几种植物精油体外抗病毒活性的研究

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＇９３中图分类号：公开：Ｑ密级＇ＵＤＣ；：本校编号）．Ｉ菊Ｗ交遺乂攀硕±学位论文论文题目：几种植物精油体外抗病毒活性的研究？研究生牲名：罗彩霞学号：０２１２６００＊学校指导教师姓名：田永强、柏家林职称；教授、教授申请举仿等级：理学硕壬学位专业：微生物学论文提交日期２０１５年３月论文答辩日期：２０１５年６月： 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成ｉｌ果，除Ｔ文中恃别加标注和致谢之处外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研ｔ究成果。，也不包含获得兰州巧通大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名签字日期：如年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解兰州交通大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权兰州交通大学可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编Ｗ供查阅和借阅。同意学校向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名；导师签名：签字曰期：＞｜（年６月曰签字曰期：年１￥月／ｒ曰 硕士学位论文几种植物精油体外抗病毒活性的研究Studyontheantiviralactivityofsomeessentialoils作者姓名：罗彩霞学科、专业：微生物学号：0212600指导教师：田永强柏家林完成日期：2015年4月兰州交通大学LanzhouJiaotongUniversity 兰州交通大学硕士学位论文摘要植物精油是成分众多、结构复杂的一类天然混合物，是天然中草药成分中重要的活性成分之一。植物精油具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌抑瘤、抗氧化等多种生物学功能，应用范围广泛。本研究选择百里香精油、牛至精油、艾叶精油和丁香精油进行抗病毒活性研究，并选择精油中抗病毒活性较强的有效成分进行的抗病毒机理研究，从而确定该活性成分的药理作用，为精油抗病毒深入研究和药物开发提供理论依据。本研究选择两种常见的病DNA病毒人腺病毒（Humanadenovirus，HAdV）和RNA病毒脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）为研究模式病毒，利用CPE法和MTT法分别在其敏感细胞株HEK293和Vero上开展精油体外抗病毒活性研究，并筛选出不同的精油对细胞的最大无毒浓度，通过不同精油对细胞感染病毒的保护作用、治疗作用、直接灭活作用以及抗病毒吸附细胞作用，确定精油抗病毒的作用机理，并利用病毒滴度的变化来评估药效。研究结果表明：在对HAdV的研究中发现，浓度为20μL/L5.33的百里香精油在体外对HAdV3有一定的灭活作用，且其病毒滴度由10TCID50/mL下4降到10TCID50/mL。牛至油浓度为50μL/L时，从CPE上可以看出其具有一定的保护作4.663.83用，HAdV3病毒滴度由10TCID50/mL下降到10TCID50/mL。对EMCV病毒进行体外抗病毒活性研究，并利用CPE法及荧光定量PCR方法来评价了精油抗病毒的效果。结果表明：百里香精油在25μL/L到100μL/L的浓度范围内与阳性对照组相比较48h内未出现明显的CPE；牛至油组浓度在0.78μL/L到12.5μL/L的浓度范围内48h后细胞也未出现明显的病变现象，病毒拷贝数有一定的降低。说明这两种精油能推迟病毒感染细胞的时间。由于百里香精油、牛至油精油对两种病毒都存在不同程度的抑制作用，所以继续选择这两种精油中都含有的一种成分麝香草酚进行有效成分的研究，通过以上相同的作用方式及评价方法，结果表明麝香草酚是百里香和牛至油抗人腺病毒的有效成分之一，而不是百里香精油抗EMCV的有效成分。综上所述，百里香精油、牛至油精油在体外能一定程度的灭活病毒和阻止病毒的吸附，研究结果为今后进一步研究植物精油抗病毒提供理论基础。关键词:植物精油；人腺病毒；脑心肌炎病毒；抗病毒活性；麝香草酚论文类型：应用研究-I- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究AbstractPlantessentialoilisanaturalmixtureofmanycomponentsandcomplexstructures,anditisoneoftheactiveingredientsofnaturalherbalmedicine.Theessentialoilofplanthasmanybiologicalfunctionssuchasantibacterial,anti-inflammation,anti-virus,anticancerandanti-tumor,antioxidantandsoon.Inthisstudy,fourkindsofessentialoilsfromthyme,oregano,wormwoodleafandclovewerechosenforantiviralactivitystudy.ThisstudychosetwocommondiseaseDNAvirusadenovirus(humanadenovirus,HAdV)andRNAvirusencephalomyocarditisvirus(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)astheresearchmodel,andinvitroantiviralactivityofessentialoilwerecarriedoutinthesensitivecelllinesHEK293andVerobyusingCPEandMTTmethods.Differentessentialoilsoncellmaximumnon-toxicconcentrationwasscreened.Furthertofindtheantiviralmechanismofdifferentessentialoils,cellinfectionvirusprotection,treatmenteffect,directinactivationeffectandantiadsorptioncellsweredetermined,andthevirustiterwereusedtoassesstheefficacy.TheresultsfortheHAdVresearchfoundthat,theconcentrationof20μL/Lofthymeessentialoilinvitrowashavecertaininactivation,andthevirustiterdeclined5.334from10TCID50/mLto10TCID50/mL.Whenoreganooilconcentrationis50μL/L,the4.66CPEresultshowedaprotectiveeffect,andthevirustiterdroppedfrom10TCID50/mLto3.8310TCID50/mL.TheantiviralactivityofEMCVviruswasstudiedinvitro,andwasevaluatedbyCPEandfluorescencequantitativePCR.Theresultsshowedthatthymeessentialoilofconcentrationrangefrom25μL/Lto100μL/LdoesnothaveobviouseffectonCPEwithin48hourscomparedwiththepositivecontrolgroup.Byusingoreganooilconcentrationrangedfrom0.78μL/Lto12.5μL/Lthephenomenonofobviousdidnotappearandthelesionsviruscopynumberhadbeenreducedafter48h.Thesetwoessentialoilscandelaythetimeofvirusinfectingtocells.Inconclusion,theessentialoilsofthymeandoreganooilhavecetaininhibitioneffectontwoviruses.Thymol,themainingredientofthetwoessentialoils,waschosenforthestudyofantiviralactivity.Theresultsshowedthatthethymolwasoneoftheeffectivecomponentsofthymeandoreganooilantihumanadenovirus,insteadofthymeessentialoilagainstEMCVeffectivecomponents.Insummary,thymeandoreganooilhaveinhibitioneffectonvirusandpreventvirusadsorptioninvitro.Thestudyprovidesatheoreticalbasisforthefurtherresearchofantiviralactivityofplantessentialoils.Keywords:Plantessentialoil;Humanadenovirus;Encephalomyocarditisvirus;Antiviralactivity;ThymolResearchtype:Application-II- 兰州交通大学硕士学位论文缩略词英文对照表英文缩写英文全称中文全称CPECytopathiceffect细胞病变EMCVEncephalomyocarditisvirus脑心肌炎病毒HAdVHumanadenovirus人腺病毒M-MLVM-MLVReversetranscriptaseM-MLV逆转录酶MTT3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium噻唑蓝bromideOligoOligo(dT15-18)寡聚核苷酸Real-timePCRRealtimefluorescentquantitativePCR实时荧光定量PCRTCID50TissueCultureInfectiousDose50半数组织培养感染量TC0Mediantoxicconcentration对大无毒浓度-III- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究目录摘要.....................................................................................................................................IAbstract......................................................................................................................................II缩略词英文对照表...................................................................................................................III1引言....................................................................................................................................11.1中药抗病毒的研究进展..............................................................................................11.1.1中药抗病毒机制的研究...................................................................................11.1.2中药中有效成分抗病毒...................................................................................11.2人腺病毒和脑心肌炎病毒..........................................................................................31.2.1病毒的结构及分类...........................................................................................41.2.2人腺病毒研究进展...........................................................................................41.2.3脑心肌炎病毒的研究进展.......................................................................................61.3植物精油研究进展......................................................................................................71.3.1植物精油的理化性质.......................................................................................81.3.2植物精油的化学成分.......................................................................................81.3.3植物精油的药理学研究...................................................................................81.4课题的提出及论文的研究内容................................................................................112精油体外抗人腺病毒作用的研究......................................................................................132.1材料............................................................................................................................132.1.1HEK293细胞..................................................................................................132.1.2HAdV3毒株...................................................................................................132.1.3药品.................................................................................................................132.1.4实验仪器.........................................................................................................132.1.5主要试剂.........................................................................................................132.2实验方法与步骤........................................................................................................142.2.1HEK293细胞的复苏、传代..........................................................................142.2.2MTT的优化...................................................................................................142.2.3酒精对HEK293细胞的毒性.........................................................................152.2.4精油对HEK293细胞的毒性试验.................................................................162.2.5HAdV3毒株的扩增、保存、鉴定及TCTD50的测定................................172.2.6精油体外抗HAdV3的作用..........................................................................192.3结果............................................................................................................................20-IV- 