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学校代码：１０２Ｓ５学号：２０１４５２３２ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹｗ■＾ｍ■■．．：．：■．．．：．：…：ｙｍ：管繁Ｃｏｒｍ在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究＇＇乂ｒｅｓｓｏｒｎｅｙ－ＴｈｅＥｘｉｏｎｏｆＣｉｎｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＧｈｒｏｎｉｃＫｉｄ；：：：ｐ：＾ＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄｔｈｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｆａｃｔｏｒｓ＿＿ｙ＿＇■Ｖ＂：？－？＂－－－－■－－．．．．，研究生姓名孙词指导教师姓名沈蕾■■■■■■＿■一——专业名称内科学（肾脏病学）—■研究方向慢性肾脏病的基础和临床》所在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期２０１７年５月 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究中文摘要I Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究中文摘要 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究中文摘要研究目的：Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要表达于心肌细胞，可通过对心钠肽（atrialnatriureticpeptide,ANP）和脑钠肽（brainorB-typenatriureticpeptide,BNP）前体（pro-ANP和pro-BNP）的蛋白水解作用，生成有活性的ANP和BNP，发挥利钠、排尿、扩张血管的作用，从而维持血压及钠水平衡。Corin发挥利钠、排尿的生物学作用是通过Corin水解活化ANP,启动下游的信号通路调节钠离子通道实现的。最近研究发现，肾脏组织中也检测到Corin的表达，主要表达于近端小管、髓袢升支、连接小管和集合管等上皮组织中。然而，Corin在肾脏组织中的特定分布是否发挥特定的生物学功能、与肾脏疾病的发生发展是否相关还需进一步研究。以往研究发现，慢性肾脏病患者（CKD）尿液中可以检测到可溶性Corin，且随着慢性肾脏病病情越严重，尿液中可溶性Corin水平降低。为进一步研究两者之间的关系，本实验收集慢性肾脏病患者及正常对照组的血液和尿液样本，分析血浆、尿液中Corin水平以及与疾病的相关性，分析可能影响尿液Corin表达的相关因素（超敏C反应蛋白（hs-CRP）、IL-1β、TNF-α和IL-6）。为进一步研究炎症因子对Corin表达的影响及其意义，分别培养人胚肾细胞（HEK293细胞）和人近端小管上皮细胞（HK2细胞），用不同浓度的炎症因子孵育细胞，分析炎症因子作用下Corin的合成及脱落活化情况，分析炎症因子影响下CorinmRNA的表达水平。为我们进一步了解肾脏疾病的发生、发展及治疗提供理论依据。研究方法：1.收集CKD患者和正常人血液及尿液样本，其中CKD患者组依据肾小球滤过2率（eGFR）水平分成2组，eGFR≥60ml/min∙1.73m为CKD早期组，eGFR<602ml/min∙1.73m为CKD晚期组。2.应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肾脏病患者及正常对照的血浆及尿液中Corin水平；应用ELISA法检测血浆中炎性因子（IL-1β，TNF-α）水平。分析尿液中Corin与尿白蛋白及尿β2微球蛋白之间的相关性；分析慢性肾脏病患者尿液Corin与I 肾小球滤过率之间的相关性；分析CKD早期组尿液Corin与炎症因子之间的相关性。3.应用蛋白质免疫印迹法（westernblot）测定Corin在炎性因子刺激的人胚肾细胞（HEK293）细胞上清及裂解液中的表达。4.应用qPCR法检测炎性因子刺激的人近端小管上皮细胞（HK2）中CorinmRNA的表达。研究结果：1.在正常人和CKD患者血浆和尿液中都可以检测到可溶性Corin。血浆中Corin水平（627.10±64.90（正常人）vs744.90±82.59（CKD早期组）vs987.80±59.71pg/ml（CKD晚期组），P<0.01），尿液中Corin水平（84.45±6.93（正常人）vs114.50±8.50（CKD早期组）vs27.22±5.00pg/ml（CKD晚期组），P<0.01）。CKD晚期组患者尿液中Corin水平与eGFR呈正相关（P<0.05）。2.所有CKD患者中尿液中的Corin与尿白蛋白无相关性（P>0.05），与尿小管源性尿β2-微球蛋白（β2-MG）呈正相关（P=0.01）。3.CKD早期组与正常对照组血浆炎症因子（IL-1β,TNF-α）水平无相关性，CKD早期组尿液中Corin水平与炎症因子IL-1β呈正相关（P=0.03）。4.用含不同浓度（0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）IL-1β的培养基培养HEK293Corin细胞24h，上清中Corin的量随着IL-1β浓度递增而增加（0.20±0.02vs0.38±0.02vs0.37±0.03vs0.50±0.05,P<0.01），而裂解液中的Corin水平未见明显改变（1.48±0.09vs1.42±0.17vs1.74±0.20vs1.57±0.15,P>0.05）。用1ng/mlIL-1β孵育HEK293Corin细胞12h，24h，36h，48h，上清中Corin水平随着时间延长明显增加（0.20±0.02vs1.44±0.12vs2.91±0.30vs5.65±0.38,P<0.01）。5.用不同浓度（0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）TNF-α刺激HEK293Corin细胞，只有当炎症因子浓度增加到10ng/ml时，上清中Corin水平才会明显增加（P=0.02）。细胞裂解液中Corin水平在各组间未见明显差异（1.42±0.05vs1.27±0.16vs1.22±0.11vs1.29±0.25,P>0.05）。结论：1.CKD患者血浆和尿液中存在可溶性Corin，尿液中Corin并非来源于肾小球滤过，提示来自小管上皮细胞，与局部Corin蛋白脱落有关。2.CKD晚期患者尿液中可溶性Corin水平与eGFR呈正相关。尿液中Corin水II 平随着慢性肾脏病加重而降低，提示尿液中Corin水平可在一定程度上反应肾脏功能。3.炎症因子IL-1β,TNF-α促进肾脏细胞Corin脱落，对Corin合成无显著影响。提示肾脏病患者体内微炎状态影响Corin代谢。作者：孙词指导老师：沈蕾III TheExpressionofCorininPatientswithChronicKidneyDiseasesandtheCorrelationwithinflamatoryfactorsAbstractObjective:CorinisatypeIItransmembraneserineprotease,whichishighlyexpressedincardiomyocytes.Corinproteolyticcleavagespro-atrialnatriureticpeptide(pro-ANP)andpro-B-typenatriureticpeptide(pro-BNP),toformmaturenatriureticpeptides,whichcanpromotevasodilation,natriuresisanddiuresis,andthusmaintainingbloodpressureandvolumebalance.Corinmaitainsodium-waterbanlancebyANPanddownstreamsignalingpathways.CorinmRNAandproteinwerealsodetectedinkidney,includingtheproximaltubule,thickascendinglimb,connectingtubuleandcollectingduct,butitsfunctioninkidneyisstillunclear.TofurtherstudythefunctionofCorininkidney,weanalyzedthelevelsofCorininurineandbloodsamplescollectedfromnormalindividualsandpatientswithkidneydiseases,analyzedsomefactors(hs-CRP,IL-1β,TNF-αandIL-6)whichmaybeaffectCorinlevelsinurineandsignalpathway.TofurtherstudythecorrelationbetweenCorinandcytokines,weculturedtwokindscells:humanembryonickidney293cells(HEK293cells)andhumanrenalproximaltubularcells(HK2cells),westernblotwasusedtoanalyzedCorinandcytokines.Thesestudiesmayhelpustofurtherunderstandtheoccurrence,developmentandtherapyofkidneydisease.Methods1.Urineandplasmasamplesofnormalindividualsandpatientswithchronickidneydiseaseswerecollected.Patientswithchronickidneydiseaseswereclassifiedastwogroups:early-stageCKDgroupandadvancedCKDgroup.2.Enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedtodetectedurinaryandplasmaCorin.Besides,plasmacytokines(IL-1β,TNF-α)werealsodetectedbyELISA.CorrelationanalysiswasperformedbetweenurinaryCorinandurinaryβ2-MGplasmacytokines(IL-1β,TNF-αandIL-6).3.TheexpressinglevelsofCorininHEK293Corincellsstimulatedbycytokines(IL-1β,TNF-α,IL-6)wereexaminedbywesternblot.IV 