备的糖尿病大鼠，饲养10~60d期间，心脏收缩、舒张功能呈下降性变化。图4大鼠饲养10d、30d和60d检测左心室内压波形26 图5大鼠饲养10d、30d、60d在体左心室血流动力学各参数（n=10）***P<0.05,P<0.01vsCON2不同剂量异甘草素对糖尿病心肌病大鼠保护效应及机制2.1不同剂量异甘草素对DM大鼠生长情况的影响观察大鼠饲养60d期间体重增长情况（图6），结果表明，CON组大鼠生长良好，体重增长多；DM组大鼠食量和尿量增多，明显消瘦，体重增长少。与饲养60d的DM比较，ISO不同剂量组体重增加（P<0.05）。提示糖尿病造成大鼠27 体重增长低下，不同剂量异甘草素可改善糖尿病大鼠体重增长。图6ISO对DM大鼠体重增长和增长百分数影响（n=9~10）*#P<0.05vsCON；P<0.05vsDM2.2不同剂量异甘草素对DM大鼠心功能影响2.2.1大鼠体表心电图描记分析大鼠体表心电图，结果表明：与CON组比较，DM组ST段压低，心率下降；ISO不同剂量组大鼠ST段和心率有回复正常趋势（表7，图7）；分析大鼠心率30s期间心率变异度发现（图8），与CON组比较，DM组心率变异度大；与DM组比较，ISO不同剂量组大鼠心率较平稳。提示糖尿病大鼠心电不稳，不同剂量异甘草素有助于糖尿病大鼠心电稳定。表7ISO对DM大鼠ST、HR影响（n=9~10）组别ST（mv）HR(bpm)CON0.02±0.01384.77±72.34*DM0.00±0.02217.80±31.53##ISO500.05±0.03332.41±45.50ISO1000.01±0.04268.47±61.35ISO2000.00±0.02221.50±65.10*##P<0.05vsCON；P<0.01vsDM28 图7ISO对DM大鼠ST、HR影响（n=9~10）*##P<0.05vsCON;P<0.01vsDCM图8ISO对DM大鼠心率变异度影响2.2.2大鼠在体左心室血流动力学各参数左心室插管记录大鼠左心室压力（图9），分析血流动力学各参数（表8、图10），结果表明：各组大鼠HR、LVDP无明显差别（P>0.05）；与CON组比较，DM组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低（P<0.05），提示DM组心脏收缩、舒张功能下降；与DM组比较，ISO不同剂量组大鼠左心室收缩、舒张功能有恢复趋势，其中+dp/dtmax恢复好（P<0.01）。提示不同剂量异甘草素可改善糖尿病大鼠心脏收缩、舒张功能。29 图9ISO对DM大鼠左心室内压影响表8ISO对DM大鼠左心室血流动力学各参数影响（n=9~10）HRLVSP+dp/dtmaxLVDP-dp/dtmax组别(bpm)(mmHg)(mmHg/s)(mmHg)(mmHg/s)CON357±9484±97009±623-1.8±2.3-6442±1107******DM302±4062±74901±4463.1±2.3-5173±247###ISO50323±6270±96200±3585.8±4.2-5937±409##ISO100296±10667±66304±5784.8±4.5-5237±381##ISO200299±5163±126496±2215.1±3.2-5126±608**###P<0.01vsCON;P<0.01,P<0.01vsDM30 图10ISO对DM大鼠左心室内压影响（n=9~10）**###P<0.01vsCON;P<0.01,P<0.01vsDM2.3不同剂量异甘草素对DM大鼠血糖的影响大鼠饲养60d，测各组大鼠空腹血糖（图11），结果显示，与CON组比较，DM组大鼠血糖高（p>0.05）；与DM组比较，异甘草素不同剂量组血糖无差别（p>0.05）。提示不同剂量异甘草素对糖尿病大鼠血糖无影响。图11ISO对DM大鼠血糖的影响（n=9~10）31 2.4不同剂量异甘草素对DM大鼠血脂影响检测大鼠血脂四项TG、TCH、HDL-C、LDL-C（表9，图12），结果表明，与CON组比较，DM组TG和LDL-C下降、TCH和HDL-C上升，但无统计学意义（p>0.05）。与DM组比较，ISO不同剂量组TG和LDL-C回升，TCH和HDL-C下降（P<0.05~0.01）。提示不同剂量异甘草素可影响糖尿病大鼠脂代谢。表9ISO对DM大鼠血脂影响（n=9~10）组别TG(mmol/L)TCH(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)CON0.39±0.160.62±0.161.17±0.220.21±0.06DM0.23±0.070.68±0.241.33±0.180.09±0.02###ISO500.40±0.190.40±0.191.09±0.160.33±0.08#####ISO1001.51±0.290.66±0.130.88±0.160.375±0.10#####ISO2000.63±.200.38±0.110.92±0.270.40±0.14###P<0.05,P<0.01vsDM图12ISO对DM大鼠血脂四项的影响（n=9~10）###P<0.05,P<0.01vsDM++2.5不同剂量异甘草素对DM大鼠红细胞Na-K-ATP酶活性影响++检测红细胞Na-K-ATP酶活性（表10，图13），结果显示：与CON组比32 ++较，DM组Na-K-ATP酶活性降低（P<0.05）；与DM组比较，ISO不同剂量组++红细胞Na-K-ATP酶活性增高（P<0.05）。提示糖尿病大鼠红细胞能量代谢降低，不同剂量异甘草素可保护大鼠红细胞的能量代谢。