兰州交通大学硕士学位论文2.3.1MTT的优化....................................................................................................202.3.2酒精对HEK293细胞的毒性.........................................................................232.3.3精油对HEK293细胞的毒性........................................................................242.3.4HAdV3毒株的鉴定及TCTD50的测定结果................................................272.3.5精油体外抗HAdV3的作用实验结果..........................................................292.4小结与分析................................................................................................................323精油体外抗脑心肌炎病毒作用的研究...............................................................................343.1材料............................................................................................................................343.1.1Vero细胞........................................................................................................343.1.2EMCV毒株....................................................................................................343.1.3药品.................................................................................................................343.1.4实验仪器.........................................................................................................343.1.5试剂.................................................................................................................343.2实验方法与步骤........................................................................................................353.2.1Vero细胞的复苏、传代................................................................................353.2.2酒精对Vero细胞的毒性...............................................................................353.2.3精油对Vero细胞的毒性试验......................................................................353.2.4EMCV毒株的扩增、保存及TCTD50的测定..............................................373.2.5精油体外抗EMCV的作用...........................................................................373.2.6实时荧光定量PCR........................................................................................383.3实验结果....................................................................................................................403.3.1酒精对Vero细胞的毒性...............................................................................403.3.2精油对Vero细胞的毒性实验.......................................................................413.3.3EMCV病毒TCID50测定结果.......................................................................453.3.4精油体外抗EMCV的作用实验结果...........................................................453.3.5实时荧光定量PCR检测结果......................................................................493.4小结与分析................................................................................................................514麝香草酚体外抗病毒作用的研究.......................................................................................524.1材料............................................................................................................................524.1.1细胞.................................................................................................................524.1.2病毒株.............................................................................................................524.1.3药品.................................................................................................................52-V- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究4.1.4实验仪器.........................................................................................................524.1.5试剂.................................................................................................................524.2实验方法与步骤........................................................................................................524.2.1细胞的传代培养.............................................................................................524.2.2麝香草酚对HEK293细胞的毒性试验........................................................534.2.3麝香草酚体外抗病毒的作用.........................................................................534.3结果...........................................................................................................................554.3.1麝香草酚对细胞的毒性................................................................................554.3.2麝香草酚体外抗HAdV3和EMCV的作用实验结果.................................564.4小结与分析................................................................................................................58结论....................................................................................................................................60致谢..................................................................................................................................61参考文献............................................................................................................................62攻读学位期间的研究成果......................................................................................................68-VI- 兰州交通大学硕士学位论文1引言1.1中药抗病毒的研究进展中药现代化主要表现在能发挥药效作用的化合物。中药提取物有着优良的生物活性使之成为医药和农药等领域中重要的药物来源并具有广泛的应用前景。天然产物被认为是新药的发现和新药先导化合物的资源，大约有四分之一的新药源于中草药，目前药物抗病毒研究的热点集中在从天然中药中提取出有效成分抗病毒的研究。抗病毒物质已知的成分为挥发油、生物碱、甙类、酸类、醛类、多糖类、酚类、萜类化合物、酮类。1.1.1中药抗病毒机制的研究中药抗病毒包括间接和直接两种作用方式来抑制病毒。在直接抑制病毒方面，具有复杂成分的中药主要是通过直接杀死病毒或在病毒复制过程中，对病毒吸附阶段、蛋白质和核酸合成阶段起到抑制作用。在间接抑制病毒方面中药能对病毒干扰素起到抑制作用，同时也能抑制促炎性因子的产生。1.1.2中药中有效成分抗病毒⑴挥发类物质植物源次生代谢物质统称植物精油，它是可随水蒸气蒸出具有一定挥发性的小分子物质。植物精油具备多种保护功能如预防疾病和调节湿度，还能阻止细菌和其它病菌对植物的侵害，花瓣中具有芳香味的精油能吸引有益的昆虫靠近自己，利用精油具有芳香味的这一特点，被人们应用到生活的各个方面，起到增强体魄、预防疾病和改善环境的作用。植物精油根据其化学成分和含量被分为4大类，即芳香族化合物、萜烯类衍生物、含氮硫类化合物、脂肪族化合物。中药中的植物精油主要作用于高等动物的神经系统。在药理作用中很多植物精油具有多作用位点，主要是对高等动物神经系统的作用，如从巴豆中提取到的精油及其大茴香脑这一成分对老鼠和蟾蜍的作用机理研究发现，精油主要是通过对后一关节的神经肌[1]肉传导和促进肌质网肌浆钙离子浓度的增加发挥作用。在药理中部分精油是单作用位点，从茶树中提取的以香叶醇为主要成分的植物精油，能起到镇痉作用，主要是通过[2]cAMP来调节神经突触后膜实现的。植物精油在抗病毒方面具有多种途径，精油能有效对抗处于吸附阶段前的病毒，对处于吸附阶段后的病毒无效，说明精油与病毒包膜在吸附前可能发生相互作用从而起到[3]抗病毒的作用，如百里香、茴香、洋甘菊、姜、牛膝草、檀香精油等。精油还可以抑制合成转录后的病毒蛋白，如反式-肉桂醛。植物精油抗病毒范围广，对流感病毒、肝[4-7]炎病毒、疱疹病毒(HSV)等有一定的抗病毒活性作用，松针油和万寿菊叶精油在抗甲-1- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究[8]型流感病毒方面具有良好的作用。作为佩兰精油的主要成分乙酸香橙酯、麝香草酚甲[9]醚和佩兰精油有直接抑制流感病毒的作用。乔木蒿精油和艾叶挥发油分别对疱疹病毒[10]和呼吸道合胞病毒具有较好的抗病毒效果。脂质体与藜蒿精油相混合后可增强抗病毒[6][11]效果。从水菖蒲、毕澄茄、华荠苎等植物中提取得到的精油同样有抗病毒作用。⑵多糖类多糖是生命中基本物质之一，是天然的高分子化合物，主要由单糖组成。在微生物、动物、植物组织中普遍存在。多糖具有多种功能，被大家认可的作用主要集中在控制细胞增殖方面、调节细胞生长方面、调节抗衰老方面。目前，人们已对多糖进行了广泛及深入的研究，表明多糖具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗衰老、促进机体免疫力增强等多种作用，其中免疫调节作用尤为突出。多糖作用范围广，主要表现在免疫增强作用和抗病毒作用这两大方面。在寻找新药抗病毒的过程中，无论是天然还是人工途径获得的多糖都具有抗病毒作用。机体免疫系统被多糖激活与多糖抗病毒机制有关。如NK细胞、巨噬细胞被多糖激活后，吞噬能力有所提高；同时抗病毒干扰素和细胞因子被淋巴细胞分泌，使病毒抗体较早产生，抗病毒作用才得以实现。也存在这样一类多糖，它能与病毒结合在一起，破坏或改变病毒的结构，从而阻止病毒的吸附，使病毒不能进入宿主体内进行增殖，起到灭活病毒的作用。从植物中提取到的一种酸性多糖，具有抗氧化的作[12]用，能抑制逆转录酶病毒如艾滋病病毒的复制。小鼠被仙台病毒感染后，服用裂褶菌[13]多糖能使体内较早产生病毒抗体，从而降低小鼠的死亡率。灰树花多糖能提高已经感染了单纯疱疹病毒及流行性感冒病毒的小鼠存活率，进一步证明了灰树花多糖具有抗单[14]纯疱疹病毒和流行性感冒病毒的作用。高山红景天多糖抗柯萨奇B5病毒吸附作用效[15]果明显，且可能还可以抑制其在宿主细胞内的复制。黄芪多糖刺激感染鸡新城疫病毒和I型副流感病毒的小鼠白细胞产生IFN，增强NK[16]细胞。红藻中多糖在大鼠感染鼠肉瘤病毒MSV-124后能明显的抑制成纤维细胞恶性[17]转化。板蓝根多糖在体外作用下通过不同作用方式对PK-15细胞感染猪细小病毒后具[18]有阻断和抑制病毒的作用。⑶生物碱生物碱多存在植物体内，它是一些含氮有机化合物并显碱性。研究发现生物碱的作用表现在抗病毒、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌及杀虫等方面。石蒜碱主要通过抑制病毒在早期阶段Vc的合成，从而具有抗菌抗病毒活性。它对病毒抑制作用范围广，如可有效对流感病毒、柯萨奇病毒、人免疫缺陷病毒（HIV-1）、单纯性疱疹病毒、脊髓灰质炎、[19]人肠道病毒等。从黄藤中提取得到的棕榈碱能够阻止病毒的核酸合成，使其失去复制[20]的能力从而抑制病毒的增殖。漳州水仙碱能有效抗致癌病毒。石蒜碱、三球定、高石蒜碱、网球花胺具有低治疗指数、高抗病毒活性，但是不能有效抑制鸟类成髓细胞性白-2- 兰州交通大学硕士学位论文[21]血病病毒（AMV）逆转录酶、HIV逆转录酶，表明它们具有不同的作用靶点。白毛[22]藤全草中提取得到的脂溶性生物碱和水溶溶性生物碱均有抗NDV的作用。板蓝根中[23]提取得到的脂溶性生物碱、水溶性生物碱、混合生物碱能不同程度的抑制猪细小病毒。[24]研究表明，沙冬青总生物碱能影响已经进入细胞内的BVDV病毒的生物合成及对还未进入细胞内的病毒具有直接灭活的作用，或者抵抗病毒的侵入来之于促进细胞的增值。甘青乌头生物碱具有抗HSV-2的作用主要表现在对HSV-2直接灭活及降低HSV-2[25]的感染性。从紫花地丁中提取得到的总生物碱对鸡新城疫病毒有一定的抗病毒作用[26]。⑷萜类化合物及其他[27]RenWangJiang等从南蛇勒中分离出化合物软木三萜酮和表无羁萜醇，并发现它们在Hep-2细胞中对Para3病毒具有抑制作用。R．A．A．Mothana发现来自于担子菌[28]类的四环三萜类化合物能有效抑制入侵MDCK细胞的甲型流感病毒。甘草次酸不仅能抑制处于早期病毒的吸附和侵入宿主细胞，还能抑制病毒复制，从而能避免病毒感染宿主细胞。齐墩果酸具有多种生物活性如抗病毒、抑菌、抗炎、降血[29]脂、降糖、抑制血小板凝集、护肾保肝作用。病毒只含有核酸（DNA或RNA），具有高度寄生性的非细胞型微生物，依赖宿主的能量代谢进行自身的生存、寄生、复制和传播。以细胞内和细胞外两种形式存在，在细胞外存在的病毒具有复制活性，把核酸分子注入到细胞内，并利用宿主细胞的环境进行核酸复制，其次病毒活力强，抗生素和药物对其影响不大，除了可以破坏人体免疫系统还能直接感染人体组织。如艾滋病、天花病、手足口病、人类SARA病、肿瘤性疾病、禽流感等疾病及其它动物疾病的流行爆发，不仅对人类健康危害严重，同时也影响了畜牧业的健康合理发展。中药是传统医学不可或缺的重要部分，在中国已经有两千多年的使用历史，它具有多种特点，如祛邪扶正、平衡阴阳、标本兼治。中药不仅具有治疗和调节的作用还可以提高抗应激能力和增强身体的免疫力，且来源品种丰富、副作用小。正因为中药具有以上优点已成为药物抗病毒的首选，日益引起大家的广泛重视，尤其是中药活性成分的研究已成为新药研究的主导方向。近年来，国内对研究中药抗病毒异常活跃，大量复活与单方有效成分被从天然中药中筛选研究出来，不少学者对黄芪、大青叶、金银花、连翘、大黄、鱼腥草、柴胡、黄芩、黄连、麻黄、板蓝根、桂枝、槟榔、苦地丁等中药做过深入研究。虽然研究中草药及其化学成分的抗病毒作用所运用的药理学方法才仅仅几十年时间，就已取得突飞猛进的成绩。1.2人腺病毒和脑心肌炎病毒1.2.1病毒的结构及分类-3- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究病毒主要由内部的核酸和蛋白质外壳组成。中心部位是核酸，称为基因组(genome)。基因组被蛋白质包围，形成了病毒的抗原成分和支架结构的衣壳（capsid）。对保护核酸有一定的作用。核心壳（nucleocapsid）由衣壳蛋白和核心构成。有些病毒较复杂，其核心壳外还被一层类脂双层膜覆盖着，如含蛋白质或糖蛋白（glycoprotein）的脂类，此膜被称为包膜（envelope）。来自宿主的细胞膜给包膜提供了脂类，有的包膜上还长有刺突（spike）等附属物。病毒的入侵性和专一性等功能与包膜是否存在及包膜的性质有关。目前，病毒分类按照八项原则进行分类，八项原则由国际病毒分类委员会提出并被世界公认。其主要依据：一是病毒的分子量、核酸类型和结构；二是病毒颗粒的形态和大小；三是病毒核衣壳的对称性；四是对一些脂溶剂如乙醚或氯仿的敏感性；五是血清学性质和抗原性；六是在细胞培养上的生长特点；七是对脂溶剂以外的其他理化因素的敏感性；八是流行病学特点。1.2.2人腺病毒研究进展人腺病毒（Humanadenovirus，HAdV）属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）。是无包膜的呈二十面体对称的线性双链DNA病毒，病毒颗粒直径[30]约65~80nm，由蛋白衣壳、核心蛋白和DNA组成。最早发现于1953年，由Rowe等[31]人从健康人萎缩的扁桃腺组织中分离培养。1954年Hilleman等人在患有急性呼吸道感染患者的咽喉洗液中分离到同样的病毒，命名为人腺病毒。二十世纪末，通过对世界[32]范围内引起人呼吸道感染性疾病的病毒进行分离鉴定，统计发现腺病毒占13%。迄今[33-35]为止，已发现人腺病毒有67种血清型，分别属于7个不同亚组A-G。其中与呼吸[36-37]道疾病密切相关的是B组、C组和E组。HAdV作为一种可在全球范围内流行的病毒，重视程度可想而知，在美国、韩国、日本、中国都相继建立了腺病毒监测网络。⑴HAdV生物学特征HAdV无包膜，核衣壳呈二十面体立体对称，直径90-l00nm左右。腺病毒基因组[38,39]为线性双链DNA，包裹在由252个壳粒（capsomere）组成的病毒颗粒中，腺病毒的核衣壳由三个主要表面结构组成：六邻体蛋白（Hexon），纤维蛋白（Fiber）和五邻体蛋白(Penton)。其中五邻体位于腺病毒二十面体的12个顶角，每个Penton表面有一条长度10-30nm的纤维突起(Fiber)，即纤维蛋白，Fiber结构中的抗原决定簇决定了病毒的种特异性和亚属特异性。此外240个非顶角壳粒为六邻体（Hexon），每个六邻体蛋白表面携带有主要的属和亚属以及次要的种特异性抗原决定簇病毒基因组双链DNA约占[40]病毒质量的13％，与病毒多肽V（368个氨基酸）、VII（174个氨基酸）和末端蛋白（Terminalprotein，TP，671个氨基酸）等蛋白质构成病毒核心，其中核心蛋白VII作最主要的衣壳蛋白包裹着腺病毒基因组双链DNA。-4- 兰州交通大学硕士学位论文腺病毒能耐受温度和酸碱度，与一般病毒相比较范围较宽，其对RNA酶、DNA酶、木瓜酶、胰酶及脂溶剂有一定的抵抗力，但当紫外线照射30min，可灭活病毒。⑵流行病学腺病毒感染在全球范围内流行。腺病毒感染流行季节多在冬春季。HAdV感染范围广，主要易感人群包括幼儿、艾滋病人、移植手术者及免疫遗传缺陷等这些免疫抵抗功能低下的人。一般来说，腺病毒传播途径多样化，主要通过接触传播和消化道传播。一般而言，腺病毒不会在人和动物之间交叉感染致病。肠上皮细胞是病毒主要的繁殖和复制场所。我国发病较高的腺病毒感染是腺病毒腺肺炎，主要感染人群为儿童，年龄范围[41]为6个月至两岁。我国范围内流行的主要是腺病毒3型和7型，也有11型的报道。⑶常见临床表现①HAdV感染呼吸道[42-44]人腺病毒所致人呼吸道的感染，据统计儿童占5％-10％、成人占1％-7％，主[44,45]要症状有咽痛发热、扁桃体炎、咽喉炎、咳嗽，一般会有胃肠道症状的表现。②HAdV感染所致的角膜结膜炎[46]角膜结膜炎由HAdV所感染后，往往会导致失明和引起眼部其他疾病。眼部被[47,48]HAdV感染后临床表现症状为咽结膜热、流行性角结膜炎和非特异性结膜炎。③HAdV感染的胃肠道临床表现在世界各地肠腺病毒胃肠炎广泛存在，小儿发病情况仅次于RV肠炎。发病年龄集中在2岁以下儿童。夏季及冬末为发病高峰期。HAdV感染可导致胃肠道症状，在病毒[49,50]性胃炎中肠腺病毒检出率为0.8-14％。潜伏期接近半个月。