4.Quantitativepolymerasechainreaction(qPCR)wasperformedtodetectthemRNAlevelsofCorin,ANPinhumanrenalproximaltubularcells(HK2)stimulatedbycytokines.Results:1.Corincanbedetectedinbothplasmaandurine,thelevelofplasmaCorin:627.10±64.90(normalperson)vs744.90±82.59(early-stageCKDgroup)vs987.80±59.71pg/ml(advancedCKDgroup),P<0.05.ThelevelofurinaryCorin:84.45±6.93(normalperson)vs114.50±8.50(early-stageCKDgroup)vs27.22±5.00pg/ml(advancedCKDgroup).InadvancedCKDgroup,thereisapositivecorrelationbetweenurinaryCorinandestimatedglomerularfiltrationrate(eGFR)(R=0.69,P<0.01).2.ThelevelofurinaryCorinwaspositivelycorrelatedwithurinaryβ2-MG(P=0.01)(figure1B),butnocorrelationwasfoundbetweenurinaryCorinandurinaryalbumin(P>0.05).3.Comparedwithnormalperson,plasmainflammationfactors(IL-1β,TNF-α)didn’tchangeobviously,buturinaryCorinofpatientsinearly-stageCKDgroupcorrelatedwithplasmaIL-1β(P=0.03).4.AstheIL-1βconcentrations(0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml)increased,anelevationofCorinlevelwasobservedinculturemediumofHEK293Corincells(P<0.01).However,theamountofCorindidn’tchangemarkedlyincellslysis(P>0.05).OnlywhenTNF-αreachedtoacertainconcentration(10ng/ml),thelevelofCorininmediumwouldbeaugmentedsignificantlythancontrolgroup(0ng/ml)(P=0.02),littlechangeofCorinlevelincelllysiswasfoundneither.Conclusions:1.SolubleCorincanbedetectedinurine,theprimarysourceofCorininurineisfromtubulesepithelialcells,butnotfromplasma.2.UrinaryCorinlevelinadvancedCKDgroupcorrelatedwithestimatedglomerularfiltrationrate.Alongwithchronickidneydiseasesseverityadvanced,urinaryCorindecreased.UrinaryCorinlevelinpatientswithadvancedCKDindicatedkidneyinjury.3.Cytokines,containingIL-βandTNF-α,mayaccelerateCorinsheddingfromcellmembrane,butforCorinsynthesis,cytokinesseemedtohavenoobviouseffects.InflammatoryconditioninpatientswithkidneydiseasesaffectCorinmetabolisis.Writtenby:CiSunSupervisedby:LeiShenV 目录引言....................................................................................................................................1材料与方法............................................................................................................................51.实验材料.........................................................................................................................52.实验方法.........................................................................................................................7实验结果..............................................................................................................................111.正常人和CKD患者的基本情况：.............................................................................112.正常人和CKD患者血浆及尿液中Corin水平.........................................................113.尿液中Corin与eGFR.................................................................................................124.尿液中Corin来源分析...............................................................................................125.尿液中Corin水平影响因素的分析............................................................................136.细胞实验中Corin与炎症因子....................................................................................14讨论..................................................................................................................................17结论..................................................................................................................................20参考文献..............................................................................................................................21综述..................................................................................................................................23参考文献..........................................................................................................................27英文缩略词汇表..................................................................................................................31硕士学位期间所发表的论文..............................................................................................33本课题所获得的基金资助..................................................................................................34致谢..................................................................................................................................35 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究引言引言Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要表达于心肌细胞[1-4]，可通过对心钠肽（ANP）前体（pro-ANP）的蛋白水解作用，生成有活性ANP，在调节血压、维持心脏功能方面发挥重要作用[5-7]。