++表10ISO对DM大鼠红细胞Na-K-ATP酶活性影响（n=9~10）++组别Na-K-ATP酶活性(ummolPi/GHb/hour)CON145±20*DM76±10#ISO50147±29#ISO100191±47#ISO200155±34*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM++图13ISO对DM大鼠红细胞Na-K-ATP酶的影响（n=9~10）*P<0.05vsCON，#P<0.05vsDM2.6不同剂量异甘草素对DM大鼠血浆AST的影响检测大鼠血浆天门冬氨酸氨基转移酶（AST）（表11，图13），结果表明，与CON组比较，DM组AST增高（P<0.05）；ISO不同剂量组AST回降（P<0.05）。提示糖尿病大鼠心肌损伤，心肌酶AST漏出；不同剂量异甘草素可减轻糖尿病大鼠心肌损伤，减少心肌酶漏出。表11ISO对DM大鼠血浆AST的影响（n=9~10）组别AST(U/L)CON20±6*DM49±29ISO5030±16#ISO10024±10#ISO20024±6*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM33 图14ISO对DM大鼠血浆AST、LDH的影响（n=9~10）*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM2.7不同剂量异甘草素对DM大鼠血浆MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT的影响检测大鼠血浆MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT（表12，图15），结果显示：各组大鼠血浆MDA、GSH差别无统计学意义。与CON组比较，DM组SOD、CAT活性降低（P0.05），GSH-PX升高（P0.05）。与DM组比较，ISO不同剂量组SOD活性有回升趋势，其中ISO100组升高有统计学意义（P0.05）；GSH-PX回降，其中ISO200组降低有统计学差异（P0.05）；CAT无明显差异（P>0.05）。提示糖尿病大鼠血浆抗氧化活性下降，不同剂量异甘草素可一定程度维持大鼠血浆抗氧化活性。表12ISO对DM大鼠血浆MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT的影响（n=9~10）MDASODGSH-PXGSHCAT组别（nmol/mgprot）(U/mgprot)(U)(umol/gprot)(mgprot/ml)CON2777±12114.2±1.811.7±2.2816±251179±31***DM2144±5680.9±0.614.2±0.9958±16078±11ISO502691±16163.8±2.514.1±0.9744±25190±42#ISO1002717±14845.1±2.413.7±0.61210±17871±16#ISO2003482±10232.2±1.812.3±0.7842±7264±20*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM34 图15ISO对DM大鼠血浆各成分的影响（n=9~10）*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM2.8不同剂量异甘草素对DM大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT的影响检测大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT（表13，图16），结果显示：与CON组比较，DM组MDA、CAT升高（P<0.05）、GSH-PX和GSH降低（P<0.05）；SOD呈降低趋势，但无统计学意义（P>0.05）。与DM组比较，ISO不同剂量组MDA回降（P<0.05），SOD、GSH-PX和GSH呈回升趋势，CAT呈回降趋势。提示糖尿病大鼠心肌组织存在氧化损伤，异甘草素可减轻心肌组织氧化损伤。35 表13ISO对DM大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH、CAT影响（n=9~10）组别MDASODGSH-PXGSHCAT（nmol/mgprot）(U/mgprot)(U)(umol/gprot)(mgprot/ml)CON294±562.2±0.45.0±2.51.8±0.021.1±3.3******DM473±521.1±0.53.5±1.10.9±0.032.0±9.6###ISO50214±540.7±0.45.0±1.51.4±0.231.5±6.5##ISO100156±251.5±1.54.0±0.60.98±0.030.9±4.1###ISO200252±431.4±0.94.1±1.11.1±0.120.3±4.9***###P<0.05vsCON，P<0.01vsCON，P<0.05vsDM，P<0.01vsDM图16ISO对DM大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH、CAT影响（n=9~10）***###P<0.05,P<0.01vsCON;P<0.05,P<0.01vsDM2.9不同剂量异甘草素对DM大鼠心肌组织结构的影响2.9.1HE染色观察大鼠心肌组织学结构36 HE染色观察大鼠心肌组织学结构（图17），结果表明，CON组心肌组织细胞排列整齐，核染均匀，细胞间隙正常，无炎症细胞浸润，血管内皮完整；DM组心肌细胞排列紊乱，胞质疏松，核染加深，细胞间隙增宽，炎症细胞浸润，血管内皮不完整，红细胞溢出；ISO不同剂量组心肌组织学结构有恢复趋势，其中ISO100和ISO200组恢复较好。