主要症状为水样便、腹泻或稀便，大多患者伴随着呕吐，持续数天。约五分之一的肠腺病毒肠炎患者伴有呼吸道症状，病毒随粪便排出体内时间为1周左右。④HAdV感染的泌尿系统临床特征尿路感染也可能是HAdV感染所引起的，特别是患者接受过实质器官移植和造血干细胞移植后被腺病毒感染后，症状包括排尿困难、出血性膀胱炎血尿、和肾移植后功能[51,52][53]不全。肾活检显示为病毒性肾病或移植排斥反应。⑷防治腺病毒感染预防，主要是注意个人卫生，如勤洗手、勤消毒，避免与患者及其呼吸道飞沫接触，多饮水，多吃新鲜水果和蔬菜，注意加强身体素质的锻炼；保持室内空气清新、流通；在易流行的冬春季节尽量不去人多的公共场所，外出时可戴口罩，以防感染。如若发生急性发热、结膜炎和咽喉疼痛的症状，要及早到附近医院就诊，早隔离、早治疗。出现5人以上集体发病的情况要及时向所在地区防疫部门报告，及时采取有效的防控措施，避免疾病蔓延。-5- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究1.2.3脑心肌炎病毒的研究进展脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）是一个无囊膜的单链小RNA病毒，是一种重要的人畜共患病病原，会引起猪和某些哺乳动物、啮齿类动物乃至灵长[54]类动物的一种以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。1945年首次在美国的弗罗里达州迈阿密市，从一只死于急性致死性心肌炎的雄性长臂猿体内分离到[55]EMCV病毒。1958年，确定EMCV病毒是引起猪致死性疾病的原因之一，并从此次[56-59]爆发疾病的猪群中分离得到了EMCV病原。随后在许多国家和地区有报道该病在[60,61]猪群中爆发和流行。松鼠、大象、非洲绿猴、狒狒等多种动物都易感染EMCV，而临床上猪是感染最普遍、最严重的动物。我国是在2005年首次分离得到了EMCV，是从猪场早产及流产胎儿、病死仔猪的病料组织中分离得到的，这就表明我国己经存在猪[62,63]脑心肌炎病原学上的感染。⑴EMCV生物学特征EMCV属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）成员，EMCV属于心病毒属[64]（Cardiovirus），只存在一个血清型。EMCV是单股正链RNA病毒，无囊膜病毒粒[65]子由直径为30nm的20面体对称外表光滑的球体组成，基因组全长7.8kb分子量为3[66]2600KD，在氯化铯中浮密度为1.33~1.34g/cm，沉降系数为156S。病毒可以抵抗多种脂溶剂，如氯仿、乙酸、乙醇。由于其无囊膜，较敏感且易失活于电离福射电离、热、氧氧化钠、甲酸、福尔马林等。因此EMCV通常保存在pH为3.0且低温条件下，长期0保存则应把温度降低至-70C。⑵EMCV的基因组结构EMCV的基因组结构是非翻译区5'-UTR连接一个L蛋白，之后连接4个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D），[67]最后连接非翻译区3'-UTR。其中除5'-UTR和3'-UTR之间有一个约6879nt的放阅读[68]框(ORF)，编码多聚蛋白，该蛋白由2292个氨基酸组成，EMCV蛋白衣壳粒子由这四种结构蛋白组成。EMCV的mRNA5'末端有一个长约600-1300个碱基的非编码前导序列(5'UTR)，而其它许多真核细胞则有一个帽子结构，非编码前导序列(5'UTR)约有[69,70]600-1300个碱基，该区含有二级结构和非起始三联密码子AUG。3'端有一个短的poly(A)尾，也含有一个非翻译序列(3'UTR)，负链RNA的合成起始于该区。⑶EMCV的流行特点EMCV常被描述成一个人畜共患病病原。病毒感染在人类移植和人原代细胞培养方[71-73]面的研究表明人类细胞对EMCV敏感。20世纪40年代到50年代之间，EMCV感染儿童后并没有出现心肌炎的症状，只出现了发热和脑炎。在早期的研究中，在17个持续3天发热的士兵中发现了针对EMCV的抗体，在4个士兵中有3个的中和抗体的-6- 兰州交通大学硕士学位论文[74]滴度增加。在1948年，Mengo病毒被人们从恒河猴体内分离出来，同时在与动物接触的人体内也分离到了Mengo病毒，此人最后痊愈。与此同时，Mengo病毒从患者血[75]液中分离得到。从1950年到2009年，还未发现人感染EMCV后有明显的临床症状。[76-78]但是从血清学检测结果显示即便是健康人群感染率也是2.3%-15%。在秘鲁，发现了EMCV感染人的病例，临床症状是发热、恶心、呼吸困难和头痛现象，随即利用一些诊断技术检测到该病毒，从患者的血清中分离得到EMCV，证明了EMCV能感染人并能引发疾病的这一观点。1978年，P.Tesh曾说：“人类中的脑心肌炎很平常，但大部[76]分的情况是不出现症状或未被察觉。”⑷常见临床表现EMCV感染人较为罕见，多呈散发。临床症状表现有差异，患者常有头疼、发热和呕吐的症状。脑脊液中淋巴细胞明显增多，有的还有麻痹等症状。基本上患者康复时间为4至5d，而无后遗症。猪被人工感染该病毒后潜伏期为2至4d。病猪出现短暂（24h）发热和急性心脏病的症状，大多数病猪在还未出现明显症状时就突然死亡了，偶有轻微的精神沉郁、步态蹒跚、拒食、麻痹、呕吐、震颤和呼吸困难等症状。牛和猴的病理变化主要表现在心肌炎病变。猴还可发现轻度脑炎病变。⑸防治必须运用综合性防控措施来预防该EMCV的感染，尽可能消灭居住地及猪场周边的鼠类，杜绝鼠类啃咬或污染食物和饲料的现象发生，对处理病死动物要进行无害处理，消毒污染场地需彻底进行。可使用甲醛灭活疫苗，防止人畜感染。1.3植物精油研究进展植物精油是植物体内简单化合物组成的次生代谢物质，分子量相对较小、易挥发、气味芳香。主要有醇类、萜烯烃类、芳香烃类、酯类、醛类、酮类、醚类和酚类等。植物精油具有很多种类，根据成分可分为三类：基础油、单方精油和复方精油。人们根据精油所具有的特性将其应用到各个领域上，医学领域方面：植物精油能去痛、抗病毒、降压、消炎、提高免疫力、保健和调节内分泌等作用；美容养颜方面：在护肤品、香水、洗面奶中添加适当精油已被广泛应用；此外，在饲料和食品中精油作为添加剂加入其中[79,80]能起到防止虫害的作用。1.3.1植物精油的理化性质植物精油具有以下理化性质：易挥发且气味强烈，呈液体；折光率和一定的旋光度；密度比水小，比重在0.85～1.065g/mL之间；不易溶于水，溶于极性较小的有机溶剂；[81]易分解变质；有些植物精油中析出可见的固体沉淀(俗称“脑”)。-7- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究1.3.2植物精油的化学成分植物精油化学成分按基团进行分类可分为：第1类是萜烯类化合物。第2类是芳香族化合物，如百里草等。第3类是脂肪族化合物，如精油中存在的异戊醛。第4类是含硫含氮化合物，三硫化物如大蒜素，异硫氰酸酷如黑芥子等。其中，精油中含有成分最多的是萜类化合物，该化合物又可以分为双萜、倍半萜和单萜；如茴香醇、广藿香酮、薄荷酮、罗勒烯、月桂烯等，常见于桉树、薄荷、栀子花、广藿香、月桂等植物提取得到的精油中常含有这些化合物。植物精油中含有的芳香族化合物是含量第二多的化合物成分，由酚类、酯类、醛类、酮类和萜源衍生物等构成；植物精油中常见的芳香族化合物有百里香酚、丁香酚、柠檬醛、肉桂醛和乙酸肉桂酯等，常存在百里香、丁香、肉桂等植物提取得到的精油中。植物精油中含有的脂肪族化合物较低，如异戊醛、异戊酸和乙酸乙酯等。含在辛香料植物的含有氮含硫化合物，大蒜素、洋葱中提取得到的含三硫化合物的精油等。⑴香芹酚香芹酚又称荆芥酚，是牛至全草的挥发油中成分之一，香芹酚具有很强的脂溶性和表面活性，通过使细菌细胞壁结构蛋白变性和细胞膜受损来杀死细菌，从而起到抗菌的作用。大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等引起的动物胃肠道疾病可用香芹酚进行治疗。香芹酚能抗黄曲霉毒素、抗微生物生长、抗氧化功效，当添加剂加入饲料中能防止饲料变质。无残留，无污染，微生物不易对其产生耐药性。⑵百里香酚百里香酚又称麝香草酚从百里草中分离得到精油的一种成分也称为麝香草酚，是一种单萜酚，唇形科中百[82,83]里香属植物中含量多，占其精油成分的主要成分。麝香草酚被应用在食品及医药领[84]域。研究发现，含有THY的精油具有杀菌、抗菌、消毒和促进创伤愈合的作用。1.3.3植物精油的药理学研究⑴抗菌杀虫精油及精油中的有效成分主要通过破坏及改变致病菌的细胞膜结构或菌丝体的结构或有效抑制分生孢子的活性。多种植物精油是具有抗食源性致病菌的天然化合物，百[85]里香精油强抑制沙门氏菌、弯曲杆菌属的能力和对临床不动杆菌属有强的抑菌活性[86]。用含5％百里香精油和10％葵花油混合，在体外作用14h可以造成异尖线虫的幼虫[87]的角质层和肠壁损伤最终导致死亡。丁香酚抑制白色念珠菌的丝状物质，从而发挥抗[88]菌的作用。⑵肿瘤精油对肿瘤具有一定的抑制作用，精油中的芳香族化合物、百里香素、香芹酚、百里香醌和龙脑等，通常是通过使肿瘤细胞凋亡而实现抗癌抑制肿瘤的作用。在体内实验-8- 兰州交通大学硕士学位论文[89]中，使用硫代乙酰胺(200mg/kg)建立小鼠肝纤维化模型，腹腔注射硫代乙酰胺每周3次，连续5周，百里香醌能够有效对抗肝纤维化。在体外实验中，用乙酸乙酯、正丁醇、丙酮逐级萃取百里香乙醇提取物，得出三个相应萃取物成分，分别以体外培养的人白血病K562、HL-60及人肺癌L78、A549和人肝癌SMMC-7721等肿瘤细胞为研究对象对其体外抗肿瘤活性作用进行研究，发现百里香的乙醇提取物中乙酸乙酯部分有很强的抗[90]肿瘤活性，并能诱导肿瘤细胞凋亡。精油作为来源于植物的天然药物，是一种潜在的、有效的抗瘤药物之一。⑶抗炎症精油中含有的一些有效物质能起到抗炎的作用，百里香的精油及其主要有效成分芳樟醇是对TNF-α和IL-β这两种促炎症因子的抑制及使神经系统的超敏反应钝化来减轻[91]疼感，达到消炎止疼的作用。百里香和牛至油混合治疗TNBS诱导而得结肠炎的小鼠，发现在分子水平可以降低IL-6、GM-CSF、TNF炎性细胞因子的mRNA水平，从小鼠死亡率降低，体重增加，减少结肠组织的损伤可以得出百里香精油和牛至油的混合物可以[92][93]减轻小鼠的结肠炎。据对烟台地区百里香精油的成分的相关研究，测定出该地区精油主要含约70%的芳樟醇，定为芳樟醇型。为了弄清治疗关节炎的有效成分。采用大鼠蛋清关节致肿模型法进行有效成分的筛选，结果烟台百里香原油针剂有明显的抑肿、消肿作用，并证实芳樟醇是百里香油抑肿、消肿的有效成分，其效果与氢化可的松相似。给小鼠喂食200mg/kg百里香挥发油，可以使巨噬细胞的吞噬功能明显提高；给大鼠喂食800mg/kg百里香挥发油，可以使肉芽组织的生长受到抑制，进一步说明百里香挥发[94]油有很好的抗炎作用。⑷抗氧化植物精油主要通过清除一些自由基如DPPH、超氧化物等同时使还原能力增强，减[95]少脂质过氧化物。川芎植物精油和百里香精油等作为天然抗氧化剂，它们很容易且不受限制地参与体内的代谢过程并几乎没有产生相关的副作用。脂类氧化是影响脂类食品质量和保存期的重要因素之一，它导致食品氧化变质，甚至颜色加深、粘度上升、油脂酸败、以致最终影响食用。在食品中添加适量的抗氧化剂能延缓由于食品自身的氧化而[96]导致脂类氧化。用碘量比色法测定添加了百里香精油的油脂的过氧化值，能评价出百里香精油具有抗氧化活性，在试验范围，其抗氧化活性与添加量呈正相关。EI-Enkeety[97]等研究百里香精油对黄曲霉素诱导公鼠氧化应激的抵抗作用，黄曲霉素能导致公鼠机体出现一系列氧化应激症状，百里香精油能显著抵抗氧化应激，降低总抗氧化能力、增加了肌酐、尿酸和一氧化氮在血清中的含量等指标不发生显著性变化，并且这种抗氧化作用还存在剂量依赖效应。在实验中主要由羟基自由基、还原潜力、金属螯合和硫代巴[98]比妥酸等因素来判断百里香精油抗氧化活性的强弱，并确定百里香精油在抗氧化、清-9- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究[99][100]除自由基作用方面起到一定的作用。Jamali等对摩洛哥等地区的6种百里香化学成分和抗氧化活性进行了对比分析，结果表明香芹酚组的两种百里香精油清除自由基的3+能力和Fe还原力最强。⑸提高免疫力、抗病毒植物精油及其主要成分对病毒能起到一定的抗性作用。精油及其一些化合物是抗病[101]毒的主要有效成分通过与吸附前病毒包膜相互作用来实现的。Paul等研究纯疱疹病毒1型对姜、百里香、牛膝草、檀香精油的敏感性，结果表明百里香精油能改变或者溶解病毒的外膜结构，导致病毒不能吸附或者进入宿主细胞，从而抑制病毒。当添加含有桉树，茶树和百里香及精油主要成分后，这些药物分别对宿主细胞在感染前或单纯疱疹[102]病毒进入细胞后显示出高的抗HSV-1活性且能灭活游离的病毒颗粒。百里香精油可[103]以促进外周血T淋巴细胞的增殖和成熟，调节和提高麻花肉鸡的细胞免疫功能。[104]Amirghofran等研究表明，百里香水提取物能够显著增加树状细胞表面CD40的表达并且对T细胞的增殖具有免疫调节的作用。⑹抗血栓、抗过敏一些植物精油能调节机体中胆固醇、血压、血糖，降低凝血时间和抗动脉粥样硬化。[105]郑瑶琴等研究发现，通过给小鼠灌胃的方法给小鼠喂食百里香挥发油，可以使小鼠的耳壳微血管管径加大且流量增加，这样的作用能持续将近50min，对体外血栓的形成起到显著的抑制作用。百里香精油对降血压和强心也有一定的疗效作用。在抗过敏方面，百里香精油可以通过抑制细胞释放胺起到治疗的作用，把百里香精油加入食品中食用，[106]同样对遗传性过敏性皮炎和鼻炎有一定的疗效。⑺添加剂①食品添加剂很多植物精油及其主要成分作为添加剂加入食品中，已被美国食品药品监督管理局[107]（FDA）批准。在食品中添加能在提香、矫腥除臭和防腐等方面起到良好的作用。在提香方面，许多国家常把百里香的鲜叶、嫩尖或其干制品与其他芳香料混合调配成混合香辛料，如咖喱粉、炸猪排沙司、汉堡包肉饼等，特别适宜烤肉及烤野味类。曹军胜[108](2002)以百里香为配料，采用低盐固态发酵技术，研制成一种保健酱油。它是以百里香提取液或粉末为辅料而制成的风味酱油，不仅增加了各种营养成分，而且起到保健作用，口感上有较大改善。在矫腥除臭方面，百里香淡雅的香气在海鲜类原料中添加，能为各种新鲜鱼肉、虾贝类等海产品产生独特的清香，改变腥味。在百里香的天然防腐保鲜作用方面，使其添加在肉酱、香肠、腌肉和泡菜中，使其成为绿色无害的香料添加剂之一。罗马人制作奶酪和酒时也都将其作为调味料使用。在食品保鲜方面，对于加工产品等行业保持鲜切产品的质量，是面对最低限度的最大挑战之一。实际上，有许多研究-10- 兰州交通大学硕士学位论文[109]旨在延伸的这些货架寿命产品。CeliaAlmela等是通过将不同浓度，以建立一个最低限度的加工柿子的产品的百里香精油，柠檬精油，以增加它的货架寿命。精油涂在切柿0子中浸泡的初步阶段，然后将样品储存在4C，7天。通过水分含量、可溶性固形物含量、抗氧化能力、总酚、pH值、光学和机械性质和微生物计数这些指标定期分析。得出百里香精油在洗涤阶段中应用能改进的水果色的保存。②饲料中的添加植物精油在饲料行业主要用作诱食剂（香味剂）、抑菌防霉剂和生长促进剂等。精油作为生长促进剂的作用机理主要是改善肠道微生物菌群结构和促进消化道酶分泌。[110]G．M．Weber等研究表明在饲料中添加适量的百里香酚、丁香酚、苯甲酸和胡椒碱[111]可以显著提高肉鸡的生产性能。朱晓磊等研究饲粮中添加水平约为0.2mg/kg百里香精油能够影响麻花鸡T淋巴细胞ANAE、新城疫抗体水平和免疫球蛋白等。1.4课题的提出及论文的研究内容中药不仅有直接抗病毒作用，还能间接提高机体自身免疫力从而达到抗病毒疗效，且中药中的化学成分之间的相互作用在抗病毒作用方面起到关键作用，另外，我国中药资源丰富、价格便宜且副作用小、历史悠久，在防止病毒疾病方面具有独特的优势。因此，研究和开发具有良好抗病毒性疾病的中药具有较好的理论价值、经济价值且意义重大。本论文的研究内容如下：1.植物精油对HEK293细胞和Vero细胞最大无毒浓度的筛选。2.植物精油通过四种不同的作用方式体外抗人腺病毒和脑心肌炎病毒。3.植物精油主要成分通过四种不同作用方式体外抗人腺病毒和脑心肌炎病毒。-11- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究技术路线植物精油细胞培养病毒MTT法TCID50测定筛选对细胞无毒的最大浓度精油精油对精油对精油抗精油对细胞的病毒的病毒的细胞的保护作直接灭吸附作治疗作用活作用用用收集毒液CPE法荧光定量病毒滴度的测定筛选出具有抗病毒的精油及其有效成分结果分析-12- 兰州交通大学硕士学位论文2精油体外抗人腺病毒作用的研究2.1材料2.1.1HEK293细胞HEK293细胞由甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏2.1.2HAdV3毒株HAdV毒株购买于中国菌种保藏中心2.1.3药品百里香精油（CAS:8007-46-3，上海安耐吉化学）；牛至油（CAS：8007-11-2，广州日化化工有限公司）；艾叶油（生产批号：HE-016，广州市鸣泰贸易有限公司）；丁香油（吉安市华新天然植物有限公司）2.1.4实验仪器倒置显微镜：CK（OLYMPUSTOKYO）；光电显微镜：G16X；MSC-Advantage生物安全柜（ThermoScientific公司）二氧化碳培养箱（ThermoFisher公司）卧式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗感控设备厂）血球计数板：XB-K-25，0.1mm2，1/400mm2；MK3型酶联免疫检测仪（ThermoScientific公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）微量加样器（德国Eppendorf）电子天平（美国Ohaus）MM-1微型振荡器。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒2.1.5主要试剂⑴台盼蓝（Sigma）⑵四甲基偶氮唑蓝（MTT，Solarbio公司产品编号M8180-1000）1gMTT溶于200ml的0.01mol/L，pH=7.4PBS，浓度为5mg/ml，过滤除菌，每只1.2ml0分装后，用锡箔纸避光处理后，于-20C冰箱避光保存，备用。⑶无水乙醇（上海广诺化学科技有限公司）⑷二甲基亚砜（DMSO，上海广诺化学科技有限公司）-13- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究2+2+⑸0.01MPBS液（PhosphateBufferedSaline,PBS）：无Ca，Mg磷酸盐PBS缓冲液0.01MPBS工作液配制方法：NaCl(AR)：4g；KCl(AR)：0.1g；Na2HPO4：0.72gKH2PO4：0.12g用超纯水定溶于500ml容量瓶中，再用1mol/LNaOH调PH致7.4。最后再一次性0.22μm滤膜过滤除菌后备用。⑹新生牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）⑺高糖型DMEM培养基（Gibco）根据购买时所备说明书，DMEM干粉溶于90%终体积的蒸馏水中，碳酸氢钠加入量按照2.5g/L，补水至终体积，调节pH至7.0～7.1，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，使用时加入10%新生牛血清。⑻胰蛋白酶（Gibco）称取12gNa2EDTA、16gKCl、320gNaCl、40gC6H12O6溶于40L蒸馏水中配成平衡盐溶液，取其中10L溶解1：250的胰蛋白酶粉200g，搅拌1h后，移入至平衡盐溶液中。充分混匀，加入40mL1%酚红溶液，最后用8.8%碳酸氢钠调pH至7.8～8.0，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冷冻贮存。2.2实验方法与步骤2.2.1HEK293细胞的复苏、传代⑴HEK293细胞的复苏0从液氮中取出要复苏的细胞放入37C水中，快速摇晃直至冻存管中的冰完全溶解，以800r/min，离心10min后，弃上清，用1ml的10%NBSDMEM重悬细胞后，把含细胞的重悬液加入细胞瓶中，补入营养液至15ml后放入细胞培养箱中培养。⑵细胞的传代培养当细胞生长至致密单层后，弃去培养液，用少量0.25%胰蛋白酶轻轻的润洗细胞1遍，再加入1～2mL0.25%胰蛋白酶消化2min，倒置显微镜下观察，待细胞圆缩，弃去胰蛋白酶，用10ml全营养液轻轻吹打细胞，把细胞瓶壁上的细胞全部吹下来，并使细胞尽量形成单个个体避免结团，在以1:3或1:4的比例分瓶传代。2.2.2MTT的优化⑴细胞24h后贴壁情况-14- 兰州交通大学硕士学位论文取出一瓶细胞长势优良的细胞进行传代培养，按照正常的细胞传代方法进行传代，取出细胞悬液200μL，放入1.5ml的EP管中，再加入600μL的PBS和200μL台盼蓝，混匀。在普通光学显微镜下进行计数。把细胞以倍比稀释后以不同的细胞浓度加入96孔板中，每个浓度8个平行。24h后用倒置显微镜观察细胞的贴壁情况。⑵吸收波长的筛选40以2×10/孔细胞浓度接入96孔板中，24h后加入25μL的MTT中，放置于37C，5％CO2培养箱中4h，吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，在水平震荡器上震荡10min使生成的蓝色结晶甲瓒溶解，在免疫酶标仪上不同的波长下测其OD值。