然而，在肾脏组织中，也检测到Corin的表达，主要分布于近端小管、髓袢升支、连接小管和集合管等上皮组织中[8]。Corin的特异性表达提示Corin可能在肾脏组织中发挥特定的生物学功能。人类Corin的基因位于4号染色体上[9]，编码由1042个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶[5]，其结构（如图1）主要包括1个N-末端的胞内段、1个跨膜结构域（transmembranedomain,TM）、2个卷曲样结构（frizzleddomain,Fz）、8个低密度脂蛋白受体结构(lowdensitylipoproteinreceptor,LDLR)、1个清道夫样受体结构(scavengerreceptor,SR)[5]以及C-末端胰蛋白酶样蛋白酶（protease）结构组成,其中蛋白酶区域含有II型跨膜丝氨酸蛋白酶的高度保守序列——丝氨酸（serine,Ser）、组氨酸（histidine,His）、天冬氨酸（asparticacid,Asp）构成的三联体，形成丝氨酸蛋白酶发挥生物学活性的功能部位。同其他胰蛋白酶一样，Corin也是以无活性的酶原形式合成的，需要经过其他蛋白酶的活化，研究表明，PCSK-6就是Corin的活化酶，活化位点在801位的精氨酸和802位的异亮氨酸之间的肽键（Arg-801-lle802），因此在行蛋白电泳时，除了有约190KDa的Corin条带，还有约40KDa的Corin活化带[6,10]。Corin为膜锚定蛋白，但可从细胞表面脱落，在人类血浆中检测到可溶性Corin。在表达Corin的HEK293细胞培养基中，蛋白电泳可检测到三条蛋白条带，分别为180、160、100KDa左右，QingyuWu等证实，ADAM10在Corin的近膜端剪切Corin从而形成180KDa的条带，而160KDa和100KDa的两条条带是活化的Corin的自我剪切，剪切位点分别是164位的精氨酸和427位的精氨酸。1 引言Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究图1：Corin的结构模式图Corin的主要生物学功能是将无活性的pro-ANP活化成有功能的ANP。ANP是以利钠肽原前肽（prepro-ANP）的形式合成，经过信号肽酶剪切，形成利钠肽原（pro-ANP）。Pro-ANP是无活性的，需要经过蛋白酶的进一步活化，实验发现，Corin就是pro-ANP的转化酶。Corin在pro-ANP的第98位精氨酸（Arg）的位置剪切，生成由98个氨基酸组成的N-末端无活性的肽（N-terminalpeptide）和由28个氨基酸组成的C-末端活性形式（ANP）[11]。ANP活化后释放入血到达靶器官，与靶器官表面的ANP受体（NPR-A）结合，发挥舒张血管、利钠排尿的作用，从而维持血压和血容量的稳定（如图2）。图2：Corin的功能模式图Corin最早是在心脏中发现的，表达于心肌细胞。然而，除了心肌细胞，CorinmRNA还在其他组织中检测到，包括妊娠子宫、肾脏、骨骼组织、皮肤毛囊等[8,12-14]。DannyPolzin等用免疫荧光的方法发现Corin主要分布于上皮细胞中，包括近端小管、髓袢升支粗段、连接小管和集合管[8]，Dong等在人类肾脏组织中发现Corin表达于2 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究引言近端小管、远曲小管、髓袢升支粗段、集合管，在近曲小管高表达[2]。原位杂交显示ANPmRNA在肾脏组织中分布与Corin具有一致性。ANPmRNA在近端小管刷状缘可检测低水平表达，而在髓袢升支粗段、连接小管、集合管中检测到ANP的高水平表达。Corin与ANP在肾脏组织中分布的一致性提示Corin发挥生物学功能主要是通过活化ANP进行的[8]。慢性肾脏病（CKD）患者中有超过一半伴发高血压症状。导致血压升高、液体潴留症状的原因有很多，主要包括肾小球滤过率下降，肾小管重吸收钠、水增加；肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）启动；交感神经系统启动等等。另外，血管舒张/钠水排泄的物质如钠尿肽（ANP/BNP）、NO减少也是导致血压升高的重要原因。如Corin基因敲除小鼠的血压明显高于野生型小鼠[15,16]。在高盐饮食的情况下，这种基因敲除鼠的血压会呈现更高的趋势[11,17]，而过表达ANP/BNP或者NPR-A的转基因小鼠的血压则维持在较低水平，甚至呈现低血压状态[16]。QingyuWu等研究发现基因敲除小鼠在妊娠后期较野生型小鼠更易出现高血压、蛋白尿等子痫前期的症状，除此之外还发现基因敲除鼠的肾脏发生病理性改变，主要包括肾小球缺血、塌陷，细胞外基质增多，肾小球毛细血管狭窄以及基底膜增厚[18]。由此可见，Corin在调节血压方面发挥着至关重要的作用。DannyPolzin等构建了大鼠肾病综合征（NS）模型和急性肾小球肾炎（GN）模型[8]，结果发现PAN和GN鼠的肾脏皮质和髓质中CorinmRNA的表达水平较对照组均降低，且髓质中RNA水平降低更显著。提示Corin在肾脏病发生、发展中可能发挥重要的作用。Corin发挥利钠排尿的生物学作用主要通过减少钠离子通道（ENaC）重吸收钠。Corin水解活化pro-ANP生成有活性的ANP，ANP释放入血后识别NPR-A,启动膜结合的鸟苷酸环化酶，继而生成环磷鸟苷（cGMP），后者继续启动下游的信号通路，cGMP依赖的磷酸二酯酶（PDEs）和蛋白激酶（PKGs）[8,16,19]。当Corin基因缺陷或者表达异常时，活化的ANP生成减少，cGMP降低，而pro-ANP、PDE5、磷酸化的磷酸二酯酶5（p-PDE5）、PKGII明显升高，增多的PDE5，PKGII可以引起ENaC的增多[8]（如图3）。ENaC表达增多，钠重吸收增多，继而钠水潴留。综上所述，Corin通过发挥舒张血管、利钠排尿的作用维持血压及体液的平衡。Corin在肾脏的特异性分布及与肾脏疾病、钠离子通道的关系说明Corin在肾脏病的发生、发展中有着3 引言Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究重要的作用。肾脏疾病损害机制包括肾小球性和小管间质性，目前对肾小球损伤机制研究较多，对肾小管损伤机制及标志物研究尚少。慢性肾小管损伤多为不可逆性，因此对肾小球疾病中肾小管间质病变研究更具有重要意义。Corin蛋白特异性分布于肾小管上皮，既往研究发现血浆和尿液Corin无相关性，提示尿液中Corin来源于肾小管间质，因此研究CKD患者尿液中Corin水平的变化更能反映小管间质病变，有助于对小管损伤做到早发现、早治疗。肾脏病是一种炎症、免疫相关的疾病，微炎状态是指非病原微生物感染引起的一种慢性持续性炎症反应，其本质是免疫炎症，表现为hs-CRP、IL-1β、TNF-α和IL-6水平的增高。我们以往的研究也发现CKD患者存在炎症因子水平升高。机体的微炎状态促进肾脏细胞和基质增生、血管内皮损伤，促进肾脏病的进展。IL-1β主要参与T细胞的免疫调节，IL-6调节B细胞参与炎症反应，而TNF-α既参与炎症反应，对免疫调节又起到促进作用。为进一步研究炎症因子与Corin之间的关系，我们培养了人胚肾（HEK293）细胞和人近端小管上皮细胞（HK2）两种细胞进行研究。HEK293细胞是一种研究Corin比较成熟的细胞系，细胞存储器在Corin水解活化的酶，而且本实验室已经建立稳定表达Corin的稳定转染细胞系——HEK293Corin细胞，从而用于研究炎症因子与Corin合成及脱落活化的关系。HK2细胞是人近端小管上皮细胞，内源性表达CorinmRNA和ANPmRNA，因此HK2细胞内Corin的表达更加反映了生理情况下的变化，用于研究炎症因子作用下CorinmRNA的变化及信号通路的情况。2本课题主要围绕慢性肾脏病时（包括eGFR≥60ml/min∙1.73m的CKD早期患者2和eGFR<60ml/min∙1.73m的CKD晚期患者），血浆及尿液中Corin的表达水平、尿液中Corin含量变化的影响因素、细胞实验中炎症因子对Corin合成、脱落活化的影响及在炎症因子刺激下CorinmRNA的表达水平及相关信号通路等方面进行研究，旨在分析CKD时Corin表达、分布及活化的相关情况，分析CKD患者体液中Corin含量的变化及影响因素，及其在慢性肾脏病发生发展中所起的作用。4 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究材料与方法材料与方法1.实验材料1.1主要的试剂与材料名称公司ELISA试剂盒（humanCorin）美国R&D公司TMLegendMAXHumanTNF-αTMELISAkit、LegendMAXHumanIL-1βELISAkit美国BioLegend公司牛血清白蛋白（BSA）美国Sigma公司100ml培养皿、6孔板美国Corning公司DMEM高糖培养基美国Hyclone公司FBS(胎牛血清)美国Hyclone公司Opti-MEM培养基美国Gibco公司0.25%胰酶美国Hyclone公司炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）美国PeproTech公司SDS、Tris、TWEEN-20、CaCl2美国Sigma公司琼脂糖西班牙BiowestAgarose公司V5-HRPantibody美国Invitrogen公司蛋白marker立陶宛Fermentas公司PVDF膜美国Millipore公司X线胶片美国KODAK公司一抗二抗去除液中国碧云天生物有限公司GAPDH抗体美国GeneScript公司ECL显影液以色列BiologicalIndustries公司1.2主要的仪器和设备名称设备多功能酶标仪美国MolecularDevices公司培养箱美国ThermoFisher公司恒温金属浴美国Eppendorf公司Westernblot转移电泳槽美国BioRad公司往复式脱色摇床中国其贝林尔公司洗片机美国KODAK公司定量PCR仪德国Biometra公司-30℃、-80℃冰箱日本SANYO公司电子天平上海梅特勒-托利多仪器公司5 材料与方法Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究PH计上海天达公司旋涡混合器中国其林贝尔公司通风厨上海天立来公司1.3常用缓冲液及配置（1）10×磷酸盐缓冲液（PBS）：将NaCl:80.06g，KCl:2.01g，Na2HCO3:29.01g，KCl:2.01g，KH2P04：2.04g，溶于800mL去离子水中，调pH值至7.4，定容至1000mL。