图17ISO对DM大鼠心肌组织学结构影响2.9.2Masson染色观察大鼠心肌组织胶原纤维Masson染色观察大鼠心肌组织学结构（图18），结果表明，CON组心肌细37 胞间隙阳性蓝色物质（胶原纤维）少；与CON组比较，DM组心肌细胞间隙阳性蓝色物质明显增多，提示心肌胶原纤维多，心肌纤维化明显；与DM组比较，ISO不同剂量组心肌细胞间隙阳性蓝色物质较少，提示心肌纤维化轻，其中ISO100、ISO200组接近正常。图18ISO对DM大鼠心肌组织纤维化影响38 2.9不同剂量异甘草素对DM大鼠心肌细胞超微结构影响透射电子显微镜观察大鼠心肌细胞超微结构（图19），结果表明：CON组心肌细胞超微结构正常，胞质浓密，各种细胞器清晰可见。肌原纤维排列整齐，Z线、M线清晰，肌小节明显清晰可见，肌丝完整。线粒体丰富，境界清晰，膜完整，基质浓密，嵴密集可见。核膜清晰完整、无肿胀。DM组心肌细胞膜破坏，线粒体溢出，胞质疏松。肌原纤维排列紊乱，Z线、M线模糊，肌丝溶解、断裂；线粒体固缩，嵴和膜结构不清；核周池肿胀。与DM组比较，ISO不同剂量组心肌细胞超微结构改善，胞质较浓密，各种细胞器较清晰。肌原纤维排列较整齐，肌小节较清晰，Z线可见；线粒体丰富，边界清楚，嵴密集可见；核周池肿胀减轻。其中ISO100组心肌细胞超微结构恢复较好。图19ISO对DM大鼠心肌细胞超微结构影响39 2.10不同剂量异甘草素对DM大鼠心肌组织GLUT-4、GLUT-1、TNF-α、IGF-1、AKT和pAKT蛋白表达的影响Westernblotting检测心肌组织GLUT-4、GLUT-1、TNF-α、IGF-1、AKT、ERK和pAKT蛋白表达，结果显示：与CON组比较，DM组GLUT-1、GLUT-4蛋白表达减少（P<0.05）；与DM组比较，ISO100和ISO200组GLUT-4蛋白表达增多（P<0.05）（图20）。提示糖尿病大鼠心肌组织葡萄糖转运体1，4表达减少，异甘草素可增加糖尿病大鼠心肌组织GLUT-4表达。图20ISO对DM大鼠心肌组织GLUT-1和4蛋白表达的影响*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM与CON组比较，DM组TNF-α蛋白表达增多（P<0.05）；与DM组比较，ISO不同剂量组TNF-α蛋白表达减少（P<0.05）。IGF-1各组无统计学意义（图21）。提示糖尿病大鼠心肌组织TNF-α表达增加，异甘草素可减少糖尿病大鼠心肌组织TNF-α表达。图21ISO对DM大鼠心肌组织TNF-α和IGF-1蛋白表达的影响*###P<0.05vsCON；P<0.05,P<0.01vsDM40 与CON组比较，DM组AKT蛋白表达减少（P<0.05）；与DM组比较，ISO100组AKT蛋白表达增加（P<0.05）。与CON组比较，DM组pAKT蛋白表达增多（P<0.05）；与DM组比较，ISO不同剂量组pAKT蛋白表达减少（P<0.05）（图22）。提示糖尿病大鼠心肌组织AKT蛋白表达减少、pAKT蛋白表达增多，而异甘草素可促进糖尿病大鼠心肌组织AKT蛋白表达、降低pAKT蛋白表达。图22ISO对DM大鼠心肌组织AKT和pAKT蛋白表达的影响*#P<0.05vsCON;P<0.05vsDM讨论一、糖尿病心肌病大鼠实验模型制备与评价糖尿病心肌病是糖尿病引起的心脏微血管病变和心肌组织代谢紊乱所致的心肌局灶性坏死。早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张功能不全，主要是舒张期充盈受阻；晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭。目前制备糖尿病动物模型的方法有自发性和诱发性两类。其中诱发性糖尿病动物模型制备主要【34】有外科手术法、化学物质诱导法、转基因糖尿病动物法等。许多模型制备方法复杂，重复性有限，费用高，不便于广泛应用。链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）是从链霉素中提取的抗生素。STZ在体【35】【36【37】内作用主要分3个阶段：第一阶段，通过降低糖无氧酵解、三羧酸循环和呼吸链的酶活性，影响胰岛素的分泌；第二阶段，胰岛β细胞发生核固缩、胞质破裂；第三阶段，胰岛β细胞数目显著减少，残存的β细胞合成和释放胰岛素的能力减低，致使胰岛素合成、分泌不足，造成高血糖。本研究采用一次大剂量腹腔注射STZ（60mg/kg）的方法制备大鼠糖尿病心41 肌病模型，注射STZ后10d、30d和60d检测血糖显示，模型组大鼠血糖明显升高（18~20mmol/L），达到正常水平（5~6mmol/L）3~4倍以上；此外模型组大鼠其食量、饮水量以及尿量明显增多，体重显著降低。心电图检测发现模型组大鼠心率降低，心律不齐，ST偏移量压低；大鼠在体心脏血流动力学检测发现，模型组大鼠左心室收缩、舒张功能下降。此外，本研究结果显示，与正常饲养60d的大鼠相比，注射STZ60d后的模++型组大鼠组大鼠红细胞Na-K-ATP酶活性下降、血浆心肌酶AST升高及SOD和CAT降低、心肌组织MDA升高而GSH-PX和GSH降低；大鼠心肌HE染色显示模型组大鼠组心肌组织学结构损伤；Masson染色显示模型组大鼠组心肌纤维化明显；心肌细胞透射电镜检查显示模型组大鼠组心肌细胞超微结构损伤。