⑶接种细胞数的筛选取出一瓶细胞长势优良的细胞进行传代培养，按照正常的细胞传代方法进行传代，取出细胞悬液200μL，放入1.5ml的EP管中，再加入600μL的PBS和200μL台盼蓝，混匀。在普通光学显微镜下进行计数。把细胞以倍比稀释后以不同的细胞浓度加入960孔板中，每个浓度8个平行。24h后加入25μL的MTT中，放置于37C，5％CO2培养箱中4h，吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，在水平震荡器上震荡10min使生成的蓝色结晶甲瓒溶解，在免疫酶标仪上一定的波长下测其OD值。⑷最适MTT加入量的筛选4以2×10/孔细胞浓度接入96孔板中，24h后加入不同量的MTT，使其终浓度为0.5、00.75、1、1.25、1.5、1.6、2.5mg/ml。放置于37C，5％CO2培养箱中4h，吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，在水平震荡器上震荡10min使生成的蓝色结晶甲瓒溶解，在免疫酶标仪上一定的波长下测其OD值。⑸加入MTT后最佳反应时间40以2×10/孔细胞浓度接入96孔板中，24h后加入25μL的MTT中，放置于37C，5％CO2培养箱中，吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，在水平震荡器上震荡10min使生成的蓝色结晶甲瓒溶解，在免疫酶标仪上不同的波长下测其OD值。2.2.3酒精对HEK293细胞的毒性⑴酒精的稀释用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物溶剂无水乙醇按照不同的比例进行稀释。按照10倍梯度稀释，最后稀释成10、100、200、1000、10000倍。⑵接种含酒精的培养基吸弃24孔板中的营养液，加入含不同酒精的3％新生牛血清的DMEM维持液，每个浓度设置4个平行孔，每孔1mL，并设置一组对照组。细胞对照组只含有3％新生牛0血清的DMEM维持液。放置37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。连续3d进行CPE的观察。并在第72h进行拍照。-15- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究2.2.4精油对HEK293细胞的毒性试验⑴96孔细胞培养板单层细胞的制备取能在48h长成胞质清晰、细胞形态良好的单层细胞，按照正常传代方法将细胞消化后制备成10ml均一悬液，在光学显微镜下，用血细胞计数器对细胞悬液进行计数，4再用DMEM细胞培养液将细胞稀释到每100μL中含有2×10个。每孔100μL细胞悬液0于96孔细胞培养板中。置于37C，5％CO2培养箱中，培养24h后即可以长成细胞单层，可以把精油加入细胞中。⑵药物处理①稀释精油无水乙醇与百里香精油按照1:100的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:500、1:1000、1:10000、1:100000的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与牛至油精油按照1:100的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:500、1:1000、1:10000、1:100000的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与艾叶草精油按照1:20的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与丁香油精油按照1:20的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。②接种含稀释好的含不同浓度精油的营养液吸弃96孔板中的营养液，加入含不同精油的3％新生牛血清的DMEM维持液，每个浓度设置4个平行孔，每孔100μL，并设置正常细胞对照组和空白对照组。细胞对照0组只含有3％新生牛血清的DMEM维持液。放置37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。连续3d进行CPE的观察。72h后进行MTT的测定。⑶数据整理分析通过比较72h后细胞CPE和MTT值并绘制相应的表格。来判断细胞的生长与精油之间的关系。①四甲基偶氮唑蓝(MTT)法数据加入精油后的细胞培养至72h时，直接向孔中加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，50mg/ml)25μL，放入37C，5％CO2培养箱中继续培养，4h后吸弃孔中液体，每孔加120-16- 兰州交通大学硕士学位论文μL的DMSO，于水平振荡器上振荡10min，使MTT甲瓒结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪于波长为492/630nm处测定OD值。②统计学处理根据精油对细胞的影响所测得的MTT数据来计算精油对细胞的抑制百分率，采用SPPS18.0软件对半数细胞毒性浓度TC50进行Probit回归法计算。用线性回归法评价药物浓度与细胞存活率间的量效关系是否具有统计学意义，P<0.05时认为差异具有统计学意义。细胞对照OD值-药物试验组OD值抑制百分率(%)1002.1细胞对照OD值-空白对照OD值50%-小于50%抑制百分率TCAntilog(BC2.250大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率A=log大于50%药物浓度B=log小于50%药物浓度C=A-B2.2.5HAdV3毒株的扩增、保存、鉴定及TCTD50的测定⑴病毒的扩增与保存按照正常细胞传代的方法对生长良好的HEK293细胞按1比4的比例进行传代培养，按照当细胞长至80％时接入2ml腺病毒。并设阴性对照组。把接种病毒的细胞，0放置于37C，5％CO2培养箱中培养，6h后把营养液弃掉，再加入3％NBSDMEM营养液15ml，继续放入培养箱中进行培养，每天观察细胞CPE的变化，当CPE达到+++0以上收获细胞，用枪尖轻轻吹打细胞使其脱落。在4C，1000rap/min离心10min后，弃上清，再用1mlPBS重悬细胞，并把其转移至1.5ml离心管中，相同条件下离心，弃上0清后，在用100μLPBS重悬细胞，分装保存后，经3次反复冻融后，置于-70C保存，备用（每一瓶T50）。⑵病毒的鉴定①HAdV3引物设计及合成参照GenBank上已有的HAdV3序列（NC_011203.1），选择相对保守的基因序列Hexon及Fiber应用Primer5.0引物设计软件进行相关基因的引物设计，相关引物由上海生工生物工程有限公司合成。（见表2.1）表2.1HAdV3Hexon和Fiber反应引物Table2.1ThereactionprimersofHAdV3HexonandFiber引物名称引物序列产物大小Hexon-RCCCCGTTTCCCTTTTTTAGC952bpHexon-FACCTTTAGACATGGCTTCGTGCFiber-RTAGACCAGCATTCAAGGACCATA630bpFiber-FCCCCTAACAAAGTCAAACCATTC-17- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究②病毒DNA提取参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，选取HAdV3毒液进行病毒DNA的提取，方法如下：用移液枪把200μL已经平衡至室温的样品加入到含有20μLProteinaseK的1.5mL离心管中；加入CarrierRNA工作液200μL，涡旋振荡15sec混匀；0把混合好的液体放在56C孵育15min，离心收集液体；加入250μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，混匀后室温静置5min；（注意：如果环境0温度高于25C时，应加入预冷后的无水乙醇）通过简短离心收集附着在管壁及管盖上的液体；将离心管内的液体和絮状沉淀轻轻的转移到RNase-Free吸附柱CR2，8000r/min离心1min，弃掉废液，把吸附柱原放回收集管中；加入500μLGD，8000r/min离心1min，弃掉废液；重复此步骤一次；加入500μL无水乙醇，8000r/min离心1min，弃掉废液；将吸附柱在室温中晾干3min，使吸附柱中的吸附膜完全变干；将吸附柱放入一个RNase-Free离心管中，悬空滴加60μLRNase-FreeddH2O，室温静置5min，12000r/min离心1min；0将得到的DNA放于-80C保存，备用。③HAdV3Hexon和Fiber扩增反应25μL的反应体系为：DEPC.H2O18.5μL10×PCRbuffer2.5μLdNTPS(10mM)0.5μL外引物10.5μL外引物20.5μLDNA模板2.0μL总体系25.0μL00混匀后，放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件为：94C预变性5min；94C变000性45sec，45C退火60sec，72C延伸90sec，32次循环；72C延伸10min。⑶TCTD50的测定①96孔板单层细胞的制备-18- 兰州交通大学硕士学位论文取长成单层的状态良好的细胞培养物(通常为48h培养物)，按正常细胞传代方法进行，按照1比4的比例稀释细胞悬液，再以200μL/孔的量接种到96孔板中，放入细胞培养箱中培养48h。②接种病毒用无血清的DMEM营养液来稀释病毒液，将待测病毒作连续10倍梯度稀释，从-1-1010到10一共10个稀释度，用排枪慢慢的吸去96孔板中细胞营养液。在用无血清的营养液吸细胞一遍，将不同稀释度的病毒液接种于单层细胞的96孔细胞培养板，每个浓度设8孔重复，每孔0.1mL。同时设正常细胞对照，细胞对照孔不加病毒而加入无血0清的营养液。置37C，5%CO2培养箱中培养2h。再用含3％新生牛血清的DMEM进行0补液，每孔再加入0.1mL。继续放入37C，5%CO2培养箱中连续培养5d，再进行毒价的判定。③结果观察与TCID50计算通过参照正常对照组的细胞，观察病毒接种孔细胞病变(CytopathicEffect，CPE)情况。判定CPE的指标：“-”，细胞无病变;“+”，25%以下的细胞有小部分病变，细胞存在圆缩、脱落、裂解；“++”，25%~50%的细胞病变增多；“+++”，50%~75%的细胞病变明显；“++++”，75%~100%的细胞病变。病毒引起细胞病变的毒力滴度以TCID50（Mediantissuecultureinfectivedose）表示，即使50%（半数）细胞出现的最高病毒稀释度，简称TCID50。细胞病变的记录以对照细胞完好为准，病变不再继续发展时，细胞对照仍完好时结束记录。病毒的半数感染量[112]（TCID50）的计算按Reed-Muench法计算。2.2.6精油体外抗HAdV3的作用⑴细胞的制备按照正常传代细胞的方法，从T50传到T25的细胞培养瓶中，当细胞培养48h后，细胞长至单层后，即可使用药物和病毒处理。⑵精油的稀释依据精油对HEK293细胞的毒性试验的结果筛选出所选精油对HEK293细胞的最大无毒浓度，采用倍比稀释法用细胞维持液将药物稀释成5个浓度。百里香精油组：（100μL/L、50μL/L、25μL/L、12.50μL/L、6.25μL/L）；牛至油组（12.50μL/L、6.25μL/L、3.13μL/L、1.56μL/L、0.78μL/L）；艾叶油（250μL/L、125μL/L、62.50μL/L、31.25μL/L、15.62μL/L）；丁香油（125μL/L、62.50μL/L、31.25μL/L、15.63μL/L、7.81μL/L）；利巴韦林组：100mg/L⑶病毒的稀释-19- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究依据实验所测得的HAdV3毒株的TCID50，用无血清DMEM将病毒液稀释成相应倍数，即100TCID50/100μL。⑷实验分组正常细胞对照组；病毒对照组；利巴韦林组；百里香精油组；牛至油组；艾叶油组；丁香油组。⑸四种加药方式①精油对细胞的保护作用0在已长成单层细胞的细胞瓶中，每瓶加入不同浓度的药物组2ml，于37C，5％CO2培养箱中作用3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，再加入2ml的100TCID500的人腺病毒液，置于37C，5％CO2培养箱吸附3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，每一个浓度设3个重复，每天观察CPE，连续培养6d。收集细胞并用1ml无血清营养液重悬细胞，进行三次反复冻融后再进行TCID50的检测。②药物对人腺病毒直接灭活作用0不同浓度的药物组分别与100TCID50的人腺病毒液各2ml等体积混合，于37C，5％0CO2培养箱中作用3h后加入已长成单层细胞的细胞瓶中，放置于37C，5％CO2培养箱0中吸附3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。③在生物合成阶段药物对腺病毒的作用0把2ml的100TCID50的人腺病毒液接种于已长成单层细胞的细胞瓶中，于37C，5％CO2培养箱中吸附3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，加入不同浓度的药物组02ml置于37C，5％CO2培养箱中吸附3h，弃去含药物的营养液用无血清的营养液缓慢0的润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。④药物抗人腺病毒吸附作用不同浓度的药物组分别与100TCID50的人腺病毒液各2ml等体积混合后立即加入已0长成单层细胞的细胞瓶中，37C，5％CO2培养箱中吸附3h，用无血清的营养液缓慢的0润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中，每天观察CPE，连续培养6d。其余方法同①。2.3结果2.3.1MTT的优化⑴MTT法的最佳条件的筛选①细胞24h后贴壁情况-20- 兰州交通大学硕士学位论文4通过倒置显微镜下观察得知，经过24h培养后，96孔板中浓度为2.5×10各孔细胞长势好并能恰好长成致密单层，大于此浓度细胞太密，形态小不易观察。故以下实验选4取2.5×10为细胞接种密度。表2.224h后不同接种细胞密度的贴壁情况Table2.2Differentinoculationadherentcelldensityafter24hours4项目细胞接种密度(×10)0.6251.122.5512.1CPE+++++++++++++++++②吸收波长的筛选各孔加入MTT后，能观察到针状蓝紫色结晶甲瓒出现，随即加入DMSO，为了使结晶完全溶解，在振荡10min即可，通过选用不同的波长进行吸光度的测定，见图2.1。在492nm处吸光值最大与文献报道相符，本实验选用双波长492/630nm。图2.1MTT裂解产物吸收光谱Figure2.1DeterminedbyMTTpyrolysisproductabsorptionspectra③接种细胞数的筛选4HEK293细胞的细胞数与接种量关系在0.08-2×10个/孔范围内，细胞数与吸光度A具有良好的线性正相关性，此时吸光度可以较好的反应存活细胞的数量，当细胞数量4小于2×10，则结果重复性差；且随着细胞密度的增加则会出现坪台期（Plateau）（图42.2）。筛选出最优的细胞接种量为2×10个/孔。-21- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究图2.2HEK293细胞接种量与吸光度值之间的关系Figure2.2TherelationshipbetweenHEK293cellsinoculationamountandtheabsorbancevalues④最适MTT加入量的筛选当MTT浓度小于1.6mg/ml时，随MTT浓度增大吸光度值也增大，但当浓度大于1.6mg/ml时，吸光度值随着浓度的增加反而下降（图2.3）。故选取1.5mg/ml作为本试验MTT投加的终浓度可使吸光度达最大值，即在100μL中的培养基加入5mg/ml的MTT25μL取得较好的试验效果。图2.3MTT加入量与吸光度之间的关系Figure2.3TherelationshipbetweenabsorbancefortheamountofdeterminedbyMTT⑤DMSO量的筛选-22- 兰州交通大学硕士学位论文当进行DMSO来溶剂甲瓒时，在一定接种细胞数数时，随着DMSO量的不同吸光度值不断的增高，但每孔加入120μL后吸光度值没有明显的增高反而出现下降的趋势，故本实验最佳DMSO最佳溶解量为每孔120μL。图2.4MTT加入量与DMSO量之间的关系Figure2.4TherelationshipbetweentheaddtionofMTTandthequantityofDMSO⑥MTT作用时间的筛选当加入MTT后，在4h前，A值随时间的增加也相应的升高；4h后，A值随着孵育时间的增加逐渐降低，（图2.5）。平行孔的MTT作用时间均表现一致，本实验选择4h为MTT加入后的最佳孵育时间。图2.5MTT孵育时间与吸光度之间的关系Figure2.5TherelationshipbetweenDeterminedbyMTTincubationtimeandabsorbance-23- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究4最优的组合：双波长492/630nm、细胞接种量为2×10个/孔、5mg/ml的MTT25μL、最佳DMSO最佳溶解量为每孔120μL、MTT加入后的最佳孵育时间为4h。2.3.2酒精对HEK293细胞的毒性通过加入不同酒精浓度的维持液到长至单层的HEK293细胞上，培养了72h后通过观察细胞的CPE来观察酒精对细胞的毒性。当酒精浓度在10％时，对细胞毒性强能使细胞变圆、破碎如（图2.6a）所示。当酒精浓度小于或等于1％时，酒精对细胞无明显影响如（图2.6bcde）。图2.6不同浓度酒精对HEK293细胞的毒性（CPE）Fig.2.6EffectsofdifferentconcentrationsofalcoholonHEK293cells注1)(a)10％乙醇(b)1％乙醇(c)0.5％乙醇(d)0.1％乙醇(e)0.01％乙醇(f)对照组Note1)(a):10%ethanol(b):1%ofethanol(c):0.2%ethanol(d):0.1%ethanol(e):0.01%ethanol(f):controlgroup2.3.3精油对HEK293细胞的毒性⑴CPE结果在对精油对所选细胞毒性试验中，在倒置显微镜观察下没有用精油处理过的细胞即对照组排列整齐紧密、胞质清晰，当加入精油后呈现毒性的细胞主要表现为细胞圆缩、死细胞增多、细胞状态不好生长变慢。在精油安全浓度范围内的细胞则单层良好，死细胞少，与正常细胞对照组差别较小。①百里香精油对HEK293细胞的毒性的CPE结果百里香精油的稀释10倍后，对HEK293细胞存在非常明显的影响，细胞表现为：细胞形态变圆、不贴壁甚至死亡。当稀释到100倍时细胞的生长状态明显变好，死细胞变少。稀释到500倍后细胞生长的状态与正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为161.68μL/L。CPE结果如表2.3所示。-24- 兰州交通大学硕士学位论文表2.3百里香精油对HEK293细胞的毒性结果（CPE）Table2.3ToxiceffectsofthymeoilonHEK293cells稀释倍数细胞对22345药物10105×10101010照组TC50-+++++++++++++++++++++++++++百里香精油-+++++++++++++++++++++++++++/（起始浓度-+++++++++++++++++++++++++++161.68μLL10000μL/L）-+++++++++++++++++++++++++++-+++++++++++++++++++++++++++②牛至油对HEK293细胞的毒性的CPE结果牛至油的稀释100倍后，对HEK293细胞的明显影响，细胞表现为：细胞形态变圆、不贴壁甚至死亡。当稀释到200倍时细胞的生长的状态与正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为35.15μL/L。CPE结果如表2.4所示。表2.4牛至油对HEK293细胞的毒性结果（CPE）Table2.4ToxiceffectsoforeganooilonHEK293cells稀释倍数×100TC50药物对照组1248163264牛至油-+++++++++++++++++++++++++++++++++++（起始-+++++++++++++++++++++++++++++++++++浓度-+++++++++++++++++++++++++++++++++++35.15μL/L10000-+++++++++++++++++++++++++++++++++++μL/L）-+++++++++++++++++++++++++++++++++++③艾叶油对HEK293细胞的毒性的CPE结果艾叶油的稀释100倍后，对HEK293细胞有一定的影响，细胞表现为：部分细胞不能很好贴壁且形态变圆，存在少量的死细胞。