使用时稀释10倍至1×PBS。（2）0.05%PBST：在1000mL,pH7.4的1×PBS，加入tween-20500uL，混匀。（3）10×三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液（TBS）：NaCl:80.06g，Tris-base：30g，完全溶解800ml去离子水，调节pH值7.6，定容至1L。使用时稀释10倍至1×TBS。（4）0.1%吐温Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）：在1000mL1×TBS中加入1mLTween-20混匀。（5）1%牛血清白蛋白（BSA）：在1×PBS100mL中加入1gBSA混匀。（6）1MTris-HCl溶液（pH6.8/pH8.8）：取Tris121.1g溶于800mL去离子水中，用浓HCl调节pH值分别至6.8或8.8。定容至1000mL，4℃冷藏备用。（7）10%过硫酸铵（APS）溶液：1mL去离子水中加入0.1g过硫酸铵粉末混匀，4℃保存。（8）1NNaOH溶液：NaOH:40g，溶于1000mL去离子水中。（9）1NHCl溶液：取比重1.19的盐酸8.3mL，用去离子水稀释至1000mL。（10）10×蛋白电泳缓冲液：甘氨酸:144g，Tris-base:30.275g，十二烷基磺酸钠（SDS）:5g，溶于去离子水中定容至1000mL。使用时稀释10倍至1×电泳缓冲液。（11）10×蛋白转移缓冲液：甘氨酸:144g，Tris-base:30.275g，用去离子水定容至800mL。使用时取80mL10×蛋白转移缓冲液，去离子水720mL，200mL无水甲醇混匀即为1×蛋白转移缓冲液。（12）蛋白裂解液：1MTris-HCl（pH8.8）:5mL加入到60mL去离子水中，调pH值至8.0，然后加入NaCl:0.878g，TritonX-100:1mL，甘油:10mL，去离子水定容至100mL。使用时每50mL蛋白裂解液加入一片Rochecocktail蛋白酶抑制剂。-30℃储存。（13）5%脱脂奶粉封闭液：取1g脱脂奶粉溶于20mL1%TBST中。6 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究材料与方法2.实验方法2.1标本收集慢性肾脏病患者的血液及尿液标本收集于苏州大学附属第一医院肾内科，共652人，包括慢性肾脏病早期（eGFR≥60mL/min∙1.73m）患者31人及慢性肾脏病中晚期2（eGFR<60mL/min∙1.73m）患者34人。慢性肾脏病患者为慢性肾小球肾炎进展而来，排除高血压肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎、多发性骨髓瘤等继发性因素。正常对照组血浆及尿液样本收集于苏州大学附属第一医院体检部门的正常人，共21人。收集的新鲜血浆抗凝后，采用3000rpm离心10min，取上清，分管，置于-80℃保存。尿液样本采用3000rpm离心10min，弃沉淀，保存在-80℃备用。2.2可溶性Corin的测定血浆、尿液中可溶性Corin的检测是采用R&DELISA试剂盒。具体的步骤如下：（1）包板：用1×PBS稀释人Corin抗体（CA），每孔加入100ml，加完后用封膜贴住，4℃冰箱孵育过夜备用。（2）清洗、封闭：次日，从冰箱取出96孔板，甩去一抗CA，尽量拍干孔里的残留液体。用0.05%PBST洗三次，每次每孔300µL，第三次一定要拍干。配置1%BSA，每孔300µL，室温下（25℃）孵育1h。（3）清洗、加样：甩干BSA，用0.05%PBST清洗3遍，拍干。加入配置好的标准品（标准品的稀释浓度分别是2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL）加入标准品孔，每孔100uL。血浆Corin取50ul与1%BSA50uL1:1稀释后加入样本孔，尿液Corin不需要稀释，直接取100u加入样品孔。室温孵育2h。（4）清洗、二抗孵育：甩干样品，用0.05%PBST清洗3遍，第三遍拍干。配置人Corin抗体(DA)，每孔加入100µLDA，室温孵育2h。（5）清洗、显色、终止、测OD值：甩干二抗，用0.05%PBST清洗3遍，拍干。配置HRP，每孔加入100uL，室温避光孵育20min。拍干，PBST清洗3遍。配置TBM底物溶液，每孔100µL，室温避光孵育20min。每孔加入50µL的2MH2SO4终止液，孔内液体立即变成黄色，此时立即用酶标仪检测OD值。7 材料与方法Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究2.3血浆炎症因子的测定TM血浆炎性因子采用的是LegendMAXHumanTNF-αELISAkit和LegendTMMAXHumanIL-1ΒELISAkit。2.3.1IL-1β的测定：（1）用1×washbuffer清洗每个孔，清洗4遍，将液体拍干。（2）在标准品孔加入50uL的MayrixE，在样品孔加入50uLAssayBufferD。在标准品孔加入配置好的标准品50uL（浓度为1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL）。样品孔加入50uL的血浆。室温下，以200rpm摇晃2h。（3）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗4遍。每孔加入100ulHumanIL-1βDetectionAntibody。室温摇晃1h。（4）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗4遍。每孔加入100uL的Avidin-HRPD溶液。室温摇晃30min。（5）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗5遍。每孔加入100uL的SubstrateSolutionF，避光20min。（6）每孔加入100uLStopSolution，测OD值。2.3.2TNF-α的测定（1）用1×washbuffer清洗每个孔，清洗4遍，将液体拍干。（2）标准品孔及样品孔加入50uL的assaybufferA。在标准品孔加入配置好的标准品50uL（浓度为1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL）。样品孔加入50uL的血浆。室温下，以200rpm摇晃2h。（3）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗4遍。每孔加入100ulHumanTNF-αDetectionAntibody。室温摇晃1h。（4）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗4遍。每孔加入100uL的Avidin-HRPB溶液。室温摇晃30min。（5）甩掉孔内的液体，用washbuffer清洗5遍。每孔加入100uL的SubstrateSolutionD，避光15min。（6）每孔加入100uLStopSolution，测OD值。8 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究材料与方法2.4细胞培养在实验过程为研究Corin与炎症因子之间的相关性及炎症因子影响下Corin的信号通路，总共培养了2种细胞，分别是人胚肾人近端小管上皮细胞（HK2），稳定转染pcDNA3.1Corin质粒的人胚肾上皮细胞（HEK293-Corin），此质粒所编码的重组蛋白在C端带有V5标签，可用抗V5抗体对其进行Westernblot检测。细胞都采用常规的细胞培养方法，HK2细胞采用DMEM/F12（1:1）培养基，HEK293-Corin细胞的培养基为DMEM高糖培养基。两种培养基都加入10%胎牛血清（FBS）。放置37℃、含5%CO2的培养箱中。细胞每2-3天传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。人胚肾细胞(HEK293)来自于ATCC，质粒pcDNA3.1h-Corin来自于美国Invitrogen公司，建立稳定表达Corin的HEK293细胞是由苏州大学唐仲英实验室平台构建，为成熟的稳定转染细胞系。2.5蛋白质免疫印迹实验（westernblot）上清中Corin的测定：行westernblot时，采用六孔板接种细胞，每孔（3-3.5）×10^5个，待细胞贴壁，换培养基为opti-DMEM，同时加入不同浓度炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）培养24小时，取出六孔板，收集上清及裂解液。上清先离心弃细胞碎片，加入Corin抗体0.7uL及proteinAbeads30uL行免疫沉淀，4℃过夜后，1×PBS清洗3遍，加入2×non-reducingloadingbuffer，98-99℃加热1min，离心后行蛋白电泳。细胞中Corin的测定：细胞在冰上加入蛋白裂解液后充分裂解，收集裂解液，弃细胞碎片，加入2×loadingbuffer，98-99℃加热5min，离心1min。配置十二烷基硫酸钠聚苯烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶（具体的配置方案如图4），每孔加入20uL进行蛋白电泳。电泳时采用120V恒压，时间为90min。接着进行转膜，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移到PVDF膜上，转膜时采用恒流，200mA，时间120min。转膜后用5%的脱脂奶粉进行封闭，室温孵育2小时或者4℃过夜。人Corin抗体为V5-HRPantibody，用0.05%TBST1：5000稀释后，摇床孵育2小时。洗膜后将EZ-ECL中A液、B液1：1混合，均匀涂到PVDF膜上，室温避光1min，最后进行洗片机显影。