说明大鼠一次大剂量腹腔注射STZ（60mg/kg）后饲养60d，造成大鼠心肌代谢、功能、结构损伤。大鼠一次大剂量腹腔注射链脲佐菌素可制备大鼠糖尿病心肌病模型。二、异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应及机制1异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护效应糖尿病患者常伴有不能用高血压病、冠心病、心脏瓣膜病及其他疾病来解释的心肌疾病。临床表现早期类似限制性心肌病，后期与扩张型心肌病相近。糖尿病心肌病早期的标志是左室舒张功能不全，是由于房室的收缩不同步造成的，晚期舒张功能不全是由于胶原沉积，心肌纤维化所致。糖尿病晚期，将发展为收缩【38】[39]功能不全。本研究采用一次腹腔注射大剂量STZ（60mg/kg），导致大鼠血糖明显升高（18~20mmol/L）达正常血糖水平3~4倍以上，长期高糖环境造成心肌病，表现为心肌代谢、功能、结构异常。灌服适宜剂量异甘草素对糖尿病心肌病大鼠有保护效应，表现为改善大鼠体重增长，提高机体抗氧化、清除自由基能力，改善心肌代谢、功能、结构。2异甘草素对糖尿病心肌病大鼠的保护机制目前认为，心肌细胞代谢障碍、支配心肌的微小血管和自主神经功能紊乱、胰岛素抵抗及细胞因子等，都参与糖尿病心肌病的发生、发展。异甘草素是中药甘草有效成分甘草黄酮类中一种单体成分，具有抗氧化，清除自由基等作用。本研究实验结果提示，适宜剂量异甘草素可能通过以下机制介导对糖尿病大鼠心肌42 的保护：2.1异甘草素改善糖尿病大鼠心肌代谢糖尿病心肌病的主要病因是胰岛素作用减弱和高血糖。糖代谢紊乱和脂代谢紊乱是糖尿病患者心肌病变发生发展的重要因素。2.1.1异甘草素对糖尿病大鼠心肌糖代谢影响正常心肌供能约30％ATP来自于葡萄糖有氧氧化，约70％ATP来自于脂质氧化。糖尿病时，因葡萄糖利用障碍，脂质氧化供能由原来70％上升至90~100％，即心脏供能几乎完全依赖于脂肪酸氧化。糖尿病患者糖代谢紊乱主要表现为糖有氧氧化下降。心肌葡萄糖转运体(giucosetransporter，GLUT)主要存在于心肌细胞膜，少量存在于细胞内膜，正常情况下，当心肌葡萄糖摄入增加，胰岛素可使葡萄糖转运体从细胞内膜转位至肌膜和细胞膜，通过添充葡萄糖转运体数量协助心肌摄取葡萄糖，加速葡萄糖转运，形成心肌葡萄糖动态供给平衡。但糖尿病患者体内血糖过高，一方面，葡萄糖转运体受到环境改变的影响，活性减弱，转运系统出现运转缺陷，减少了葡萄糖的跨膜转运，可直接影响心肌葡萄糖的摄取和利用；另一方面，胰岛素无法充分利用，妨碍葡萄糖转运体的转位和聚集，可起运转作用的葡萄糖转运体数量明显减少；葡萄糖转运体数量和质量的降低，导致心肌细胞【40】【41】的能量代谢失衡，最终引起糖尿病心肌病。葡萄糖-脂肪酸循环学说认为，当脂肪氧化增加时，抑制葡萄糖的氧化；同样，葡萄糖氧化增加，抑制脂肪酸的氧化,，两者之间存在代谢竞争。心肌脂肪酸氧化的增强与血浆游离脂肪酸水平增加和心肌细胞对葡萄糖摄取能力的减退有关。转运葡萄糖进入细胞是心肌中葡萄糖氧化的主要限速步骤,，这一过程依赖细胞膜上特定转运蛋白GLUT4完成，膜上GLUT4数量越多，外源性葡萄糖被摄取的量随之升高、氧化率增加。因此，细胞葡萄糖氧化速率由GLUT4在心肌细胞膜上的表达量决定。GLUT-1是一种含492个氨基酸的单一多肽链糖蛋白，其基本结构由l2个跨膜片断相连，通过构象改变转运细胞内外的蛋白。GLUT1是已知分布最广泛的【42】葡萄糖转运蛋白，在脑、血脑屏障、心肌、脂肪组织、骨骼肌中的表达量较高。细胞糖代谢的第一道限速步骤是葡萄糖摄入，受多方面调控，GLUT1和4的调43 节就是其中关键环节。GLUT1调节主要分为快调节和慢调节。快调节主要是将细胞内所贮存的GLUT1分子囊泡转运到细胞膜上，并与之融合，使GLUT1固定于细胞膜上，从而发挥其转运葡萄糖功能，GLUT1在此过程不需要重新合成，在糖代谢前期即可完成，称为快调节。慢调节主要通过GLUT1的合成增加或GLUT1的降解减少来增加GLUT1的数量，此过程需要重新合GLUT1，在糖代【43】【44】谢后期才可完成，故称为慢调节。有研究发现糖尿病患者红细胞葡萄糖的【45】摄入主要由GLUT1介导。胰岛素抵抗时，葡萄糖转运体1和4活性下降造成葡萄糖向内的跨膜转运减少，心肌细胞摄取的葡萄糖量降低。本研究Westernbloting检测心肌组织GLUT-1、GLUT-4，结果显示：糖尿病心肌病大鼠GLUT-1和4表达减少；ISO100、ISO200组GLUT-4表达增加。提示，糖尿病大鼠糖代谢紊乱与GLUT-4和GLUT-1减少有关；适宜剂量异甘草素可增加心肌组织GLUT-4表达，减轻糖尿病心肌损伤。2.1.2异甘草素对DM大鼠损伤心肌脂质代谢影响糖尿病患者胰岛素分泌减少及胰岛素抵抗，均可导致脂质代谢活跃。心肌细胞对脂质氧化供能依赖增加，尤其是三酰甘油和游离脂肪酸。游离脂肪酸氧化增加产生的代谢产物聚积，可激活细胞凋亡程序，促进心肌细胞凋亡；同时游离脂肪酸利用的增加加重了心肌耗氧量，导致心脏负担加重，当游离脂肪酸持续增加，而无法被充分利用时，脂滴颗粒在心肌内大量积聚，引起心肌细胞内酶活性受抑，低密度脂蛋白氧化增高但不能被低密度脂蛋白受体识别，不能正常降解，从而导致经氧化修饰的低密度脂蛋白在体内淤积严重，损伤心肌细胞，导致心功能下降【46】【47】[48【49】。