当稀释到200倍时细胞的生长的状态与正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为2031.96μL/L。CPE结果如表2.5所示。-25- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究表2.5艾叶油对HEK293细胞的毒性结果（CPE）Table2.5ToxiceffectsofblumeaoilonHEK293cells稀释倍数×100细胞对药物TC50124816照组+++++++++++++++++++++++++++艾叶油（起始++++++++++++++++++++++++++/浓度++++++++++++++++++++++++++++2031.96μLL50000μL/L）++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++④丁香油对HEK293细胞的毒性的CPE结果丁香油的稀释小于200倍，能使HEK293细胞不能存活，细胞表现为：细胞不能很好贴壁且形态变圆，最后死亡。当稀释到400倍到1600倍时，细胞的生长的状态逐渐变好，死细胞逐渐变少。1600倍以后与正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为184.18μL/LCPE结果如表2.6所示。表2.6丁香油对HEK293细胞的毒性结果（CPE）Table2.6ToxiceffectsofcloveoilonHEK293cells稀释倍数×100细胞对药物TC5012481632照组--++++++++++++++++++++丁香油（起--++++++++++++++++++++/始浓度--++++++++++++++++++++++184.18μLL50000μL/L--++++++++++++++++++++++--++++++++++++++++++++综上所述：百里香精油、牛至油、艾叶油、丁香油对HEK293细胞的最大无毒浓度分别为：20μL/L、50μL/L、250μL/L、125μL/L。根据Reed-Muench法计算出4种精油的TC50分别为：161.68μL/L、35.145μL/L、2031.963μL/L、184.18μL/L。⑵MTT法结果以Means±SD表示所测的OD值，并依据Reed-Muench法计算出4种精油的存活率百里香精油、牛至油、艾叶油、丁香油（表2.7所示）。-26- 兰州交通大学硕士学位论文表2.7MTT法测定各种精油对HEK293细胞的毒性Table2.7DeterminedbyMTTmethodtodeterminetoxicityofvariouskindsofessentialoilinHEK293cells精油精油浓度MTT值存活率（μL/L）10000.1657±0.06880.157±0.06541000.6833±0.05260.650±0.0500200.8720±0.05220.829±0.0497百里香精油100.8797±0.02220.837±0.021110.9093±0.05880.865±0.059901.0507±0.01550.999±.014781000.0208±0.00320.018±0.0028501.0700±0.07690.952±0.0684251.1626±0.03551.034±0.031612.51.1710±0.02231.041±0.0199101.1294±0.05201.004±0.0462牛至油6.251.1756±0.04821.045±0.04290.948±0.03843.131.0658±0.04321.561.1066±0.05120.984±0.045511.0654±0.03640.947±0.03240.781.1250±0.05771.000±0.051301.1432±0.04911.017±0.043645000.7877±0.11700.7199±0.10692500.9337±0.04600.8534±0.04211250.9940±0.03320.9085±0.0304艾叶油62.51.0187±0.01960.9311±0.018031.251.0377±0.06810.9485±0.062301.0947±0.06241.0000±0.05705000.0093±0.00410.0093±0.00412500.1688±0.11150.1689±0.11161250.9100±0.05740.9111±0.0574丁香油62.50.9892±0.02020.9904±0.020231.250.9493±0.08140.9503±0.081515.6250.9575±0.07440.9587±0.074500.9988±0.08391.0072±0.08402.3.4HAdV3毒株的鉴定及TCTD50的测定结果⑴HAdV3Hexon和FiberPCR扩增反应结果-27- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究经过上述体系的反应，电泳结果据出现明显条带，大小正确，与预期设计效果相符，说明所使用的病毒即为人腺病毒3型。如图2.7所示。图2.7人腺病毒Hexon和FiberPCR扩增Fig.2.7AdenovirusHexonandFiberPCRamplification注2)M:100bpMark1:fiber2:hexon⑵病毒TCID50测定结果HAdV毒株接种于HEK293细胞上48h左右开始出现病变，明显的CPE主要表现为细胞肿胀变圆，折光度增强，聚集成葡萄串状，最后脱落坏死。如图2.8所示。图2.8HAdV3感染HEK293细胞Fig.2.8HAdV3infectionHEK293cells依据Reed-Muench的终点稀释法测其半数组织细胞感染量（TCID50），将病毒原液进行10倍梯度稀释，测得不同稀释度下对应下的病毒液所导致的细胞病变（CPE）情况如下表2.8所示。距离比例=（高于50％病变率的百分数-50％）（高于/50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数）lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数根据表中的实验数据及计算公式可得出HAdV3在HEK293细胞上的病毒滴度5.77TCID50为10TCID50/mL。本实验使用100TCID50。-28- 兰州交通大学硕士学位论文表2.8HAdV3毒株感染HEK293细胞后第5dCPE结果Table2.8TheresultofCPEafterHAdV3straininfectioninHEK293cells5days病毒液稀释倍数对照1234567891010101010101010101010组++++-------++++-------++++-------HAdV3++++-------毒株++++-------+++--------+++--------+++--------注1)“+”表示细胞病变，“-”表示细胞无病变。Note1)+cytopathiceffect,-nocellschange2.3.5精油体外抗HAdV3的作用实验结果⑴精油体外抗HAdV3的作用的CPE结果①百里香精油体外抗HAdV3的作用的CPE结果图2.920μL/L百里香精油四种作用方式体外抗人腺病毒CPE（6d）Fig.2.9InhibitioneffectofThymeoil(20μL/L)onCPEinducedbyHAdv3onHEK293cells注3)(a)阴性对照；(b)阳性对照；(c)百里香精油对细胞保护作用；(d)百里香精油对腺病毒治疗作用；(e)百里香精油对腺病毒直接灭活作用；(f)百里香精油对腺病毒吸附阶段作用。/Note3)(a):Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(c):ProtectiveeffectofThymeoil(20μLL)oncells/(d):TherapeuticallyeffectofThymeoil(20μLL)onhuman-adenovirus(e):Directinactivatedeffectof//Thymeoil(20μLL)onhumanadenovirus(f):EffectofThymeoil(20μLL)preventingtheabsorptionofhumanadenovirus.20μL/L百里香精油通过体外四种不同作用方式后CPE结果的分析如下：在保护作用（图2.9c）、治疗作用（图2.9d）、百里香精油对腺病毒吸附作用（图2.9f）与阳性对照组（图2.9b）相比较，细胞的CPE无明显的差异，都出现了细胞严重拉网现象，-29- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究而在百里香精油对腺病毒直接灭活作用（图2.9e）下，细胞CPE并未表现出明显的拉网现象，接近阴性对照组CPE。②牛至油体外抗HAdV3的作用的CPE结果图2.1050μL/L牛至油四种作用方式体外抗人腺病毒CPE（6d）Fig.2.10InhibitioneffectoforiganumoilonCPEinducedbyHAdv3onHEK293cells注4)(a)阴性对照；(b)阳性对照；(c)牛至油对细胞保护作用；(d)牛至油对腺病毒治疗作用；(e)牛至油对腺病毒直接灭活作用；(f)牛至油对腺病毒吸附阶段作用。12.5μL/L牛至油抗病毒吸附作用(48h)。Note4)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(c):Protectiveeffectoforiganumoil(50μL/L)oncells(d):Therapeuticallyeffectoforiganumoil(50μL/L)onHAdv3(e):Directinactivatedeffectoforiganumoil(50μL/L)onHAdv3(f):Effectoforiganumoil(50μL/L)preventingtheabsorptionofHAdv3.牛至油通过体外四种不同的作用方式后CPE的结果分析如下：牛至油浓度为50μL/L时对腺病毒感染HEK293细胞起到一定的保护作用，且与病毒对照组相比较能明显降低病毒导致细胞的CPE（图2.10c）。但是作用还是不够强。在治疗作用（图2.10d）、直接灭活作用（图2.10e）、抗病毒吸附作用（图2.10f）四种作用方式下CPE的变化与阳性对照组相比较差异并不明显，都出现了明显的病变现象。③艾叶油体外抗HAdV3的作用的CPE结果250μL/L艾叶油对腺病毒感染HEK293细胞的四种作用方式如下：对细胞的保护作用（图2.11c）、治疗作用（图2.11d）、直接灭活作用（图2.11e）、抗病毒吸附作用（图2.11f）这四种作用方式下CPE的变化与阳性对照组相比较下差异并不明显，都出现明显的拉网病变现象。-30- 兰州交通大学硕士学位论文图2.11250μL/L艾叶油四种作用方式体外抗人腺病毒CPE（6d）Fig.2.11InhibitioneffectofblumeaoilonCPEinducedbyHAdv3onHEK293cells注5)(a)阴性对照；(b)阳性对照；(c)艾叶油对细胞保护作用；(d)艾叶油对腺病毒治疗作用；(e)艾叶油对腺病毒直接灭活作用；(f)艾叶油对腺病毒吸附阶段作用。Note5)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(c):Protectiveeffectofblumeaoil(250μL/L)oncells(d):Therapeuticallyeffectofblumeaoil(250μL/L)onHAdv3.(e):Directinactivatedeffectofblumeaoil(250μL/L)onHAdv3.(f):Effectofblumeaoil(250μL/L)preventingtheabsorptionofHAdv3.④丁香油体外抗HAdV3的作用的CPE结果图2.1231.25μL/L丁香油四种作用方式体外抗人腺病毒CPE（6d）Fig.2.12InhibitioneffectofCloveOilonCPEinducedbyHAdv3onHEK293cells注6)(a)阴性对照；(b)阳性对照；(c)丁香油对细胞保护作用；(d)丁香油对腺病毒治疗作用；(e)丁香油对腺病毒直接灭活作用；(f)丁香油对腺病毒吸附阶段作用。Note6)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(c):ProtectiveeffectofCloveOil(31.25μL/L)oncells(d):TherapeuticallyeffectofCloveOil(31.25μL/L)onHAdv3.(e):DirectinactivatedeffectofCloveOil(31.25μL/L)onHAdv3.(f):EffectofCloveOil(31.25μL/L)preventingtheabsorptionofHAdv3-31- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究31.25μL/L丁香油对腺病毒感染HEK293细胞的四种作用方式如下：对细胞的保护作用（图2.12c）、治疗作用（图2.12d）、直接灭活作用（图2.12e）、抗病毒吸附作用（图2.12f）这四种作用方式下CPE的变化与阳性对照组相比较下差异并不明显，都出现明显的拉网病变现象。⑤利巴韦林体外抗HAdV3的作用的CPE结果图2.13利巴韦林阳性药物体外抗腺病毒CPE（6d）Fig.2.13InhibitioneffectofribavirinonCPEinducedbyHAdv3onHEK293cells注7)(a)阴性对照；(b)阳性对照；(c)利巴韦林对细胞保护作用；(d)利巴韦林对腺病毒治疗作用；(e)利巴韦林对腺病毒直接灭活作用；(f)利巴韦林对腺病毒吸附阶段作用Note7)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(c):Protectiveeffectofribavirinoncells(d):TherapeuticallyeffectofribavirinonHAdv3(e):DirectinactivatedeffectofribavirinonHAdv3(f):EffectofribavirinpreventingtheabsorptionofHAdv3.用通过倒置显微镜观察对照组细胞排列整齐紧密、轮廓清楚、胞质清晰（图2.13a）病毒对照组HEK293细胞CPE表现为细胞肿胀变圆，折光度增强，聚集成葡萄串状，最后脱落坏死（图2.13b）。利巴韦林药物组四种作用方式抗人腺病毒效果并不十分明显的效果。（图2.13c、d、e、f）。⑵精油抑制病毒增殖作用在上述研究的基础上，对作用较明显药物测定了其抑制人腺病毒增殖的作用。结果表明，百里香精油浓度为20μL/L时，在直接灭活作用方式下，病毒的滴度与病毒对照5.334组比，HAdV3病毒滴度由10TCID50/mL下降到10TCID50/mL。牛至油浓度为50μL/L时，在对细胞的保护作用方式下，病毒的滴度与病毒对照组比，HAdV3病毒滴度由4.663.8310TCID50/mL下降到10TCID50/mL。通过上述结果中腺病毒滴度的变化，说明百里香精油及麝香草酚在直接灭活作用方式或治疗作用方式下具有一定的抑制腺病毒增殖的作用。而牛至油的滴度下降不是很明显，体现了牛至油对细胞保护的作用不是很强。艾叶油、丁香油病毒的滴度与对照组相比并无明显差异。-32- 兰州交通大学硕士学位论文2.4小结与分析HAdV感染范围广，主要易感人群包括幼儿、艾滋病人、移植手术者及免疫遗传缺陷等这些免疫抵抗功能低下的人。致病临床症状主要表现为，呼吸道感染、角膜结膜炎、胃肠道感染、泌尿系统感染及其他系统疾病。目前，没有有效的药物用于抗腺病毒感染的治疗，只有几种传统抗病毒药物如更昔洛韦、阿糖腺苷、病毒唑、西多福韦等用病例治疗。其副作用主要是引起温和可逆的镰状细胞贫血，但是对处于传播腺病毒高发期的[113]病人，疗效不明显。在新药的研究中，同样发现植物精油也能对病毒在某一种程度上起到抑制的作用，本实验研究的四种精油中，发现百里香精油在体外能一定程度的直接灭活人腺病毒，牛至油次之。植物精油对细胞的安全浓度筛选选中，由于植物精油不能直接溶于培养基中，必须要先用一些助溶剂进行溶解精油后，再溶解到细胞培养基中，细胞体外培养的好坏在毒理学和药理学中显得尤为重要。然而，有机溶剂不仅会对细胞产生毒副作用而且不同比[114,115]例的有机溶剂对不同细胞系的毒性作用也存在一定的差异。所以就必须先考虑所选的助溶剂即能很好的溶解精油又能最小限度的减小对细胞的伤害。避免受到所选的溶剂影响，本实验选用DMSO、吐温、无水乙醇进行预实验发现用无水乙醇效果最好，且1％的乙醇对细胞生长无明显影响。评价药物毒性的方法很多如CPE法、染料排斥法、MTT法、计数法、克隆形成法和同位素掺入法。它们各自有着自己的优缺点，最长用的方法是CPE法和MTT。CPE法操作简单，但容易受个人主观影响。MTT法优点是快速、检测量大、准确性高、成本小检、出率高等。但是在实验中容易受到很多方面的影响，比如当加入MTT4h后，需弃掉液体时容易把沉淀一起弃掉，导致影响实验的真实性。本实验采取两种方法相结合来进行精油对细胞的毒性实验。在做精油抗病毒实验时，正常细胞对照组表现为细胞单层完整、轮廓清晰、折光率好；而病毒对照组拉网、萎缩变圆等。本实验在四种不同的抗病毒作用方式下，初步探讨了植物精油抗病毒的机理，结果表明百里香精油浓度为20μL/L时，对人腺病毒有一定直接灭活的作用；50μL/L牛至油对细胞也起到一定的保护作用。-33- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究3精油体外抗脑心肌炎病毒作用的研究3.1材料3.1.1Vero细胞Vero细胞（甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏）3.1.2EMCV毒株EMCV毒株（甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏）3.1.3药品百里香精油（CAS:8007-46-3，上海安耐吉化学）；牛至油（CAS：8007-11-2，广州日化化工有限公司）；艾叶油（生产批号：HE-016，广州市鸣泰贸易有限公司）；丁香油（吉安市华新天然植物有限公司）。3.1.4实验仪器倒置显微镜：CK（OLYMPUSTOKYO）；光电显微镜：G16X；MSC-Advantage生物安全柜（ThermoScientific公司）二氧化碳培养箱（ThermoFisher公司）卧式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗感控设备厂）血球计数板：XB-K-25，0.1mm2，1/400mm2；MK3型酶联免疫检测仪（ThermoScientific公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）微量加样器（德国Eppendorf）电子天平（美国Ohaus）MM-1微型振荡器。PCR仪（德国Biometra）3.1.5试剂台盼蓝（Sigma）四甲基偶氮唑蓝（MTT，Solarbio公司产品编号M8180-1000）无水乙醇（上海广诺化学科技有限公司）二甲基亚砜（DMSO，上海广诺化学科技有限公司）新生牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）高糖型DMEM培养基（Gibco）-34- 兰州交通大学硕士学位论文胰蛋白酶（Gibco）总RNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）3.2实验方法与步骤3.2.1Vero细胞的复苏、传代⑴Vero细胞的复苏0从液氮中取出要复苏的细胞放入37C水中，快速摇晃直至冻存管中的冰完全溶解，以800r/min，离心10min后，弃上清，用1ml的10%NBSDMEM重悬细胞后，把含细胞的重悬液加入细胞瓶中，补入营养液至15ml后放入细胞培养箱中培养。⑵细胞的传代培养取出一瓶细胞长势优良的Vero细胞进行传代培养，当细胞生长至致密单层后，弃去培养液，用少量0.25%胰蛋白酶润洗细胞1遍，再加入1～2mL0.25%胰蛋白酶消化2min，倒置显微镜下观察，待细胞完全圆缩，弃去胰蛋白酶，用10ml全营养液轻轻吹0打细胞后按照1：4的比例进行稀释细胞悬液。放入37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。3.2.2酒精对Vero细胞的毒性⑴酒精的稀释用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物溶剂无水乙醇按照不同的比例进行稀12345释。按照10倍梯度稀释，最后稀释成10、10、10、10、10倍。