9 材料与方法Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究表1：SDS-PAGE胶试剂5%浓缩胶10%分离胶dd-H2O1.40mL1.30mL30%Acr-Bis(29:1)0.33mL1.70mL1MTris-HCl（PH=6.8）0.25mL-1MTris-HCl（PH=8.8）-1.90mL10%SDS0.02mL0.05mL0.02mL0.05mL10%过硫酸铵0.01mL0.01mLTEMED2.6其他结果的测定肾小球滤过率（Estimatedglomerularfiltrationrate(eGFR)）是根据实验者的生化血肌酐水平及年龄用CKD-EPI公式计算得来的。超敏C-反应蛋白（hs-CRP）是由德国西门子公司生产的ADVIA2400仪器检测得出。尿白蛋白和尿β2-微球蛋白（β2-MG）是尿液中蛋白，尿白蛋白为肾小球源性尿蛋白，β2-MG为肾小管源性蛋白，二者的检测采用上海德波生物有限公司生产的ELISA试剂盒。分析尿液Corin来源时选用CKD早期组，而未选用CKD晚期组患者作为研究对象。β2-MG是小分子蛋白，可经肾小球滤过膜滤过，正常情况下，肾小管重吸收绝大部分，尿液中蛋白含量不会超过150mg/24h，当肾小管功能异常，重吸收蛋白减少，尿液中蛋白水平增加，尿β2-MG反应肾小管源性蛋白水平。尿液中Corin为大分子蛋白，来源于肾小管上皮细胞膜锚定Corin蛋白的脱落，CKD晚期组肾小管萎缩，肾小管上皮内Corin内源性减少，为避免CKD晚期组尿液Corin受肾功能影响，分析尿液中Corin来源时选用CKD早期组患者作为研究对象。2.7统计学分析ELISA的数据分析采用的是IBMSPSSstatistics19.0统计软件，数据以均值±标准误（SE）的形式表示。比较两组数据之间的差异时，采用学生t检验，P<0.05表示有统计学差异。Westernblot的统计采用ImageJ2x和GraphPadPrism5，数据以均值±标准误（SE）的形式表示。三组及以上差异比较采用one-wayANOVA，P<0.05表示有统计学差异，P<0.01，表示统计学差异显著。10 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究实验结果实验结果1.正常人和CKD患者的基本情况：本研究共收集21例正常人和65例CKD患者血浆及尿液标本，其中CKD患者2组依据肾小球滤过率（eGFR）水平分成2组，eGFR≥60mL/min∙1.73m为CKD早期2组，eGFR<60mL/min∙1.73m为CKD晚期组，基本信息如表2。基本特征正常者CKD-早期组CKD-晚期组#49.20±2.4249.81±2.5354.18±2.30年龄（岁）#性别（例）男121819女913152*eGFR(ml/min∙1.73m)98.12±3.6997.10±3.1817.43±3.07*血浆Corin(pg/ml)627.10±64.90744.90±82.59987.80±59.71**尿液Corin(pg/ml)84.45±6.93114.50±8.5027.22±5.00**24h尿蛋白(g/24h)N/A1.90±0.411.52±0.36尿β2-MG(mg/ml)N/A0.47±0.09—血浆IL-1β(pg/ml)1.68±0.251.94±0.24—血浆TNF-α(pg/ml)13.21±0.3716.19±0.63—表2：正常人和CKD患者的基本信息#正常人和CKD患者在年龄和性别分布上均不存在统计学差异。*P<0.05，与正常人比较，CKD组存在统计学差异。2.正常人和CKD患者血浆及尿液中Corin水平检测正常人及CKD患者血浆及尿液中Corin水平，发现在血浆及尿液中都可检测到可溶性Corin。比较CKD患者和正常人血浆中Corin水平，发现CKD早期患者血浆中Corin水平较正常对照组无显著差异（744.90±82.59vs627.10±64.90pg/ml,P>0.05），CKD晚期组血浆中Corin水平较正常人明显增加（987.80±59.71vs627.10±64.90pg/ml，P<0.001）(图3a)。与正常人相比较，CKD早期组尿液中Corin水平明显增加（84.45±6.93vs114.50±8.50pg/ml，P=0.003），CKD晚期组尿液中Corin水平明显降低（84.45±6.93vs27.22±5.00pg/ml,P<0.001）(图3b)。11 实验结果Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究图3：正常人和CKD患者血浆及尿液中Corin水平图a:正常人和CKD患者血浆中Corin水平，CKD晚期组血浆Corin水平较正常人和CKD早期组明显升高（P<0.001）。图b:正常人和CKD患者尿液中Corin的水平，CKD早期组较正常人明显升高(P=0.003)，CKD晚期组较正常人明显降低(P<0.001)。3.尿液中Corin与eGFRCKD晚期患者尿液中Corin水平较正常对照组明显降低，分析慢性肾脏病患者尿液中Corin与肾小球滤过率（eGFR）之间的相关性，发现尿液中Corin与eGFR呈正相关（P<0.05）(图4)。CKD晚期，随着eGFR下降，肾脏病的严重程度递增，尿液中Corin水平下降。图4：尿液中Corin与eGFR相关性分析CKD患者尿液中Corin与肾小球滤过率（eGFR）呈正相关（P<0.05）。4.尿液中Corin来源分析尿液中可检测到可溶性Corin，为分析尿液中Corin来源，我们选用CKD早期患者的尿液。为防止CKD晚期组肾小球滤过膜大面积破坏，大量蛋白滤过，影响肾小球源性及肾小管源性蛋白区分，我们未将CKD晚期组患者纳入分析范围。我们分析CKD早期患者尿液中Corin水平与血浆中Corin之间的相关性、与肾小球源性尿白蛋12 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究实验结果白水平及肾小管源性尿β2-MG之间的相关性，发现尿Corin与血浆中Corin无相关性（R=0.16,P>0.05）（图5a），与尿白蛋白水平无相关性（R=-0.14，P>0.05）（图5b），与尿β2-MG水平显著相关性（R=0.52，P=0.01）（图5c）。图5：尿液中Corin来源分析图a:CKD早期组患者尿液中Corin与血浆中Corin水平的相关性分析（P>0.05）；图b:尿液中Corin与肾小球源性尿白蛋白水平之间的相关性（P>0.05）；图c：尿液中Corin水平与尿液肾小管源性尿β2-MG之间的相关性分析（P=0.01）。5.尿液中Corin水平影响因素的分析CKD晚期患者尿液中Corin水平明显低于正常人，为排除肾脏病晚期，肾小管萎缩，肾小管上皮内Corin分布减少的影响因素，分析尿液中Corin水平影响因素时2选用eGFR≥60ml/min∙1.73m的CKD早期患者作为研究对象。CKD早期患者尿液中Corin水平明显高于正常人，为分析其原因，我们比较了尿液中Corin水平与血浆中hs-CRP、IL-1β和TNF-α之间的相关性。结果发现CKD早期组与正常人相比，血浆炎症因子水平无差异。CKD早期组尿液Corin水平与hs-CRP无相关性（P>0.05）（图6a），与血浆IL-1β呈正相关（P=0.03）（图6b），与血浆TNF-α水平无相关性（P>0.05）（图6c）。图6：尿液中Corin水平影响因素分析13 实验结果Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究图a：CKD早期组患者尿液中Corin与血浆CRP之间的相关性分析（P>0.05）；图b：尿液中Corin与血浆IL-1β之间的相关性分析（P<0.05）；图c：尿液中Corin与血浆TNF-α之间的相关性分析（P>0.05）。6.细胞实验6.1Corin与IL-1β为进一步研究Corin与IL-1β之间相关系，我们培养了稳定转染Corin质粒的HEK293细胞，用不同浓度的IL-1β(0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml)加入到细胞培养基中，24h后收集上清及细胞裂解液，行western-blot检测Corin蛋白水平，发现细胞上清中Corin水平随着IL-1β浓度递增明显增加（表示为上清中Corin/总的Corin:0.20±0.02vs0.38±0.02vs0.37±0.03vs0.50±0.05,P<0.01)(如图7a)，而各组细胞裂解液中Corin水平无明显差异（表示为裂解中Corin/GAPDH:1.48±0.09vs1.42±0.17vs1.74±0.20vs1.57±0.15,P>0.05）（如图7b）。将1ng/ml的IL-1β加入上清中分别孵育12h、24h、36h、48h，收集上清裂解液，细胞上清中Corin水平呈时间递增（0.20±0.02vs1.44±0.12vs2.91±0.30vs5.65±0.38,P<0.01）（如图7c），而细胞裂解液中Corin水平无差异（P>0.05）。图7：Corin与IL-1β图a:在不同浓度的IL-1β作用下，HEK293Corin细胞上清中Corin水平（P<0.01）。14 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究实验结果图b:在不同浓度的IL-1β作用下，HEK293Corin细胞裂解液中Corin水平（P>0.05）。图c:用1ng/mlIL-1β培养HEK293Corin细胞不同时间段，细胞上清中Corin水平（P<0.01）。图d、e、f分别是图a、b、c的数据统计图。6.2Corin与TNF-α用含不同浓度（0ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL）的TNF-α培养HEK293Corin细胞，分析TNF-α与Corin之间的关系。发现只有当TNF-α的浓度达到10ng/mL时，上清中的Corin才会较对照组（0ng/mL组）有显著增加（P=0.02）（如图8a），各组裂解液中Corin的水平无明显差异（1.42±0.05vs1.27±0.16vs1.22±0.11vs1.29±0.25,P>0.05）（如图8b）。图8：Corin与TNF-α图a:不同浓度的TNF-α刺激下细胞培养基中Corin的含量（P<0.05）。图b:不同浓度TNF-α刺激下细胞裂解液中Corin的水平（P>0.05）。图c、d分别为图a、b的数据统计。