本研究检测血脂四项TG、TCH、HDL-C、LDL-C，结果表明，与正常饲养60天的大鼠比较，糖尿病大鼠的血脂四项变化都无统计学意义（p>0.05），其中胆固醇（TCH）呈增高趋势；而甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）呈降低趋势，HDL-C呈升高趋势，与预期结果相反。可能与一次大剂量注射STZ（60mg/kg）后，大鼠高血糖60天，导致大鼠过度消瘦、营养不良、能量耗竭有关，且在饲养过程中，所喂养的饲料喂普通饲料，不是高脂高糖有关，导致大鼠营养不良，过度消耗自身脂质和糖等营养物质所致。其结果有待进一步明确探索。本研究观察不同剂量异甘草素对糖尿病60天的大鼠脂代谢影响，结果显示，44 不同剂量异甘草素影响上述糖尿病造成的大鼠脂代谢变化，表现为回升甘油三酯（TG），降低胆固醇（TCH）、回降胆固醇（TCH）、回降低密度脂蛋白（LDL-C），且有统计学意义（p<0.05~0.01）。其效应机制有待进一步明确研究。2.1.3异甘草素对糖尿病心肌病大鼠氧化/抗氧化代谢影响糖尿病时机体自由基代谢异常。自由基是是在外层电子轨道上含有单个不配对电子的原子、原子团和分子的总称。自由基的化学性质极为活泼，易于失去电子（氧化）或得到电子（还原），特别是其氧化作用强。生理情况下，氧自由基的生成通常是在严格的调控下进行的。需氧生物都有一整套完善的自由基清除系统，使自由基的生成和清除处于动态平衡。当自由基的生成和清除的动态平衡遭到破坏，即自由基生成增多，和（或）自由基清除减少，自由基在体内大量堆积，【50】【51】必将造成组织结构损伤。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是膜脂质过氧化最重要的产物之一，是氧化应激的标志物，测定MDA可了解膜脂质过氧化的程度；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）催化超氧阴离子的歧化反应，保护细胞不受毒性氧自由基的损伤，是防御活性氧的第一道防线；过氧化氢酶（catalaseCAT）广【52】泛存在于体内各组织中，主要功能是催化过氧化氢分解为水和氧；谷胱甘肽（glutathione，GSH）可通过其巯基氧化-还原态的转换，作为可逆的供氢体，主【53】要在细胞内的水相提供抗氧化保护。而高血糖可导致还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核(NADH/NAD)比例增加，GSH减少，内皮细胞对H2O2损害的易感性增加；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）主【54】要功能在于清除各种生物大分子的过氧化物。本研究检测大鼠血浆MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT，结果表明，糖尿病大鼠血浆SOD降低（P0.05）；而适宜剂量异甘草素可提高糖尿病大鼠血浆SOD（P0.05），说明糖尿病大鼠抗氧化代谢降低，适宜剂量异甘草素可保护糖尿病大鼠抗氧化代谢。本研究同时检测大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、GSH和CAT，结果表明，糖尿病大鼠心肌组织MDA升高（P<0.05）、GSH-PX降低（P<0.05）；适宜剂量异甘草素可降低糖尿病大鼠心肌组织MDA（P<0.05），提高GSH-PX（P<0.05）。提示糖尿病大鼠心肌氧化损伤，而适宜剂量异甘草素可减轻心肌组织氧化损伤。45 2.2异甘草素保护糖尿病大鼠细胞、减少心肌损伤、防止心肌纤维化2.2.1异甘草素减轻糖尿病大鼠细胞损伤，减少心肌酶漏出谷草转氨酶（AST/GOT）是一种重要的转氨酶。谷草转氨酶又名天门冬氨酸转氨酶。正常情况下，谷草转氨酶存在于组织细胞中，心肌细胞中含量最高，其次为肝脏，血清中含量极少。血清中AST升高，提示心肌梗死或心肌炎。本研究检测大鼠血清AST发现，糖尿病大鼠血清AST增高（P<0.05），适宜剂量异甘草素可降低糖尿病大鼠血清AST。说明糖尿病大鼠细胞损伤，心肌酶漏出，适宜剂量异甘草素可保护细胞，防止心肌细胞损伤。++2.2.2异甘草素保护糖尿病大鼠红细胞Na-K-ATP酶活性++++Na-K-ATP酶存在于大多数动物细胞的细胞质膜中。研究发Na-K-ATP酶不仅是主动跨膜转运钠钾离子的载体蛋白，而且可作为内源性洋地黄物质的受体，在质膜上与邻近蛋白之间相互作用，并在细胞内组装信号转导复合物，引发信号转导级联反应，从而介导内源性洋地黄物质，增加心脏和血管的收缩性，促【55】++进正常细胞肥大或增殖，促进肿瘤细胞凋亡。Na-K-ATP酶正常活性对维持细胞正常代谢、功能、结构至关重要。++本研究检测大鼠红细胞Na-K-ATP酶，结果表明，糖尿病大鼠红细胞++++Na-K-ATP酶活性降低（P<0.05），而适宜剂量异甘草素可保护红细胞Na-K-ATP酶活性（P<0.05）。提示糖尿病大鼠红细胞能量代谢障碍，适宜剂量异甘草素可保护糖尿病大鼠红细胞能量代谢，有利于机体细胞供氧，而保护细胞。2.2.3异甘草素减轻糖尿病大鼠心肌组织纤维化，保护心肌收缩舒张功能本研究Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化情况，结果显示，糖尿病造成大鼠心肌组织胶原纤维增多；而适宜剂量异甘草素可减少糖尿病引起的大鼠心肌组织胶原纤维的增加。提示糖尿病引起大鼠心肌组织纤维化，适宜剂量异甘草素可防止心肌组织纤维化，保护糖尿病大鼠的心肌收缩舒张功能。