⑵接种含酒精的细胞培养液吸弃24孔板中的营养液，加入含不同酒精的3％新生牛血清的DMEM维持液，每个浓度设置4个平行孔，每孔1mL，并设置一组对照组。细胞对照组只含有3%新生牛0血清的DMEM维持液。放置37C，5%CO2培养箱中进行72h培养。连续3d进行CPE的观察。并在第72h进行拍照。3.2.3精油对Vero细胞的毒性试验⑴用MTT法筛选Vero在24h长成单层的接种密度按照正常细胞传代的方法，消化、吹打细胞，在光学显微镜下，对细胞悬液计数，再对细胞悬液进行倍比稀释后，按每孔接入100μL细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，当培养至24h后，停止培养。通过CPE和MTT进行结果的判断。⑵96孔细胞培养板单层细胞的制备取能在48h长成胞质清晰、细胞形态良好的单层细胞，按照正常传代方法将细胞消化后制备成10ml均一悬液，在光学显微镜下，用血细胞计数器对细胞悬液进行计数，4再用DMEM细胞培养液将细胞稀释到每100μL中含有2×10个。每孔100μL细胞悬液-35- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究0于96孔细胞培养板中。置于37C，5％CO2培养箱中，培养24h后即可以长成细胞单层，可以把精油加入细胞中。⑶药物处理①稀释精油无水乙醇与百里香精油按照1:100的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与牛至油精油按照1:100的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与艾叶草精油按照1:20的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。无水乙醇与丁香油精油按照1:20的比例来配制，用含3％新生牛血清的DMEM维持液将药物按照1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600的比例进行稀释。在稀释之前，先用0.22μm微孔滤膜对精油抽滤除菌。所有浓度都是现配现用。⑷接种含稀释好的含不同浓度精油的营养液吸弃96孔板中的营养液，加入含不同精油的3％新生牛血清的DMEM维持液，每个浓度设置4个平行孔，每孔100μL，并设置正常细胞对照组和空白对照组。细胞对照0组只含有3％新生牛血清的DMEM维持液。放置37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。连续3d进行CPE的观察。72h后进行MTT的测定。⑸数据整理分析取第3天，即72h的CPE记录成表，与MTT数据作比较。①四甲基偶氮唑蓝(MTT)法数据03d(72h)后直接向孔中加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg/ml)25μL，放入37C，5％CO2培养箱中继续培养4h后吸弃孔中液体，每孔加120μL的DMSO，于水平振荡器上振荡10min，使MTT甲瓒结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪于492/630nm处测定OD值。②统计学处理根据精油对细胞CPE数据与MTT数据来计算精油对细胞的抑制百分率，采用SPPS18.0软件对半数细胞毒性浓度TC50进行Probit回归法计算。用线性回归法评价药-36- 兰州交通大学硕士学位论文物浓度与细胞存活率间的量效关系是否具有统计学意义，P<0.05时认为差异具有统计学意义。3.2.4EMCV毒株的扩增、保存及TCTD50的测定⑴病毒的扩增与保存按照正常细胞传代的方法对生长良好的Vero细胞按1比4的比例进行传代培养，按照当细胞长至80％时接入2mlEMCV毒液。并设阴性对照组，把接种病毒的细胞，0放置于37C，5％CO2培养箱中培养，2h后把营养液弃掉，再加入3％NBSDMEM营养液15ml，继续放入培养箱中进行培养，每天观察细胞CPE的变化。当CPE达到+++00以上收获细胞，把细胞放入-20C内反复冻融3次，在4C，8000rap/min离心10min后，0收集上清，并把其分装至1.5ml离心管中，置于-70C保存，备用。⑵TCTD50的测定①96孔板单层细胞的制备取长成单层的状态良好的细胞培养物(通常为48h培养物)，细胞传代方法，将细胞单层洗涤、消化、吹散后，按照正常的比例稀释细胞悬液，按200μL/孔的量接种到96孔板中，放入细胞培养箱中培养48h。②接种病毒-1用无血清的DMEM营养液作为稀释液，将待测病毒作连续10倍梯度稀释，从10-10到10一共10个稀释度，用排枪慢慢的吸去96孔板中细胞营养液。在用无血清的营养液吸细胞一遍，将不同稀释度的病毒液接种于单层细胞的96孔细胞培养板，每个浓度设8孔重复，每孔0.1mL。同时设正常细胞对照，细胞对照孔不加病毒而加入无血清0的营养液。置37C，5%CO2培养箱中培养2h。再用含3％新生牛血清的DMEM进行补0液，每孔再加入0.1mL。继续放入37C，5%CO2培养箱中连续培养5d，再进行毒价的判定。③结果观察与TCID50计算3.2.5精油体外抗EMCV的作用⑴细胞的制备按照正常传代细胞的方法，从T50传到T25的细胞培养瓶中，当细胞培养48h后，细胞长至单层后，即可使用药物和病毒处理。⑵精油的稀释依据精油对Vero细胞的毒性试验的结果筛选出所选精油对Vero细胞的最大无毒浓度，采用倍比稀释法用细胞维持液将药物稀释成5个浓度。百里香精油组：（100μL/L、50μL/L、25μL/L、12.5μL/L、6.25μL/L）；牛至油组（12.5μL/L、6.25μL/L、3.13μL/L、-37- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究1.56μL/L、0.78μL/L）；艾叶油（250μL/L、125μL/L、62.5μL/L、31.25μL/L、15.62μL/L）；丁香油（31.25μL/L、15.625μL/L、7.8125μL/L、3.591μL/L、1.796μL/L）；⑶病毒的稀释依据实验中测得的EMCV毒株的TCID50，用无血清DMEM将病毒液稀释成相应倍数，即100TCID50/100μL。⑷实验分组正常细胞对照组；病毒对照组；百里香精油组；牛至油组；艾叶油组；丁香油组。⑸四种加药方式①精油对细胞的保护作用0在已长成单层细胞的细胞瓶中，每瓶加入不同浓度的药物组2mL，于37C，5％CO2培养箱中作用3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，再加入2mL的0100TCID50的EMCV病毒液，置于37C，5％CO2培养箱吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，每一个浓度设3个重复，每天观察CPE，连续培0养6d。收集病变后的细胞，放入-20C进行三次反复冻融后再进行实时荧光定量PCR检测。②药物对EMCV毒直接灭活作用0不同浓度的药物组分别与100TCID50的EMCV病毒液各2mL等体积混合，于37C，05％CO2培养箱中作用2h后加入已长成单层细胞的细胞瓶中，放置于37C，5％CO2培0养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。③药物对EMCV治疗的作用0把2mL的100TCID50的EMCV毒液接种于已长成单层细胞的细胞瓶中，于37C，5％CO2培养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，加入不同浓度的药0物组2mL置于37C，5％CO2培养箱中吸附2h，弃去含药物的营养液用无血清的营养0液缓慢的润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。④药物抗EMCV病毒吸附作用不同浓度的药物组分别与100TCID50的EMCV毒液各2mL等体积混合后立即加入0已长成单层细胞的细胞瓶中，37C，5％CO2培养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢0的润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中，每天观察CPE，连续培养6d。其余方法同①。3.2.6实时荧光定量PCR①EMCV病毒总RNA的提取-38- 兰州交通大学硕士学位论文依照总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书，对收集的EMCV毒液进行总RNA的提取,方法如下：用移液器吸取0.3mL病毒液放入1.5mL的离心管中，再加入裂解液RZ900μL，二者混匀后，室温放置5min。0再加入200μL氯仿，充分震荡15s，室温放置3min，4C，12000r/min离心10min，轻轻的吸取上清(勿吸到中间层及下层）转移至新的1.5mL的离心管中，加入相当于0.50倍上清体积的无水乙醇溶液，混匀，移入吸附柱，4C，12000r/min离心lmin，吸弃废液。加入去蛋白液500μL，相同条件下离心1min，吸弃废液。加入漂洗液700μL，置于室温下2min，相同条件下离心1min，吸弃废液。再加入漂洗液700μL，置于室温下2min，相同条件下离心1min，吸弃废液。离心2min，使离心柱中残留液体除去。将吸附柱置于室温下5min，晾干吸附柱中的液体。待吸附柱晾干后，把吸附柱转移至新的收集管中，加入60μLRNase-freeddH2O，40C，12000r/min离心2min。0即可得到相应的RNA，标记后保存在-80C，备用。②逆转录Oligo(dT)18(10mM)2.0μLdNTPs(10mM)2.0μLRNAsinRibonucleaseInhibitor1.0μL模板RNA10.0μL总体系15.0μL0充分混匀后在PCR仪中进行反应：70C5min，立即冰浴3min。反应结束后向反应管中加入：5×FirstBuffer(DTT)5μLRNasefreeddH2O4.0μLM-MLV10.0μL总体系15.0μL混合后放入PCR仪中，42°C温育1h，95°C5min，产物保存于-20°C，待用。③EMCVReal-timePCR扩增反应按照PremixExTaqTM(ProbeReal-timePCR)(2×)说明书，初步建立总体系25μL的体系扩增。25μL的反应体系为：-39- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究PremixExTaq(ProbeReal-timePCR)(2×)12.5μL荧光探针溶液1.0μLRNasefreeddH2O8.5μL上游引物0.5μL下游引物0.5μL模板cDNA2.0μL总体系25μL混匀后，放入荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为：0Stage1:95C预变性30s，repeat1；00Stage2:95C5s，60C30s，repeat40；根据扩增曲线及病毒拷贝数分析实验结果。3.3实验结果3.3.1酒精对Vero细胞的毒性通过加入不同酒精浓度的维持液到长至单层的Vero细胞上，培养了72h后通过观察细胞的CPE来观察酒精对细胞的毒性。当酒精浓度在10％时，对细胞毒性强能使细胞变圆、破碎如图3.1a所示。当酒精浓度大于或等于1％时，酒精对细胞无明显影响如图（3.1bcde）。图3.1不同浓度酒精对Vero细胞的毒性（CPE）Fig.3.1EffectsofdifferentconcentrationsofalcoholonVerocells注1)(a)10％乙醇(b)1％乙醇(c)0.1％乙醇(d)0.01％乙醇(e)0.001％乙醇(f)对照组Note1)(a):10%ethanol(b):1%ofethanol(c):0.1%ethanol(d):0.01%ethanol(e):0.001%ethanol(f):controlgroup3.3.2精油对Vero细胞的毒性实验⑴Vero细胞的最佳接种密度-40- 兰州交通大学硕士学位论文通过接种不同浓度是Vero细胞接种24h后，通过倒置显微镜对其生长状况进行观察记录（表3.1），能长成单层细胞的浓度在每孔1.17到2.34万个细胞数。最后确定24×10时细胞量最佳。表3.1不同接种浓度培养24h后的CPETable3.1Differentinoculationconcentrationtrainingafter24hoftheCPE4项目细胞接种密度(×10)0.0730.146250.29250.5851.172.344.68CPE+++++++++++++++++++++⑴精油对Vero细胞的毒性CPE结果①百里香精油对Vero细胞的毒性CPE结果表3.2不同浓度百里香精油对Vero的CPETable3.2DifferentconcentrationsofthymeessentialoilofVeroCPE稀释倍数药物TC5022223410102×104×108×101010对照组+++++++++++++++++++++++++++++++++++++百里香精油+++++++++++++++++++++++++++++++++++++（起始浓度+++++++++++++++++++++++++++++++++++++1684.67μL/L10000μL/L）++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++百里香精油的稀释10倍后，对Vero细胞存在一定的影响，细胞表现为：细胞形态较正常且死细胞不多。当稀释到100倍时细胞的生长状态明显变好，死细胞变少。较正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为1684.67μL/L。CPE结果如上表3.2所示。②牛至油对Vero细胞的毒性CPE结果表3.3不同浓度牛至油对Vero的CPETable3.3DifferentconcentrationsoforeganooilofVeroCPE稀释倍数药物22223456细胞对10102×104×108×1010101010TC50照组牛至油油（起---+++++++++++++++++++++++++++++++始浓度---++++++++++++++++++++++++++++++10000μL/L）---++++++++++++++++++++++++++++++++17.03μL/L---+++++++++++++++++++++++++++++++---++++++++++++++++++++++++++++++++-41- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究牛至油的稀释倍数小于400倍时，能杀死Vero细胞，细胞表现为：细胞形态变圆。当稀释到400倍时细胞的生长状态明显变好，有少量细胞存活。当稀释到800倍时较正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为17.03μL/L。CPE结果如上表3.3所示。③艾叶油对Vero细胞的毒性CPE结果艾叶油的稀释倍数小于100倍时，能杀死Vero细胞，细胞表现为：细胞形态变圆。当稀释到200倍时细胞的生长状态明显变好，有少量细胞存活。当稀释到400倍时较正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为184.70μL/L。CPE结果如表3.4所示。表3.4不同浓度艾叶油对Vero的CPETable3.4DifferentconcentrationsofblumeaoilofVeroCPE稀释倍数药物细胞对501002004008001600TC50照组--+++++++++++++++++++++++艾叶油（起始--+++++++++++++++++++++++浓度--++++++++++++++++++++++184.70μL/L50000μL/L）--+++++++++++++++++++++++--+++++++++++++++++++++++④丁香油对Vero细胞的毒性CPE结果丁香油的稀释倍数小于200倍时，能直接杀死Vero细胞，培养48小时后观察细胞发现细胞形态变圆且全部死亡。当稀释到800倍时细胞的生长状态明显变好，有少量细胞存活。当稀释到1600倍时较正常对照组细胞相比较无明显的差异。TC50为117.66μL/L。CPE结果如下表3.5所示。表3.5不同浓度丁香油对Vero的CPETable3.5DifferentconcentrationsofcloveoilofVeroCPE稀释倍数药物细胞对501002004008001600TC50照组---+++++++++++++++丁香油（起始浓---+++++++++++++++度50000μL/L）---++++++++++++++++117.66μL/L---+++++++++++++++---++++++++++++++综上所述：在对精油毒性测定试验中，通过倒置显微镜观察正常细胞对照组细胞排列整齐紧密、胞质清晰，当加入精油后呈现毒性的细胞主要表现为细胞圆缩、死细胞增-42- 兰州交通大学硕士学位论文多、细胞状态不好生长变慢。在精油安全浓度范围内的细胞则单层良好，死细胞少，与正常细胞对照组差别较小。百里香精油、牛至油、艾叶油、丁香油对Vero细胞的最大无毒浓度分别为：100μL/L、12.5μL/L、125μL/L、31.5μL/L。根据Reed-Muench法计算出4种精油的TC50分别为：1684.67μL/L、17.03μL/L、184.70μL/L、117.66μL/L。⑵精油对Vero细胞的毒性MTT结果以Means±SD表示所测的OD值，计算出不同浓度下百里香精油、牛至油、艾叶油、丁香油对细胞存活率（表3.6）。根据表中的存活率判断出四种精油对细胞的最小的安全浓度为：100μL/L、12.5μL/L、125μL/L、31.5μL/L。-43- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究表3.6MTT法测定各种精油对Vero细胞的毒性Table3.6DeterminedbyMTTmethodwasdevelopedforthedeterminationofallkindsofessentialoilonVerocelltoxicity精油精油浓度MTT值存活率（μL/L）10000.7692±0.02610.6211±0.02101001.1638±0.04510.9397±0.0364501.1936±0.06390.9638±0.0516251.2226±0.05460.9872±0.044012.51.2270±0.01420.9907±0.0114百里香精油1.2268±0.02950.9906±0.02381011.2232±0.04580.9877±0.03700.11.2726±0.08121.0276±0.06550.011.3250±0.11351.0699±0.091601.2384±0.10081.0000±0.081410000.0274±0.00270.0211±0.00201000.0308±0.00680.0238±0.0052500.0324±0.00710.0250±0.0055250.0328±0.00720.0253±0.005612.51.1699±0.06540.9047±0.0506牛至油101.3252±0.02521.0249±0.019411.4566±0.05211.1265±0.04031.0863±0.02330.11.4046±0.03020.011.3126±0.04911.0151±0.038001.2934±0.02681.0003±0.020710000.0136±0.00300.0106±0.00235000.0270±0.03200.0209±0.02482500.5503±0.09750.4271±0.07571251.2800±0.17000.9935±0.1320艾叶油62.51.0673±0.15240.8284±0.118331.251.0036±0.04210.7790±0.032701.0000±0.06401.2883±0.082510000.0182±0.00150.0229±0.01925000.0132±0.00450.0104±0.00352500.3195±0.18400.2514±0.14481250.9615±0.14050.7566±0.1105丁香油62.51.2765±0.06091.0045±0.047931.251.2777±0.14511.0055±0.114201.2707±0.04691.0000±0.0369-44- 兰州交通大学硕士学位论文3.3.3EMCV病毒TCID50测定结果EMCV毒株在Vero细胞上48h左右开始出现病变，明显的CPE主要表现为细胞破碎，最后脱落坏死。如图3.2所示。图3.2EMCV感染Vero细胞Fig.3.2EMCVinfectedVerocells依据Reed-Muench的终点稀释法测其半数组织细胞感染量（TCID50），将病毒原液进行10倍梯度稀释，测得不同稀释度下对应下的病毒液所导致的细胞病变（CPE）情况如下表3.7所示。