6.3Corin与IL-6用相同的方法研究IL-6与Corin的关系，IL-6的浓度梯度是0ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL，各组细胞上清和细胞裂解液中Corin均无明显差异（上清：0.50±0.03vs0.56±0.02vs0.51±0.03vs0.48±0.03，P>0.05，裂解液：1.22±0.15vs1.15±15 实验结果Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究0.20vs1.35±0.17,P>0.05）（如图9）。图9：Corin与IL-6图a:用含有不同浓度的IL-6孵育含量细胞培养基中Corin的含量（P>0.05）。图b:不同浓度IL-6孵育后细胞裂解液中Corin的水平（P>0.05）。图c、d分别为图a、b的数据统计。6.4.IL-1β与CorinmRNA为进一步研究IL-1β对Corin合成的影响，我们培养了HK2细胞，HK2细胞为人近端小管上皮细胞，内源性表达CorinmRNA、ANPmRNA，HK2细胞内Corin的表达更直接反映生理情况下的变化。用不同浓度（0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）IL-1β孵育HK2细胞，qPCR方法检测CorinmRNA水平，发现各组间CorinmRNA水平无差异（P>0.05），ANPmRNA水平无差异（P>0.05）。图10：IL-1β与CorinmRNA和ANPmRNA图a:各IL-1β浓度组间，CorinmRNA水平无差异（N=3，P>0.05）；图b:各IL-1β浓度组间，ANPmRNA水平无差异（N=3，P>0.05）。16 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究讨论讨论Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要表达于心肌细胞[1-4]，从心肌细胞表面脱落进入血液循环，蛋白水解心钠肽（ANP）前体，生成有活性ANP，发挥排钠利尿、扩张血管的作用，在调节血压、维持心脏功能方面发挥重要作用。应用免疫荧光方法发现肾脏组织中也有Corin蛋白，主要分布于上皮细胞中，包括近端小管、髓袢升支粗段、连接小管和集合管[8]。Corin在肾脏组织中特异性分布，是否与慢性肾脏病晚期钠水潴留、高血压有关，是否参与慢性肾脏病发生发展进程，是我们主要研究目的。Corin是一种膜锚定蛋白，而在血浆和尿液中都可以检测到可溶性Corin，既往研究发现，血浆中可溶性Corin是Corin的胞外段经过剪切脱落至血液循环，到达靶器官，与靶器官表面受体结合，发挥排钠利尿、扩张血管的生物学作用[6,10]。在正常人和CKD患者尿液中都可检测到可溶性Corin，正常肾小球滤过膜允许分子量为20-40KDa的蛋白滤过，Corin属于160KDa-180KDa大分子蛋白，正常情况下不会经过滤过膜间隙漏出。我们首先分析了CKD患者血浆和尿液中的相关性，发现两者无相关性；因尿液中白蛋白为肾小球源性，我们进一步分析尿液中Corin与尿液中白蛋白相关性后发现尿液中Corin与尿白蛋白无相关性，上述研究提示尿液中可溶性Corin并非来源于肾小球的滤过。那么尿液中的可溶性Corin来自于哪里？尿液中β2-MG代表肾小管源性尿蛋白，分析尿液中Corin与尿β2-MG之间相关性发现尿液中Corin与尿β2-MG呈正相关，提示尿液中Corin来自于肾小管。DannyPolzin等用免疫荧光的方法证明Corin在肾脏的分布主要位于肾小管上皮细胞[8]，因此考虑尿液中可溶性Corin来源于肾小管上皮膜锚定的Corin蛋白的脱落。与正常对照组相比，CKD晚期患者血浆中可溶性Corin水平明显增加，考虑与慢性肾脏病晚期肾小球滤过率下降、肾素-血管紧张素-醛固酮系统启动、交感系统亢进引起钠水潴留、血压升高有关，Corin代偿性增加促进排钠、利尿、舒张血管从而维持内环境稳态。CKD晚期组患者较正常人尿液中可溶性Corin水平明显较低，该结果与方朝东[20]等应用免疫荧光方法发现CKD组肾脏组织中Corin表达分布较正常人明显降低一致。Corin在肾脏组织中主要分布于肾小管上皮细胞，随着慢性肾脏病17 讨论Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究疾病严重程度增加，肾小管上皮萎缩，上皮细胞内Corin分布减少，脱落至尿液中可溶性Corin也随之降低。尿液中Corin水平与肾小球滤过率（eGFR）呈正相关，随着CKD疾病进展、肾功能下降，尿液中Corin水平随之降低，提示尿液中Corin水平在一定程度上反映CKD肾功能损害程度。CKD晚期患者尿液中Corin水平较正常对照组明显降低，与CKD晚期肾小管萎缩、Corin分布量减少有关，进一步分析尿液中Corin影响因素时CKD晚期组患者尿液中Corin水平受肾功能影响较明显；而CKD早期患者尿液中Corin较正常对照组明显升高，与早期肾小管损伤有关，研究CKD早期患者的影响因素更有利于延缓肾2脏病进展，因此，我们选择eGFR≥60ml/min∙1.73m的CKD早期患者进一步研究影响Corin的因素。分析CKD早期组患者血浆及尿液中可溶性Corin水平发现，与CKD晚期组患者不同，CKD早期组患者血浆中可溶性Corin与正常对照组无显著差异，而尿液中Corin水平明显高于正常对照组。哪些因素影响了尿液中Corin的水平？肾脏病是一种炎症、免疫相关的疾病，微炎状态是指非病原微生物感染引起的一种慢性持续性炎症反应，表现为全身循环中炎性蛋白、炎性相关因子水平轻度增高，其本质是免疫炎症。机体的微炎状态促进肾脏细胞和基质增生、血管内皮损伤，促进肾脏病的进展。以往研究发现CKD患者体内存在微炎状态，表现为血浆中hs-CRP、IL-1β、TNF-α和IL-6水平的轻度增高[21]。因此，分析尿液中Corin水平影响因素，我们主要分析了尿液中Corin水平与hs-CRPIL-1β、TNF-α之间的相关性。结果显示尿液中Corin与血浆IL-1β呈正相关，与hs-CRP、TNF-α无显著相关。尿液中Corin水平的增加与血浆中IL-1β有关，血浆IL-1β是如何调节尿液中Corin水平？为进一步研究Corin与炎症因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）之间的关系，我们采用细胞学实验进行分析。此处选用的是人胚肾（HEK293）细胞，HEK293细胞是一种研究Corin比较成熟的细胞系，细胞存储器在Corin水解活化的酶，而且本实验室已经建立稳定表达Corin的稳定转染细胞系——HEK293Corin细胞，从而用于研究炎症因子与Corin合成及脱落活化的关系。而人近端小管上皮细胞（HK2）是人近端小管上皮细胞，内源性表达CorinmRNA和ANPmRNA，因此HK2细胞内Corin的表达更加反映了生理情况下的变化，用于研究炎症因子作用下CorinmRNA的变化。随着IL-1β浓度的递增，HEK293细胞上清中Corin呈递增趋势，而细胞裂解液中Corin在18 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究讨论各浓度组之间无明显差异。随着IL-1β培养时间递增，上清中Corin水平是增加的，细胞裂解液中Corin无明显差异。提示上清中的Corin与IL-1β呈现时间和剂量依赖关系，而裂解液中Corin与IL-1β无相关性。因此考虑炎症因子IL-1β促进Corin从细胞膜表面脱落，而对Corin的合成，无明显作用。HK2细胞实验时CorinmRNA水平在各浓度组间无差异进一步提示IL-1β对Corin的合成无影响。用TNF-α孵育细胞时，只有TNF-α浓度达到10ng/ml时，上清中Corin才会较空白组明显增加，细胞裂解液中Corin无明显改变，提示TNF-α对Corin的脱落有一定的作用，但需要达到相应的浓度，这也就解释了CKD早期组患者尿液中Corin与血浆中IL-1β呈正相关，而与TNF-α无显著相关性，因为正常人血浆中的TNF-α处于较低水平，远未达到10ng/ml。用IL-6孵育细胞时，上清和细胞裂解液中Corin都无明显改变。IL-1β和TNF-α是由单核细胞、淋巴细胞产生，参与炎症免疫调节，IL-6诱导B细胞分化和产生抗体，是炎症的促发剂。炎症因子中IL-1β、TNF-α对Corin有直接促进脱落的作用，而未发现IL-6可直接促进Corin脱落。CKD早期患者尿液中Corin明显高于正常对照组，考虑肾脏疾病时机体内微炎状态，血浆IL-1β水平增加，IL-1β促进肾小管上皮细胞膜锚定的Corin蛋白脱落，继而在尿液中检测到Corin水平的增加。实验中未发现hs-CRP、IL-6与Corin存在相关性，考虑与炎症因子检测精确度低及未对CKD早期患者进行病理分类有关，hs-CRP、IL-6与Corin的关系还需进一步研究。在本次实验中，发现CKD早期及晚期患者尿液中Corin水平差异较大，两者为不同机制影响Corin脱落。CKD早期，与体内微炎状态及肾小管损伤有关，CKD晚期与肾脏病加重、肾小管萎缩有关。CKD患者尿液中Corin的变化与肾小管功能有关，而炎症因子是在早期发挥作用的致病因子之一。本实验第一次发现炎症因子IL-1β促进Corin从细胞膜表面脱落，而对Corin生物学合成无明显作用的，是否这种脱落与小管上皮细胞功能的丢失有关？这对研究Corin蛋白的生物学作用及Corin与肾脏病的进展具有非常重要的意义。因此，我们进一步应用qPCR法检测炎性因子刺激的人近端小管上皮细胞（HK2）中ANPmRNA的表达，但结果不具备统计价值，可能与HK2细胞表达量较少有关。本次实验中未进行IL-1β对Corin裂解的下游产物合成（PDE5、ENaCmRNA）是否有影响进行检测，因此Corin与肾性高血压之间的关系尚需进一步研究。19 结论Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究结论Corin是一种新近发现的丝氨酸蛋白酶，主要表达于心肌细胞，在调节血压、维持心脏功能方面发挥重要作用。肾脏组织中也有Corin蛋白，主要分布于上皮细胞，Corin在肾脏组织的特异分布，提示Corin可能是参与肾脏发生发展的重要因素。本实验对慢性肾脏病患者血浆及尿液中Corin表达水平、尿液中Corin含量变化的影响因素、细胞实验中炎症因子对Corin合成、脱落活化的影响等方面进行研究，得出以下结论：1.CKD患者血浆和尿液中存在可溶性Corin，尿液中Corin并非来源于肾小球滤过，提示来自小管上皮细胞，与局部Corin蛋白脱落有关。