2.2.4异甘草素对糖尿病大鼠心肌组织TNF-α表达影响肿瘤坏死因子α（TNF-α）可抑制GLUT-4mRNA和蛋白质表达，减少葡萄糖利用，以浓度依赖性方式对心肌细胞产生负性肌力作用。本研究Westernblotting检测大鼠心肌组织TNF-α，结果表明，糖尿病大鼠心肌组织TNF-α蛋白表达增多（P<0.05），适宜剂量异甘草素可减少糖尿病大鼠心肌组织TNF-α蛋白46 表。提示异甘草素可通过抑制TNF-α表达，介导保护糖尿病大鼠心肌功能。2.2.4异甘草素对糖尿病大鼠心肌组织Akt表达影响Akt又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径。心肌细胞表达一氧化氮合酶（NOS），NOS是生成NO的限速酶，后者是磷脂酰肌【57】酵3激酶(P13K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号转导通路的下游效应分子。P13K可磷酸化肌醇环上的3位羟基，生成三磷酸磷脂酰肌醇，使Akt磷酸化后激活。Akt可激活一氧化氮和酶，促进心肌细胞合成NO，产生心肌保护作用。本研究Westernblotting检测大鼠心肌组织Akt表达，结果显示，提示糖尿病大鼠心肌组织AKT表达减少，而适宜剂量异甘草素可促进糖尿病大鼠心肌组织AKT表达。提示异甘草素可通过增加Akt表达，介导对糖尿病大鼠心肌的保护效应。结论1一次大剂量注射链脲佐菌素（STZ,60mg/kg）可制备大鼠糖尿病实验模型，该模型大鼠饲养60天可制备糖尿病心肌病大鼠模型，表现为大鼠体重低下，心肌酶漏出，心肌功能、代谢、结构异常。2适宜剂量异甘草素对糖尿病大鼠具有保护效应，表现为体重增长改善，红细胞能量代谢维持正常，氧化抗氧化代谢改善。3适宜剂量异甘草素对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。表现为保护糖尿病大鼠心肌收缩舒张功能，维持心电稳定；减轻心肌氧化损伤，减少心肌纤维化，保护心肌结构。其可能机制涉及：3.1异甘草素可提高心肌GLUT-4表达改善糖代谢。3.2异甘草素可改善机体氧化抗氧化代谢减轻心肌氧化应激。3.3异甘草素可通过抑制TNF-α表达介导保护糖尿病大鼠心肌舒缩功能。3.4异甘草素可通过增加Akt、抑制pAKT表达介导保护糖尿病大鼠心肌保护。47 参考文献【1】ThrainsdottirIS，AspelundT，ThorgeirssonG，eta1．Theassociationbetweenglucoseabnormalitiesandheartfailureinthepopulation-basedReykiavikstudy[J]．DiabetesCare.2005，28：612-616．【2】SowersJR,EpsteinM,FrohichED.Diabetes,hypertension,andcardiovasculardisease:anupdate[J].Hypertension,2001,37∶1053-1059.【3】FengB，ChenS，ChiuJ，eta1．Regulationofcardiomyocytehypertrophyindiabetesatthetranscriptionallevel[J]．AmJPhysiolEndocrinolMetab，2008，294：1119—1126．【4】GalderisiM.Diastolicdysfunctionanddiabeticcardiomyopathy;evaluationbyDopplerechocardiography[J].JAmCollCardiol,2006,48∶1548-1551.【5】PoirierP，BogatyP，GarneauC，eta1．Diastolicdysfunctioninnormotensivemenwithwell-controlledtype2diabetes：importanceofmaneuversinechocardiographicscreeningforpreclinicaldiabeticcardiomyopathy[J]．DiabetesCare，2001．24：5-10．【6】王先银，李树森，廖明松等,多普勒组织成像评价早期糖尿病心肌病左室收缩功能的实验研究[J].中国超声医学杂志，2003,19(6)：401-403【7】AepfelbacherFC，YeonSB，WeinrauchLA，eta1．Improvedglycemiccontrolinducesregressionofleftventricularmassinpatientswithtype1diabetesmellitus[J]．IntJCardiol．2004，94：47-51．【8】章道华，程吴，熊玉等．异甘草素对大鼠急性化学性肝损伤的保护作用[J]．中国医院药学杂志，2008.28(7)：511．【9】张山广,王金荣.《太平圣惠方》消渴证方药分析[J].河南中医,1994(4):236.【10】NAKAGAWAK,KISHIDAH,ARAINAOKI,etal.LicoriceFlavonoidsSuppressAbdominalFatAccumulationandIncreaseinBloodGlucoseLevelObeseDiabeticKK-AyMice[J].BiolPharmBull,2004,27(11):1775-1778.