表3.7EMCV毒株感染Vero细胞后第5dCPE结果Table3.7ThecperesultsofEMCVVerocellstraininfectionafter5d病毒液稀释倍数对照1234567891010101010101010101010组++++++-----++++++-----++++++-----EMCV++++++-----毒株++++++-----+++++------+++++------+++++------注1)“+”表示细胞病变，“-”表示细胞无病变。Note1)+cytopathiceffect,-nocellschange距离比例=（高于50％病变率的百分数-50％）（高于/50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数）lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数根据表中的实验数据及计算公式可得出HAdV3在HEK293细胞上的病毒滴度7.25TCID50为10TCID50/mL。本实验使用100TCID50。-45- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究3.3.4精油体外抗EMCV的作用实验结果⑴四种精油体外抗EMCV的作用的CPE结果①百里香精油体外抗EMCV的作用的CPE结果图3.3百里香四种作用方式体外抗EMCVFig.3.3InhibitioneffectofthymeonCPEinducedbyEMCVonVerocells注2)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(51h)；(c)100μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)；(d)100μL/L百里香精油对细胞的治疗作用(51h)；(e)100μL/L百里香精油对病毒直接灭活作用(51h)(f)100μL/L百里香精油抗病毒吸附作用(51h)。Note2)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(51h)(c):ProtectiveeffectofThymeoil(100μL/L)oncells(51h)(d):TherapeuticallyeffectofThymeoil(100μL/L)onEMCV(51h).(e):DirectinactivatedeffectofThymol(100μL/L)onEMCV(51h).(f):EffectofThymeoil(100μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(51h).当百里香精油浓度为100μL/L时，在培养至51h时阳性对照组（图3.3b）、治疗作用组（3.3d）、对病毒直接灭活组（图3.3e）和百里香精油抗病毒吸附作用组（图3.3f）已经出现了明显病变，而百里香精油对细胞的保护组病变还未出现明显病变（图3.3c）。②牛至油体外抗EMCV的作用的CPE结果当牛至油浓度为12.5μL/L时对病毒感染Vero细胞的四种作用方式如下：在培养至48h时阳性对照组（图3.4b）、牛至油对细胞的保护组（图4.4c）、治疗作用组（图3.4d）、对病毒直接灭活组（图3.4e）已经出现了明显病变，而牛至油抗病毒吸附作用组在48h还未出现明显的病变（图3.4f）。但当60h后细胞也开始出现病变。96h后细胞已经完全病变。-46- 兰州交通大学硕士学位论文图3.4牛至油四种作用方式下体外抗EMCVFig.3.4InhibitioneffectoforiganumoilonCPEinducedbyEMCVonVerocells注3)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(48h)；(c)12.5μL/L牛至油对细胞的保护作用(48h)；(d)12.5μL/L牛至油对细胞的治疗作用(48h)；(e)12.5μL/L牛至油对病毒直接灭活作用(48h)；(f)12.5μL/L牛至油抗病毒吸附作用(48h)。Note3)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):Protectiveeffectoforiganumoil(12.5μL/L)oncells(48h)(d):Therapeuticallyeffectoforiganumoil(12.5μL/L)onEMCV(48h).(e):Directinactivatedeffectoforiganumoil(12.5μL/L)onEMCV(48h).(f):Effectoforiganumoil(12.5μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h).③艾叶油体外抗EMCV的作用的CPE结果图3.5艾叶油四种作用方式下体外抗EMCVFig.3.5InhibitioneffectofblumeaoilonCPEinducedbyEMCVonVerocells注4)(a)正常细胞对照组(48h)；(b)病毒对照组(48h)；(c)125μL/L艾叶油对细胞的保护作用(48h)；(d)125μL/L艾叶油对细胞的治疗作用(48h)；(e)125μL/L艾叶油对病毒直接灭活作用(48h)；(f)125μL/L艾叶油抗病毒吸附作用(48h)。Note4)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):Protectiveeffectofblumeaoil(125μL/L)oncells(48h)(d):Therapeuticallyeffectofblumeaoil(125μL/L)onEMCV(48h).(e):Directinactivatedeffectofblumeaoil(125μL/L)onEMCV(48h).(f):Effectofblumeaoil(125μL/L)preventingtheabso-rptionofEMCV(48h).-47- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究当艾叶油浓度为125μL/L时，对病毒感染Vero细胞的四种作用方式如下：在培养至48h在精油对细胞的保护作用（图3.5c）、精油对细胞的治疗作用（图3.5d）、精油对病毒的直接灭活作用（图3.5e）、精油抗病毒吸附作用（图3.5f）这四种作用方式下观察到细胞的CPE的变化与阳性对照组相比较下差异并不明显，都出现明显的裂解、破碎的病变现象。④丁香油体外抗EMCV的作用的CPE结果当丁香油浓度为31.25μL/L时，对病毒感染Vero细胞的四种作用方式如下：培养至48h时在精油对细胞的保护作用（图3.6c）、精油对细胞的治疗作用（图3.6d）、精油对病毒的直接灭活作用（图3.6e）、精油抗病毒吸附作用（图3.6f）这四种作用方式下通过倒置显微镜观察细胞CPE的变化与阳性对照组相比较下差异不明显，也都出现明显的裂解的病变现象。图3.6丁香油四种作用方式下体外抗EMCVFig.3.6InhibitioneffectofCloveOilonCPEinducedbyEMCVonVerocells注5)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组（48h）；(c)31.25μL/L丁香油对细胞的保护作用(48h)；(d)31.25μL/L丁香油对细胞的治疗作用(48h)；(e)31.25μL/L丁香油对病毒直接灭活作用(48h)；(f)31.25μL/L丁香油抗病毒吸附作用(48h)。Note5)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):ProtectiveeffectofCloveOil(31.25μL/L)oncells(48h)(d):TherapeuticallyeffectofCloveOil(31.25μL/L)onEMCV(48h).(e):DirectinactivatedeffectofCloveOil(31.25μL/L)onEMCV(48h).(f):EffectofCloveOil(31.25μL/L)preventingtheabso-rptionofEMCV(48h).⑵百里香精油、牛至油梯度稀释抗EMCV的作用的CPE结果用通过倒置显微镜观察对照组细胞排列整齐紧密、轮廓清楚、胞质清晰（图3.7a）病毒对照组Vero细胞CPE表现细胞开始裂解、变圆、轮廓不清楚（图3.7c）。根据以上初步判断对作用效果比较明显的百里香组及牛至油组进行更进一步的研究，选取这两种精油在有效果的作用方式下进行倍比浓度稀释后继续体外抗病毒。-48- 兰州交通大学硕士学位论文图3.7百里香对细胞的保护作用（51h）Fig.3.7Protectiveeffectofthymeoncells(51h)注6)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(51h)；(c)病毒对照组(96h)；(d)100μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)；(e)50μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)；(f)25μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)；(g)12.5μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)；(h)6.25μL/L百里香精油对细胞的保护作用(51h)。Note6)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(51h)(c):Positivecontrol(96h)(d):Protectiveeffectofthyme(100μL/L)oncells(51h)(e):Protectiveeffectofthyme(50μL/L)oncells(51h)(f):Protectiveeffectofthyme(25μL/L)oncells(51h)(g)Protectiveeffectofthyme(12.5μL/L)oncells(51h)(h)Protectiveeffectofthyme(6.25μL/L)oncells(51h)①百里香精油稀释抗EMCV的作用的CPE结果图3.8牛至油体外抗EMCV的吸附作用（48h）Fig.3.8EffectoforiganumoilpreventingtheabsorptionofEMCV(48h).注7)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(48h)；(c)病毒对照组(96h)；(d)12.5μL/L牛至油体外抗病毒的吸附作用(48h)；(e)6.25μL/L牛至油体外抗病毒的吸附作用(48h)；(f)3.13μL/L牛至油体外抗病毒的吸附作用(48h)；(g)1.56μL/L牛至油体外抗病毒的吸附作用(48h)；(h)0.78μL/L牛至油体外抗病毒的吸附作用(48h)。Note7)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):Positivecontrol(96h)(d):Effectoforiganumoil(12.5μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h)(e):Effectoforiganumoil(6.25μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h)(f):Effectoforiganumoil(3.13μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h)(g)Effectoforiganumoil(1.56μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h)(h)Effectoforiganumoil(0.78μL/L)preventingtheabsorptionofEMCV(48h).-49- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究②百里香精油、牛至油梯度稀释抗EMCV的作用的CPE结果牛至油组浓度由0.78μL/L到12.5μL/L这个浓度范围在48h后细胞与病毒对照组相比均未出现明显的病变现象（3.8d、e、f）。3.3.5实时荧光定量PCR检测结果[116]判断标准：当无Ct值或Ct值>40时检测结果判为阴性；Ct值<37时，检测结果判为阳性；当Ct值>37时，标本应从新进行检测，若重复结果Ct值<40的则判为阳性，否则为阴性。用荧光定量的方法对作用效果明显的在保护作用下百里香精油及抗吸附作用下牛[116]至油体外抗EMCV进行检测结果如图3.9和图3.10所示，再依据标准曲线所得的公式：y=-3.296logx+40.472，其中y为Ct，计算出病毒拷贝数如表3.7和表3.8所示。从结果表明百里香浓度为100μL/L时，病毒滴度与阳性对照组相比较有所降低，说明对细胞存在一定的保护作用。牛至油浓度为12.5μL/L到0.78μL/L每组之间的病毒滴度相差不大，但与阳性对照组相比较下，降低接近一个10的数量级。说明也有一定的抗病毒吸附的效果，但是无论哪一组的Ct值都没有大于40，说明EMCV还是感染了细胞，与用CPE观察到96h细胞均出现相同的病变一致的结果。图3.9百里香在保护作用下体外抗EMCV的Real-timePCR实时检测结果Figure3.9ThymeEMCVresistanceinvitroundertheprotectionofReal-timePCRdetectionresultsinRealtime-50- 兰州交通大学硕士学位论文图3.10牛至油在第四种作用方式下体外抗EMCV的Real-timePCR实时检测结果Figure3.10OreganooilinafourthwayinvitroEMCVofReal-timePCRdetectionresultsinRealtime表3.7百里香在保护作用下体外抗EMCV的Real-timePCR实时检测结果Table3.7ThymeEMCVresistanceinvitroundertheprotectionofReal-timePCRdetectionresultsinRealtime组别Ct病毒拷贝数6100μL/L(51h)16.381.99×107100μL/L(96h)14.119.77×10850μL/L(51h)14.091.01×10850μL/L(96h)14.011.05×10725μL/L(51h)14.288.91×10825μL/L(96h)14.101.00×107阳性对照(51h)15.773.16×108阳性对照(96h)13.991.07×10阴性对照00表3.8牛至油在第四种作用方式下48h体外抗EMCV的Real-timePCR实时检测结果Table3.8Oreganooilinafourthway48hvitroantiEMCVReal-timePCRdetectionresultsinRealtime组别Ct病毒拷贝数612.5μL/L(48h)18.444.8×1066.25μL/L(48h)19.482.34×1063.13μL/L(48h)17.717.9×1061.56μL/L(48h)19.093.09×1060.78μL/L(48h)20.221.38×107阳性对照(48h)16.861.45×10阴性对照003.4小结与分析根据研究表明EMCV在全球范围内分布，可以感染多种动物，包括田鼠，松鼠，大象，猪，野猪，浣熊，羚羊，狮子，鸟和几种非人灵长类动物，人类的感染也有报道。-51- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究鼠感染后出症状表现不明显，但病毒可以复制，甚至在感染后29d还有病毒的外排。所以EMCV的感染不容忽视。评价药物毒性的方法很多，本研究在CPE法的基础上应用了实时定量(real-time)PCR方法来检测病毒的增值情况，该方法是近年来迅速发展起来，具有更高的准确性、高效性等优点，在药物抗病毒效果评价中应用越来越广泛。为药物作用后，对病毒是否增值提供了可靠的技术支持。本实验在四种作用方式下研究了精油抗EMCV病毒的作用研究，结果表明百里香精油对细胞具有一定的保护作用，且百里香精油在25μL/L到100μL/L的浓度范围内与阳性对照组相比较48h内还未出现明显的CPE，病毒拷贝数有所降低；牛至油在抗病毒的吸附作用时效果明显，当牛至油组浓度由0.78μL/L到12.5μL/L这个浓度范围在48h后细胞均未出现明显的病变现象，病毒拷贝数最高降低大于一个10的数量级单位。百里香精油和牛至油在一定浓度范围内能有效推迟病毒感染细胞的时间。-52- 兰州交通大学硕士学位论文4麝香草酚体外抗病毒作用的研究4.1材料4.1.1细胞HEK293细胞（甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏）Vero细胞（甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏）4.1.2病毒株EMCV毒株（甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏）HAdV毒株（中国菌种保藏中心）4.1.3药品麝香草酚（批号：100508-200301，上海金锦乐实业有限公司）4.1.4实验仪器倒置显微镜：CK（OLYMPUSTOKYO）；光电显微镜：G16X；MSC-Advantage生物安全柜（ThermoScientific公司）二氧化碳培养箱（ThermoFisher公司）卧式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗感控设备厂）MK3型酶联免疫检测仪（ThermoScientific公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）微量加样器（德国Eppendorf）MM-1微型振荡器。4.1.5试剂台盼蓝（Sigma）四甲基偶氮唑蓝（MTT，Solarbio公司产品编号M8180-1000）无水乙醇（上海广诺化学科技有限公司）二甲基亚砜（DMSO，上海广诺化学科技有限公司）新生牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）高糖型DMEM培养基（Gibco）胰蛋白酶（Gibco）4.2实验方法与步骤4.2.1细胞的传代培养-53- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究取出一瓶细胞长势优良的HEK293细胞和Vero细胞进行传代培养，当细胞生长至致密单层后，弃去培养液，用少量0.25%胰蛋白酶轻轻的润洗细胞1~2遍，再加入1～2mL0.25%胰蛋白酶消化2min，倒置显微镜下观察，待细胞圆缩，弃去胰蛋白酶，用010ml全营养液轻轻吹打细胞后按照1：4的比例进行稀释细胞悬液。放入37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。4.2.2麝香草酚对HEK293细胞的毒性试验⑴96孔细胞培养板单层细胞的制备取能在48h长成胞质清晰、细胞形态良好的单层细胞，按照正常传代方法将细胞消化后制备成10mL均一悬液，在光学显微镜下，用血细胞计数器对细胞悬液进行计数，4再用DMEM细胞培养液将细胞稀释到每100μL中含有2×10个。每孔100μL细胞悬液0于96孔细胞培养板中。置于37C，5％CO2培养箱中，培养24h后即可以长成细胞单层，可以把药物加入细胞中。⑵稀释精油用无水乙醇溶解麝香草酚，配制成浓度为5mg/mL的储液。在用含3％新生牛血清的DMEM维持液将储液稀释为1：10，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1000，1：10000，1:16000。⑶接种含稀释好的含不同浓度精油的营养液吸弃96孔板中的营养液，加入含不同精油的3％新生牛血清的DMEM维持液，每个浓度设置4个平行孔，每孔100μL，并设置正常细胞对照组和空白对照组。细胞对照0组只含有3％新生牛血清的DMEM维持液。放置37C，5％CO2培养箱中进行72h培养。连续3d进行CPE的观察。72h后进行MTT的测定。⑷数据整理分析取第3天，即72h的CPE记录成表，与MTT数据作比较。①四甲基偶氮唑蓝(MTT)法数据03d(72h)后直接向孔中加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg/ml)25μL，放入37C，5％CO2培养箱中继续培养4h后吸弃孔中液体,每孔加120μL的DMSO，于水平振荡器上振荡10min，使MTT甲瓒结晶完全溶解后,用酶联免疫检测仪于492/630nm处测定OD值。②统计学处理根据精油对细胞CPE数据与MTT数据来计算精油对细胞的抑制百分率，采用SPPS18.0软件对半数细胞毒性浓度TC50进行Probit回归法计算。用线性回归法评价药物浓度与细胞存活率间的量效关系是否具有统计学意义，P<0.05时认为差异具有统计学意义。