2.CKD晚期患者尿液中可溶性Corin水平与eGFR呈正相关。尿液中Corin水平随着慢性肾脏病加重而降低，提示尿液中Corin水平可在一定程度上反应肾脏功能。3.炎症因子IL-1β,TNF-α促进肾脏细胞Corin脱落，对Corin合成无显著影响。提示肾脏病患者体内微炎状态影响Corin代谢。20 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究参考文献参考文献(1).GladyshevaIP,RobinsonBR,HoungAK,KovatsTandKingSM:Corinisco-expressedwithpro-ANPandlocalizedonthecardiomyocytesurfaceinbothzymogenandcatalyticallyactiveforms.JMolCellCardiol,2008.44:131-142,(2).DongL,WangH,DongN,ZhangC,XueBandWuQ:LocalizationofCorinandatrialnatriureticpeptideexpressioninhumanrenalsegments.ClinSci(Lond),2016.130:1655-1664,(3).WuQ:TheserineproteaseCorinincardiovascularbiologyanddisease.FrontBiosci,2007.12:4179-4190,(4).ChenS,SenS,YoungD,WangW,MoravecCSandWuQ:ProteaseCorinexpressionandactivityinfailinghearts.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2010.299:H1687-1692,(5).YanW,ShengN,SetoM,MorserJandWuQ:Corin,amosaictransmembraneserineproteaseencodedbyanovelcDNAfromhumanheart.JBiolChem,1999.274:14926-14935,(6).YanW,WuF,MorserJandWuQ:Corin,atransmembranecardiacserineprotease,actsasapro-atrialnatriureticpeptide-convertingenzyme.ProcNatlAcadSciUSA,2000.97:8525-8529,(7).deBoldAJ,BorensteinHB,VeressATandSonnenbergH:Arapidandpotentnatriureticresponsetointravenousinjectionofatrialmyocardialextractinrats.ReprintedfromLifeSci.28:89-94,1981.JAmSocNephrol,2001.12:403-409;discussion403-408,408-409,(8).PolzinD,KaminskiHJ,KastnerC,etal.:DecreasedrenalCorinexpressioncontributestosodiumretentioninproteinurickidneydiseases.KidneyInternational,2010.78:650-659,(9).HooperJD,ScarmanAL,ClarkeBE,NormyleJFandAntalisTM:LocalizationofthemosaictransmembraneserineproteaseCorintoheartmyocytes.EurJBiochem,2000.267:6931-6937,(10).ChenS,CaoP,DongN,etal.:PCSK6-mediatedCorinactivationisessentialfornormalbloodpressure.2015.21:1048-1053,21 参考文献Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究(11).WuQ,Xu-CaiYO,ChenSandWangW:Corin:newinsightsintothenatriureticpeptidesystem.KidneyInternational,2009.75:142-146,(12).IchikiT,HuntleyBK,HeubleinDM,etal.:Corinispresentinthenormalhumanheart,kidney,andblood,withpro-B-typenatriureticpeptideprocessinginthecirculation.ClinChem,2011.57:40-47,(13).CharoenpanichA,WallME,TuckerCJ,AndrewsDM,LalushDSandLoboaEG:Microarrayanalysisofhumanadipose-derivedstemcellsinthree-dimensionalcollagenculture:osteogenesisinhibitsbonemorphogenicproteinandWntsignalingpathways,andcyclictensilestraincausesupregulationofproinflammatorycytokineregulatorsandangiogenicfactors.TissueEngPartA,2011.17:2615-2627,(14).Enshell-SeijffersD,LindonCandMorganBA:TheserineproteaseCorinisanovelmodifieroftheAgoutipathway.Development,2008.135:217-225,(15).NigrovicPA,GrayDH,JonesT,etal.:Geneticinversioninmastcell-deficient(Wsh)miceinterruptsCorinandmanifestsashematopoieticandcardiacaberrancy.AmJPathol,2008.173:1693-1701,(16).ArmalyZ,AssadySandAbassiZ:Corin:anewplayerintheregulationofsalt-waterbalanceandbloodpressure.CurrOpinNephrolHypertens,2013.22:713-722,(17).WangW,ShenJ,CuiY,etal.:Impairedsodiumexcretionandsalt-sensitivehypertensioninCorin-deficientmice.KidneyInternational,2012.82:26-33,(18).CuiY,WangW,DongN,etal.:RoleofCorinintrophoblastinvasionanduterinespiralarteryremodellinginpregnancy.Nature,2012.484:246-250,(19).KleinJD:Corin:anANPproteasethatmayregulatesodiumreabsorptioninnephroticsyndrome.KidneyInternational,2010.78:635-637,(20).FangC,ShenL,DongL,etal.:Reducedurinarycorinlevelsinpatientswithchronickidneydisease.ClinicalScience,2013.124:709-717,(21).KurellaTamuraM,TamK,VittinghoffE,etal.:Inflammatorymarkersandriskforcognitivedeclineinchronickidneydisease:theCRICstudy.KidneyIntRep.20172(2):192-20022 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究综述综述Corin在慢性肾脏病中的作用及相关机制摘要Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，主要表达于心肌细胞。Corin可以特异性的活化心房钠尿肽（ANP），发挥利钠、排尿的作用，从而调节血压。研究表明肾脏中也存在Corin，主要表达于上皮细胞中。尿液中可检测到可溶性Corin，并且Corin的浓度与慢性肾脏病的严重程度相关。提示Corin可能在肾脏病及肾性高血压中发挥重要的作用。关键词：Corin;心钠肽;钠水平衡;钠离子通道;慢性肾脏病TheFunctionandMechanismofCorininChronicKidneyDiseaseCorinisatypeIItransmembraneserineprotease,whichisfirstdetectedinatrialandventricularcardiacmyocytes.ThefunctionofCorinisactivatingpro-atrialnatriureticpeptide,aninactivehormone,toanactivehormone,ANP.ANPreducessodiumandwaterreabsorptionandplaysanimportantroleinregulationbloodpressure.Corinisalsodetectedintheepithelialcellsofkidney,andthelevelsofCoriniscorrelatedwithkidneydiseasesseverity.ThissuggeststhatCorinmaybehaveanimportantroleinkidneydiseases.Keywords:Corin,atrialnatriureticpeptide(ANP),sodium-waterbalance,chronickidneydisease,epithelialsodiumchannel(ENaC)Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶（typeIItransmembraneserineprotease,TTSPs），主要表达于心肌细胞[1,5]，可通过对心钠肽（atrialnatriureticpeptide,ANP）和脑钠肽（brainorB-typenatriureticpeptide,BNP）前体（pro-ANP和pro-BNP）的蛋白水解作用，生成有活性ANP和BNP。