【11】AOKIF,HONDAS,KISHDAH.SuppressionbyLicoriceflavonoidsofabdominalfataccumulationandbodyweightgaininhigh-fatdiet-inducedobeseC57BL/6Jmice[J].BiosciBiotechnolBiochem,2007,71(1):206-214.【12】王小英,肖柳英,潘竞锵,等.甘草对抗D-半乳糖诱导大鼠糖尿病模型的实验研究48 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致谢光岁月如梭，如歌。转眼间，三年研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与欢笑也都尘埃落定。这三年的求学生活对于我的记忆，在于导师无微不至的关怀和教导，也在于不能很好完成导师交待任务的焦虑，在于和同学认真工作的场景，也在于生活里大家把酒言欢，在于失败时的沮丧，也在于成功时的欣喜………从对这座城市的陌生到熟悉，从青涩到成熟，这三年是一种积累，它给我带来太多的感动、感悟乃至成长。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、支持、帮助我的师长，亲友呈上我最诚挚的感谢与最美好的祝愿。衷心感谢我的恩师方秋娟教授在学习、工作及生活上给我的孜孜教诲、精心培养和悉心关怀。您严谨的治学精神，深厚广博的学术造诣，孜孜不倦的开拓进取精神，宽广的胸怀和坦荡的人格都深深感染着我，您的言传身教、谆谆教导、无微不至的关怀，让我在求学、工作和生活上都满载而归。在方秋娟教授的悉心指导和大力支持下我的硕士学习和科研课题才得以顺利完成。特别感谢吴枝娟老师和余靖老师！对实验的倾力帮助、支持和指导，使我在试验中少走很多弯路。感谢生理学与病理生理学系林默君教授、王瑞幸博士在学习和科研上给予精心的指导和热情的帮助；衷心感谢电镜室吴敏霞老师的热心帮助和支持。衷心地感谢何瑞岚、戴小燕师姐、连加辨师兄对我的鼓励和支持；感谢董婷师妹、高锐师弟对我的帮助。此外，同学屡屡相助,在各个方面都给了我莫大的帮助和支持，在此一并感谢。衷心地感谢胡莹师姐、李宝华师姐对实验给予的无私帮助，感谢教研室的王丹、王明月、王志和巢苹同学，舍友伍兵、李鹏同学，和你们同甘共苦的岁月永远难以忘怀，和你们三年来建立的友谊值得我永远珍惜。以及这三年来与我互勉互励的各位同学。三年来，我们朝夕相处，共同进步，感谢你们给予我的所有关心和帮助。同窗之谊，我将终生难忘。感谢我的家人和朋友在三年的学习中一直给予我默默的关怀，给予我最大的精神支持，成为我完成学业的坚强后盾。最后我要感谢参与我论文开题、评审和答辩的各位老师，他们给了我一个审视几年来学习成果的机会，让我能够明确今后的发展方向，他们对我的帮助是一笔无价的财富。53 糖尿病心肌病的研究进展黎心四（综述）方秋娟（审校）摘要：糖尿病心肌病是一种独立的糖尿病并发症，是糖尿病致死的主要原因，发病机制复杂，与能量代谢紊乱、细胞凋亡、氧化应激、心肌间纤维化、自主神经功能紊乱等因素有关。目前多种药物被证明有心肌保护作用，甘草的有效成分异甘草素对心血管疾病亦有多方面的益处，可望为糖尿病心肌病的防治提供新思路。关键词：糖尿病；糖尿病心肌病；异甘草素流行病学研究显示，近年来，糖尿病的发病率逐年增高，继发于糖尿病的心【1】血管并发症已成为糖尿病患者死亡的主要原因。70%糖尿病人死于心血管疾病,【2】预期寿命减少。糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DC）是糖尿病患者主要心脏并发症。早期研究发现，血糖代谢正常者心力衰竭发病率为3.2%，而【1】糖代谢异常者和糖尿病患者心力衰竭发病率分别是6.0%和11.8%。糖尿病心肌病，早期表现为心肌顺应性降低和舒张功能不全，晚期以收缩功【3】【4】能不全为主，最终发展为心力衰竭、心律失常，甚至猝死。心脏多普勒检查发现，无高血压和冠心病的2型糖尿病患者中，约60％存在心室舒张功能减【5】低。有研究显示，糖尿病心肌病早期收缩功能障碍最早出现在模型成功复制6【6】周以后。心室间隔厚度和左心室重量增加的1型糖尿病患者随着基础糖化血【7】红蛋白(GHb)的降低，室间隔厚度和左室重量可有所恢复。一糖尿病心肌病的发病机制（一）心肌细胞代谢障碍1糖代谢异常【8】Herrero等发现糖尿病患者心肌脂肪酸利用增加，葡萄糖氧化减少50%。有研究发现，与正常大鼠相比，自发性2型糖尿病（胰岛素引起）GK鼠心肌组【9】织中D-2，3葡萄糖的摄取减少50％，葡萄糖转运体GLUT-4表达减少28％。过氧化物酶体增殖物激活受体-a(Peroxisomeproliferationactivatedreceptor-a，PPAR-a)是心肌细胞脂肪酸吸收和利用的重要调节物，心肌细胞中PPAR-a激活，54 【10】抑制葡萄糖吸收和利用调节，心肌能量代谢紊乱，导致糖尿病心肌病。Zucker糖尿病肥胖鼠心肌细胞甘油三酯积聚，PPAR-a基因和肌球蛋白重链蛋白转录【10】水平增加，GLUT-4表达下调。研究发现，糖尿病离体灌流心脏过表达GLUT4可使心肌代谢和收缩功能恢复正常。表明心肌细胞糖代谢紊乱、脂毒性、胰岛素抵抗均与糖尿病心肌代谢和心功能改变有关。2钙代谢异常2+胞质内Ca浓度改变是启动心肌兴奋收缩和复极——舒张两个耦联的关键2+2+因素，Ca是影响和调节细胞的重要因子。大量研究显示，DC心肌细胞Ca超载是心肌功能受损的直接原因。胞外葡萄糖浓度的升高，引起心肌细胞钙稳态失调，收缩功能改变。3胰岛素抵抗高血糖通过抑制细胞内IRS-l蛋白表达和酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号传导，引起胰岛素抵抗。