4.2.3麝香草酚体外抗病毒的作用-54- 兰州交通大学硕士学位论文⑴细胞的制备按照正常传代细胞的方法，从T50传到T25的细胞培养瓶中，当细胞培养48h后，细胞长至单层后，即可使用药物和病毒处理。⑵精油的稀释依据实验中麝香草酚对两种细胞的毒性试验的结果筛选出所选麝香草酚对两种细胞的最大无毒浓度，采用倍比稀释法用细胞维持液将药物稀释成5个浓度。麝香草酚1组（62.5mg/L、31.25mg/L、15.62mg/L、7.81mg/L、3.90mg/L）；麝香草酚2组（50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.13mg/L）；⑶病毒的稀释依据实验中测得的HAdV3毒株和EMCV毒株的TCID50，用无血清DMEM将病毒液稀释成相应倍数，即100TCID50/mL。⑷实验分组正常细胞对照组；病毒对照组；麝香草酚组。⑸四种加药方式①麝香草酚对细胞的保护作用0在已长成单层细胞的细胞瓶中，每瓶加入不同浓度的麝香草酚组2mL，于37C，5％CO2培养箱中作用3h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，再加入2ml的100TCID500的病毒液，置于37C，5％CO2培养箱吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，每一个浓度设3个重复，每天观察CPE，连续培养6d。收集病变后0的细胞，放入-20C进行三次反复冻融后再进行病毒滴度的检测。②麝香草酚对病毒直接灭活作用0不同浓度的麝香草酚组分别与100TCID50的病毒液各2mL等体积混合，于37C，05％CO2培养箱中作用2h后加入已长成单层细胞的细胞瓶中，放置于37C，5％CO2培0养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，换以细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。③麝香草酚对病毒治疗的作用0把2ml的100TCID50的毒液接种于已长成单层细胞的细胞瓶中，于37C，5％CO2培养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢的润洗细胞3次，加入不同浓度的麝香草酚0组2ml置于37C，5％CO2培养箱中吸附2h，弃去含麝香草酚的营养液用无血清的营0养液缓慢的润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中连续培养6d。其余方法同①。④麝香草酚抗病毒吸附作用-55- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究不同浓度的麝香草酚组分别与100TCID50的病毒液各2mL等体积混合后立即加入0已长成单层细胞的细胞瓶中，37C，5％CO2培养箱中吸附2h，用无血清的营养液缓慢0的润洗细胞3次，加入细胞维持液，置于37C，5％CO2培养箱中，每天观察CPE，连续培养6d。其余方法同①。4.3结果4.3.1麝香草酚对细胞的毒性⑴CPE结果在对毒性测定试验中，通过倒置显微镜观察正常细胞对照组细胞排列整齐紧密、胞质清晰，当加入精油后呈现毒性的细胞主要表现为细胞圆缩、死细胞增多、细胞状态不好生长变慢。在精油安全浓度范围内的细胞则单层良好，死细胞少，与正常细胞对照组差别较小。麝香草酚对HEK293细胞和Vero的最大无毒浓度分别为：62.5mg/L和50mg/L。根据Reed-Muench法计算出4种精油的TC50分别为：115.65mg/L和37.48mg/L。具体细胞病变情况如表4.1所示。表4.1麝香草酚对细胞毒性（CPE）Table4.1ToxiceffectsofThymoloncells稀释倍数细胞对药物（起始浓TC501010020040080010001000016000照组度50000mg/L）---+++++++++++++++++++++++++++麝香草酚对---+++++++++++++++++++++++++++HEK293的毒---+++++++++++++++++++++++++++115.65mg/L性作用---++++++++++++++++++++++++++++---++++++++++++++++++++++++++++----++++++++++++++++++++++麝香草酚对----+++++++++++++++++++++++Vero细胞的毒----+++++++++++++++++++++++37.48mg/L性作用----+++++++++++++++++++++++----++++++++++++++++++++++⑵精油对细胞的毒性MTT结果以Means±SD表示所测的OD值，计算出麝香草酚的存活率（表4.2）。根据表中的存活率判断出四种精油的最小的安全浓度为，麝香草酚对HEK293细胞最小安全浓度-56- 兰州交通大学硕士学位论文为：62.5mg/L，麝香草酚对Vero细胞最小安全浓度为50mg/L。与用CPE方法得出结果一致。表4.2MTT法测定麝香草酚对细胞的毒性Table4.2DeterminedbyMTTmethoddeterminationofthymolcelltoxicity浓度MTT存活率5000.0366±0.00150.0324±0.00132500.0360±0.00260.0319±0.00231250.2992±0.01320.2652±0.011762.50.9286±0.00600.8232±0.0053麝香草酚对500.9952±0.05880.8822±0.0521HEK293的31.51.1084±0.05510.9826±0.0489毒性15.631.1376±0.03871.0085±0.03437.8131.1338±0.05031.0051±0.044651.1172±0.04870.9904±0.04323.9061.0958±0.02730.9714±0.024201.1400±0.03381.0106±0.02995000.0252±0.00250.0180±0.00572500.0252±0.00370.0383±0.01891250.0250±0.00180.0365±0.005262.50.9775±0.16670.0324±0.0069麝香草酚对501.3782±0.01830.0327±0.0020Vero的毒性31.51.3857±0.14161.0960±0.036615.631.5722±0.06611.0458±0.06407.8131.5117±0.03871.0310±0.037951.4302±0.06201.0473±0.01973.9061.4727±0.03961.0204±0.025301.4827±0.14251.0000±0.06264.3.2麝香草酚体外抗HAdV3和EMCV的作用实验结果⑴麝香草酚体外抗HAdV3和EMCV的作用的CPE结果①麝香草酚体外抗HAdV3作用CPE结果-57- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究图4.1麝香草酚在HEK293细胞中对HAdV3不同作用方式下致细胞病变作用的抑制效应Fig.4.1InhibitioneffectofThymolonCPEinducedbyHAdV3onHEK293cells注1)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(48h)；(c)62.5μL/LThy对细胞的保护作用(48h)；(d)62.5μL/LThy对细胞的治疗作用(48h)；(e)62.5μL/LThy对病毒直接灭活作用(48h)；(f)62.5μL/LThy抗病毒吸附作用(48h)。Note1)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):ProtectiveeffectofThymeoil(62.5μL/L)oncells(48h)(d):TherapeuticallyeffectofThymeoil(62.5μL/L)onhuman-adenovirus.(e):DirectinactivatedeffectofThymol(62.5μL/L)onhuman-adenovirus.(f):EffectofThymeoil(62.5μL/L)preventingtheabsorptionofhuman-adenovirus.通过倒置显微镜观察到麝香草酚抗HAdV3病毒的CPE，结果显示：在麝香草酚1组中对病毒的治疗作用和对病毒的直接灭活作用方式下，通过与阳性对照组及利巴韦林对照组相比下，能够明显减少由HAdV3引起的HEK293细胞特异性病变的程度，麝香草酚的浓度在62.50mg/L时能明显降低治疗作用（图4.1d）和直接灭活作用下细胞CPE情况（图4.1e），而在保护作用（图4.1c）和抗病毒吸附作用（图4.1f）下，并不能减少由HAdV3引起的HEK293细胞特异性病变的程度。在此基础上，对病毒的治疗作用和对病毒的直接灭活作用方式下的浓度进行了倍比稀释后继续进行抗病毒研究。结果发现：当麝香草酚浓度为62.50mg/L和31.25mg/L时，在治疗作用下，能在一定程度减少HAdV3引起特异性病变（图4.2cd）；在直接灭活作用下，同样也能减少有EMCV病毒引起细胞特异性病变的程度（图4.2gh）-58- 兰州交通大学硕士学位论文图4.2麝香草酚在HEK293细胞中对HAdV3不同作用方式下致细胞病变作用的抑制效应Fig.4.2InhibitioneffectofThymolonCPEinducedbyHAdv-3onHEK293cells注2)(a)正常细胞对照组；(b)利巴韦林对照组；(c)麝香草酚(62.50mg/L)对人腺病毒治疗作用；(d)麝香草酚(31.25mg/L)对人腺病毒治疗作用；(e)阳性对照组；(f)利巴韦林对照组；(g)麝香草酚(62.50mg/L)对人腺病毒直接灭活作用；(h)麝香草酚(31.25mg/L)对人腺病毒直接灭活作用。Note3)(a):Normalcellscontrol(b):Ribavirincontrol(c):TherapeuticallyeffectofThymol(62.50mg/L)onhuman-adenovirus(d):TherapeuticallyeffectofThymol(31.25mg/L)onhuman-adenovirus(e):Positivecontrol(f):Ribavirincontrol(g):DirectinactivatedeffectofThymol(62.50mg/L)onhumanadenovirus(h):DirectinactivatedeffectofThymol(31.25mg/L)onhumanadenovirus.②麝香草酚体外抗EMCV作用CPE结果图4.3麝香草酚在Vero细胞中对EMCV不同作用方式下致细胞病变作用的抑制效应Fig.4.3InhibitioneffectofThymolonCPEinducedbyEMCVonVerocells注3)(a)正常细胞对照组；(b)病毒对照组(48h)；(c)50mg/LThy对细胞的保护作用(48h)；(d)50mg/LThy对细胞的治疗作用(48h)；(e)50mg/LThy对病毒直接灭活作用(48h)；(f)50mg/LThy抗病毒吸附作用(48h)。Note3)(a)Normalcellscontrol(b):Positivecontrol(48h)(c):ProtectiveeffectofThymeoil(50mg/L)oncells(48h)(d):TherapeuticallyeffectofThymeoil(50mg/L)onEMCV.(e):DirectinactivatedeffectofThymol(50mg/L)onEMCV.(f):EffectofThymeoil(50mg/L)preventingtheabsorptionofEMCV.-59- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究通过倒置显微镜观察到麝香草酚抗EMCV病毒的CPE，结果显示：在麝香草酚2组在保护作用（图4.3c）、对病毒的治疗作用（图4.3d）、对病毒的直接灭活作用（图4.3e）和抗病毒吸附作用（图4.3f）方式下，并不能减少由EMCV引起的Vero细胞特异性病变的程度，与阳性对照组比较没有显著差异。⑵麝香草酚的抑制病毒增殖作用62.5mg/L和31.25mg/L的麝香草酚对人腺病毒感染细胞后均具有一定的直接灭活4.83作用和治疗作用，在直接灭活作用下，两种浓度下病毒滴度分别由10TCID50/mL下3.834.16降到10TCID50/mL和10TCID50/mL；在治疗作用下，两种浓度病毒滴度分别由5.333.53.8310TCID50/mL下降到10TCID50/mL和10TCID50/mL。通过上述结果中腺病毒滴度的变化，麝香草酚在直接灭活作用方式或治疗作用方式下具有一定的抑制腺病毒的增殖作用。4.4小结与分析通过对麝香草酚体外抗病毒的研究，表明麝香草酚对腺病毒有一定的抑制作用，尤其在对细胞感染病毒后的治疗作用和对病毒的直接灭活作用。证明了麝香草酚是百里香精油抗人腺病毒的有效成分之一，但麝香草酚对EMCV病毒无明显的抑制作用，间接说明能抑制EMCV病毒的有效成分不是麝香草酚，正因为植物精油成分复杂多样，并且相同的植物所提取出的精油，其成分因产地、季节、植物部位、提取工艺等不同而不同。所以寻找其他有效抗病毒已成分当今热点之一。本实验所用的百里香精油通过气-质联用技术（GC-MC）分析了其成分，得到其中含有17.7％的麝香草酚这一化学物质。更进一步得出麝香草酚是其主要抗人腺病毒的主要成分之一。为今后研究植物精油有效成分提供一定的实验基础。-60- 兰州交通大学硕士学位论文结论1.不同精油对不同细胞的毒性存在差异，且适量精油可以起到抑菌的作用，反而促进细胞的生长。2.百里香精油在一定浓度范围内，在体外能一定程度灭活人腺病毒，起到抗病毒的作用。且其有效成分麝香草酚是其抗病毒的有效成分之一。3.牛至油在一定浓度范围内能阻碍病毒的吸附，百里香精油在一定范围内能保护细胞，推迟细胞病变的时间。但麝香草酚并不是有效抗EMCV的有效成分。综上所述，精油对细胞有一定的毒性作用，但是在一定浓度范围内能起到抗病毒的作用，且抗病毒的有效成分多样化。-61- 几种植物精油体外抗病毒活性的研究致谢在导师田永强教授及柏家林教授的悉心指导下完成研究生课题论文的立题、构思、技术路线、实施以及论文的撰写等方面。在毕业即将来临之际，在此我由衷的向各位教导过我的老师们，说一句您们辛苦了！首先我要感谢我的导师田永强教授，不仅在实验学习中给予我莫大的帮助，还在生活中给予了无微不至的关怀。无论在道德修、治学态度、专业知识，还是在生活原则上，都是我们学习的榜样，是我今后工作生活中的宝贵财富。感谢西北民族大学的柏家林教授，在我做实验期间给予提供实验学习的平台，让我学到很多，并感谢您在我学习和生活上帮助与关心，您的谆谆教诲我将铭记于心。感谢西北民族大学生物工程与技术国家民委重点试验室和甘肃省动物细胞工程中心冯若飞老师，给予我提供学习更多试验技能的机会，丰富知识的同时也得到了锻炼。在我的实验研究过程，同样在工作学习及生活中给予无微不至的关心和精心指导。在此向冯若飞老师表示深深的敬意和谢意。还得到了西北民族大学生物工程与技术国家民委重点试验室的马忠仁教授、冯玉萍教授乔、自林老师、李明生老师、张海霞老师等众多老师的帮组和关怀，表示深深的谢意与敬意。同时还感谢该实验室的李向茸师姐、杨妍梅师姐、王丹师兄在实验上的指导与帮助及在生活上的关心。也感谢谢晶莹、徐雷师弟、包晓婧师妹、马玉梅师妹及马花师妹的鼎力相助。与此同时也感谢兰州交通大学的同门师弟师妹们和微生物班的同学们的关心及支持。感谢一直默默支持我的亲人及朋友们，因为你们的关心与帮组给予我莫大的鼓励，是我能坚持走完3年研究生生涯的力量。最后，我还要向在我攻读硕士学位期间曾给予我关心和帮助的老师和同学表示真诚的谢意！各位老师、同学和家人们如没有你们一直以来对我的帮助、关心、支持、信任，就不可能顺利完成我今天的学业。谢谢你们！罗彩霞2015年3月25日-62- 兰州交通大学硕士学位论文参考文献[1]江志利,张兴,冯俊涛.植物精油研究及其在植物保护中的利用[J].陕西农业科学,2002,(1):32-36.[2]Lis‐BalchinM,PatelJ,HartS.Studiesonthemodeofactionofessentialoilsofscented‐leafPelargonium(Geraniaceae)[J].PhytotherapyResearch,1998,12(3):215-217.[3]KochC,ReichlingJ,SchneeleJ,etal.Inhibitoryeffectofessentialoilsagainstherpessimplexvirustype2[J].Phytomedicine,2008,15(1):71-78.[4]HayashiK,ImanishiN,KashiwayamaY,etal.Inhibitoryeffectofcinnamaldehyde,derivedfromCinnamomicortex,onthegrowthofinfluenzaA/PR/8virusinvitroandinvivo[J].Antiviralresearch,2007,74(1):1-8.[5]AstaniA,ReichlingJ,SchnitzlerP.AntiviralactivityofmonoterpenecomponentsofessentialoilsagainstHerpesSimplexvirus[J].AntiviralResearch,2009,82(2):A46.[6]SinicoC,DeLoguA,LaiF,etal.LiposomalincorporationofArtemisiaarborescensL.essentialoilandinvitroantiviralactivity[J].Europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics,2005,59(1):161-168.[7]Giraud-RobertAM.Theroleofaromatherapyinthetreatmentofviralhepatitis[J].InternationalJournalofAromatherapy,2005,15(4):183-192.[8]魏凤香,李美玉,王欣等.松针油抗甲型流感病毒的实验研究[J].中国老年学杂志,2008,(16):1584-1586.[9]吴琳琳.乔木蒿精油的脂质体及其体外抗病毒活性[J].国外医药,植物药分册,2005,20(5):206.[10]韩轶,戴璨,汤璐瑛.艾叶挥发油抗病毒作用的初步研究[J].氨基酸和生物资源,2005,(2):36-38.[11]戴云华.精油与中草药(二)[J]1云南中医学院学报,1987,10(1):39-411.[12]SchinaziRF,LiottaDC.Compositionscontaining5-fluoro-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxycytidineoramono-,di-,ortriphosphatethereofandasecondantiviralagent:U.S.Patent5,703,058[P].1997-12-30.[13]HottaH,HagiwaraK,TabataK,etal.AugmentationofprotectiveimmuneresponsesagainstSendaivirusinfectionbyfungalpolysaccharideschizophyllan[J].Internationaljournalofimmunopharmacology,1993,15(1):55-60.[14]项哨,朱圣禾,朱永平,等.灰树花多糖在小鼠体内抗病毒作用的研究[J].浙江大学学报(医学版),1995,24(5):203-205.[15]孙菲.高山红景d多糖对病毒感染大鼠心肌细胞的抑制作用[J].中国药理学通报,1997,13(6):525.[16]王振纲.黄茂的免疫药理学研究.中国药理与临床研究进展[M].第一册:254-261.[17]HuleihelM,AradS.EffectofPorphyridiumsp.polysaccharideonmalignantcelltransformationbyMoloneymurinesarcomavirus[J].Anticancerresearch,2000,21(3B):2073-2078.[18]王学兵,魏战勇,崔保安,等.板蓝根多糖的提取及其对猪细小病毒的体外作用[J].畜牧兽医科学,2008,24(4)：4-7.[19]LiuJ,YangY,XuY,etal.Lycorinereducesmortalityofhumanenterovirus71-infectedmicebyinhibitingvirusreplication[J].VirolJournal,2011,8:483.[20]柏云娇,于淼,赵思伟,陈鹰翔,常铠麟.生物碱的药理作用及机制研究[J].哈尔滨商业大学学报，2013,29(1):8-11.-63- 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