胰岛素抵抗可降低机体将葡萄糖作为能量来源的能力，使能量供给不足，心脏处于饥饿状态，使心功能不全。胰岛素抵抗时伴发3个特征性代谢紊乱：高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症，通过多种途径导致心肌间质纤维化，造成心功能损害。(二)心肌细胞凋亡与氧化应激细胞凋亡是多因素联合作用的结果，心肌细胞凋亡可被多种信号触发，如低氧、心肌细胞缺血和再灌注损伤。高血糖造成心肌细胞凋亡，部分是通过细胞色素c激活caspase-3途径发挥的。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠早期引起心肌细胞凋亡。有报道STZ糖尿病鼠合并心肌梗死1周后，心肌凋亡程度较非糖【11】尿病心肌梗死组明显增加，心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡增加。心肌细胞【12】【13】用不同血糖浓度培养发现，细胞凋亡程度与血糖浓度呈正相关。Long等研究发现心肌细胞凋亡和坏死的过程与p53磷酸化有关。高血糖促进氧自由基产生，导致心肌细胞过氧化，产生毒性作用；诱导氧化应激，Bax表达增加，Bcl-2表达下降，线粒体通透性增加，促进心肌细胞凋亡。Thandavarayan等在STZ糖尿病小鼠中发现P38aMAPK可通过抑制Bcl-X(L)促进【14】心肌细胞凋亡。(三)心肌纤维化糖尿病患者细胞外基质大量增生和胶原降解减少，胶原沉积于心内膜下代替55 死亡的心肌细胞，导致心肌间质纤维化的，从而影响心肌的收缩和舒张功能。1基质金属蛋白酶表达减少基质金属蛋白酶(MMPs)是细胞外基质降解的主要酶类。MMP-2活性降低和MMP-9活性增强，使内皮细胞凋亡、毛细血管密度降低。王绵等发现2型糖尿病大鼠心肌胶原纤维增多，MMP-2mRNA表达减少，说明糖尿病中MMP-2对胶【15】原的降解作用减弱。2肾素血管紧张素系统的过度激活心脏局部存在肾素血管紧张素系统(RAAS)，RAAS能维持、改变心肌结构。糖尿病或高糖环境下，心脏局部RAAS被激活。相关动物试验显示STZ注射2【16】周后糖尿病大鼠心脏血管紧张素Ⅰ和Ⅱ水平上升。糖尿病大鼠研究表明，心肌局部AngⅡ水平增加，使NADPH氧化酶活性增强，继而活性氧(ROS)产生增加，引起心肌氧化损伤，加速心肌细胞和内皮细胞凋亡和坏死，导致心肌纤维化【16】。血管紧张素Ⅱ和高血糖刺激TGF-活化，加快胶原基因的表达，导致【16】心肌纤维化。有文献表明，AngⅡ可致STZ糖尿病小鼠心肌凋亡。(四)心脏自主神经病变【18】研究表明，58％的糖尿病患者伴心脏自主神经功能紊乱。交感神经病变引起心功能异常，交感神经病变时，心率减慢及心肌收缩力降低。自主神经损伤引起降钙素基因相关肽(CGRP)功能缺失。正常生理情况下，CGRP可拮抗内皮素(ET)的缩血管作用，对心血管功能具有调节作用。糖尿病患者CGRP受体调控【19】下降，无法从神经释放，导致ET含量升高，从而影响血管舒张和心肌收缩力。二糖尿病心肌病的治疗迄今为止，国内外针对DC的预防和治疗已做了大量的工作，多是以DC的发病机制为研究基础，通过药物延缓心肌病变的进展。目前多种药物被证实可发挥心肌保护作用，对疾病进展和预后有重要影响。（一）降糖药物高血糖症被认为是DC发生、发展的首要因素，控制血糖可减缓糖尿病患者心肌病的发展，降低心血管疾病的发病率和病死率，使处于心肌功能异常早期阶【20】段的患者受益。在口服降糖药物中，研究证实二甲双胍是不增加心力衰竭危险且能降低病死率的药物。56 （二）调脂药物糖尿病早期就可出现血脂异常，直接损害血管内皮功能、促进动脉粥样硬化【21斑块的形成，增强体内氧化应激反应，引起血管和心肌损伤。2008年一项荟【22】萃分析表明，糖尿病患者使用他汀类药物可明显降低心血管事件的病死率。（三）受体阻滞剂随着心力衰竭研究的不断进展，受体阻滞剂成为治疗无禁忌证心力衰竭患【23】【24】者不可或缺的药物，使糖尿病和非糖尿病患者受益。Sharma等通过DC大鼠模型证实，美托洛尔降低脂肪酸氧化、阻止心房利钠肽的重新表达来提高心排血量、改善心室功能。（四）其他药物【25】大量的动物研究显示，抗氧化剂或抗氧化药物,如维生素E、血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类药物等可发挥心肌保护作用。此外，有研究者发现,维拉帕米可减少硫氧还蛋白结合蛋白TXNIP(thioredoxin．interactingprotein)介导的心肌凋亡性损害。异甘草素能通过延缓TGF-β1-SMAD信号转导，减少肾小球膜【26】基质的高糖水平。异甘草素通过活化心脏内可溶性的鸟苷酸环化酶，增加cGMP的水平，从而抑制cGMP依赖的蛋白激酶，加强心室心肌收缩力。异甘草【27】【28】素还能增加HeLa细胞内ROS的水平而减少细胞凋亡。ChinYW等报道异甘草素在甘草根和茎的过氧亚硝酸根抗氧化实验中是最有潜力的抗氧化成分。日【29】本有学者在研究新疆甘草发现异甘草素与其他成分一样，有同等抗氧活性。【30】有学者报道分离光果甘草的七种成分，并检测其抑制低密度脂蛋白（LDL）的能力，显示，异甘草素能有效的抗LDL氧化。综上所述，糖尿病心肌病是糖尿病的主要致死原因，是一种独立的糖尿病并发症。其发病机制复杂。目前多种药物被证明有心肌保护作用，异甘草素对心血管疾病亦有多方面的益处，可望为糖尿病心肌病的防治提供新思路。57 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