ANP和BNP释放入血，通过利钠、排尿、扩张血管等，在调节血压、维持心脏功能方面发挥重要作用[5,7,21]。肾脏组织中也存在Corin，主要表达于近端小管、髓袢升支、连接小管和集合管等上皮组织中[8]。尿液中可检测到可溶性Corin,且Corin的浓度与慢性肾脏病（chronickidneydisease,CKD）的严重程度相关[22]。肾病模型的大鼠肾脏中Corin的表达水平显著降低，同时Corin基因敲除的小鼠肾脏中可检测到ANP、环磷鸟苷（cGMP）水平下降而23 综述Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究Pro-ANP、磷酸二酯酶5（PDE5）、磷酸化磷酸二酯酶5（p-PDE5）、钠离子通道（ENaC）的β亚单位水平升高[8]，提示Corin通过ANP信号通路发挥生物学作用。本文主要阐述Corin的分子结构特征及生物学功能，并介绍在CKD中Corin的表达及可能的参与机制，从而为该疾病的诊断、治疗、预后提供相关的基础研究。▪1.Corin的分子结构及生理功能Corin是近期发现的一类II型跨膜丝氨酸蛋白酶。人类Corin的基因位于4号染色体上[9]，全长约5千个碱基对,编码由1042个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶[5]。与Hepsin等II型跨膜丝氨酸蛋白酶一样，Corin也是一种膜锚定蛋白，具备基本的结构特征[23-26]，Corin由1个N-末端的胞内段、1个跨膜结构域（transmembranedomain,TM）、2个卷曲样结构（frizzleddomain,Fz）、8个低密度脂蛋白受体结构(lowdensitylipoproteinreceptor,LDLR)、1个清道夫样受体结构(scavengerreceptor,SR)[5]以及C-末端胰蛋白酶样蛋白酶结构组成,其中蛋白酶区域含有II型跨膜丝氨酸蛋白酶的高度保守序列——丝氨酸（serine,Ser）、组氨酸（histidine,His）、天冬氨酸（asparticacid,Asp）构成的三联体，形成丝氨酸蛋白酶发挥生物学活性的功能部位[3]。全长的Corin是无活性的单链酶原，需要经过蛋白酶的裂解活化，活化位点位于801位精氨酸（Arg）与802位异亮氨酸（Ile）之间，最后形成羧基端的保守序列，即只有活化的Corin才具备生物学功能[27]。心血管活性肽家族包括三个成员，分别是心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）和C型钠尿肽（CNP），他们都是以前体无活性的形式（prepropeptide）存在，必须经过蛋白酶的水解作用生成活性形式[11]。其中ANP和BNP主要存在于心肌细胞，释放入血发后发挥利钠、排尿、舒张血管的作用从而维持血压，而CNP则存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞和软骨细胞等，抑制血管平滑肌细胞的增值和防止冠状动脉狭窄[11]。ANP是以利钠肽原前肽（prepro-ANP）的形式合成，经过信号肽酶（signalpeptidase）剪切，形成利钠肽原（pro-ANP），后者在Corin的蛋白水解作用下形成有功能的ANP[21]。Corin即为pro-ANP的特异性活化酶[21,28,29]。Corin可在pro-ANP的第98位精氨酸（Arg）的位置剪切，生成由98个氨基酸组成的N-末端无活性的肽（N-terminalpeptide）和由28个氨基酸组成的C-末端活性形式（ANP）[11]。Corin也可以剪切pro-BNP生成有活性的BNP,但这种蛋白水解作用是非特异性的。以上说明Corin是通过水解活化钠尿肽来发挥生物学作用的。24 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究综述▪2.Corin的肾脏组织分布Corin最早是在心脏中发现的，表达于心肌细胞中。无论胎儿还是成人都可以检测到Corin的mRNA和蛋白表达，并且心房中的表达含量高于心室[5]，这与ANP较高表达于心房细胞一致。然而，除了心肌细胞，CorinmRNA还在其他组织中检测到，包括肾脏、妊娠子宫、骨骼组织、小鼠皮肤毛囊[8,12-14]。但在其他肌肉丰富的组织，如胃、小肠、膀胱、骨骼肌等没有检测到Corin的表达[8]。DannyPolzin等用免疫荧光的方法分析小鼠肾脏不同部位Corin的表达，结果显示Corin主要分布于上皮细胞中，包括近端小管（proximaltubule）、髓袢升支粗段（sickascendinglimb,TAL）、连接小管（connectingtubule）和集合管（collectingduct,CD）。在近端小管，Corin定位于顶端膜区；在TAL，Corin表达于核周和胞质内的囊泡；在CD，Corin表达于胞质的囊泡中；间质细胞也检测到Corin的少量表达[8]。在小鼠肾脏中，原位杂交显示ANPmRNA的组织分布与Corin具有一致性。在近端小管刷状缘检测到少量ANPmRNA，而在TAL、连接小管、全长CD中检测到ANP的高水平表达。在肾小球内，ANPmRNA仅在足细胞中表达，而在其他的肾小球细胞中未检测到ANPmRNA[8]。Corin与ANP在肾脏中分布的一致性提示Corin主要是通过活化ANP，进而发挥利钠、利尿、维持钠-水平衡的作用。▪3.Corin与高血压、肾脏病Corin通过活化ANP，发挥利钠排尿、扩张血管的作用从而调节钠水平衡、调节血压。相关的实验证据主要有：Corin基因敲除小鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压都明显高于野生型小鼠[15,16]。高盐饮食的情况下，基因敲除鼠的血压呈现更高的趋势[11,17]，而过表达ANP/BNP或者钠尿肽受体A（NPRA）的转基因小鼠呈现低血压的状态[16]。近期，在人类Corin基因上，主要是美国非洲裔，发现了两个核苷酸多态性（SNPs）位点（T555I和Q568P），研究表明这两个SNPs增加了患高血压、心肌肥厚的风险。主要是由于T555I/Q568P影响了Corin的正常表达，从而抑制ANP活化，进一步影响血压[30]。QingyuWu等用基因敲除鼠研究Corin与妊娠期高血压的关系时发现，基因敲除鼠在妊娠后期更易出现高血压、蛋白尿等子痫前期的症状，除此之外还发现基因敲除鼠的肾脏改变，主要包括肾小球缺血、塌陷，细胞外基质增多，肾小球毛细血管狭窄25 综述Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究以及基底膜增厚[18]。这些肾脏的病理改变同样影响着血压。Corin不仅通过ANP/NPRA的信号通路调节钠水平衡，还会导致肾脏的生理结构改变，从而影响高血压。同时肾脏病亦影响血压、Corin的表达，形成恶性循环。▪4.Corin与慢性肾脏病CKD是指各种原因导致的肾脏结构和功能改变的一类疾病，流行病学调查研究显示慢性肾脏病的国内患病率高达10.8%，且80%的患者存在高血压。导致血压升高、液体潴留症状的原因有很多，主要包括肾小球滤过率下降，肾小管重吸收钠、水增加，血容量增加；肾素-血管紧张素-醛固酮系统（rennin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）激活，导致血管收缩，保钠排钾；交感神经系统激活，血管加压素（vasopressin，VP）、胰岛素样生长因子（IGF）增多。另外血管舒张/钠水排泄的物质如ANP、NO减少也是液体潴留、血压升高的重要原因，并且近期越来越受到重视。当高盐饮食、体内液体潴留时，Corin水解活化ANP，通过调节各个相关途径来调节水钠平衡。ANP舒张入球小动脉、收缩出球小动脉，从而增加肾小球毛细血管静水压，进而增加肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate，GFR）。另外ANP可以抑+++-制近端小管Na-H共交换体、远端小管Na-Cl共转运体、集合管的钠离子通道（ENaC）以及顶端膜的水通道蛋白，从而抑制钠离子重吸收，从而增加钠水排泄。ANP还有抑制血管紧张素II和醛固酮的钠水潴留的作用[16]。然而，当肾脏病变甚至发展到CKD时，Corin的表达明显降低[22]，发挥利钠、排尿的生物学功能也明显下降。DannyPolzin分别用嘌呤霉素氨基核苷（puromycinaminonucleoside，PAN）和单克隆抗体OX-7构建了大鼠肾病综合征（nephroticsyndrome，NS）模型和急性肾小球肾炎（acuteglomerulonephritis，GN）模型[8]，微阵列分析表明PAN和GN鼠的肾脏皮质和髓质中CorinmRNA的表达水平较对照组均降低，且髓质中RNA水平降低更显著。另外有研究分析了慢性肾脏病患者中尿液和血液中的Corin浓度，表明尿液中的Corin并非都来源于血浆，还有一部分是来源于肾小管上皮[22]。CKD患者尿液中Corin的浓度显著低于正常对照组，且尿液中的Corin的浓度与患者的GFR呈正相关，也就是说尿液中Corin的浓度与CKD患者的严重程度相关[22]，因此尿液中的可溶性Corin可用于评估CKD的病情进展。▪5.Corin参与钠水调节的机制上皮钠离子通道（ENaC）是一种高选择性阳离子通道，分布于远端肾小管、膀26 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究综述胱上皮、大肠上皮、外分泌腺管以及气道上皮，由α、β、γ-ENaC3种同源亚单位组成，在水钠平衡、血压及血容量的调节中起重要作用。钠离子通道结构上含一个大的胞外环、两个跨膜区及两个短的胞内N端和C端。钠离子通道主要是电压依赖的，然而最新研究表明钠离子通道亦可被细胞膜紧张性激活，当其胞外环被丝氨酸蛋白酶剪切后，两个跨膜区可向两侧移动，使膜的紧张性进一步增强，即通道可因酶剪切而被激活，其中plasmin就已经在尿液中检测，corin作为II型跨膜丝氨酸蛋白酶家族一员，亦可能参与钠离子通道的调节。正常情况，Corin水解活化ANP后，后者识别钠尿肽受体（natriureticpeptidereceptor，NPR），激活膜结合的鸟苷酸环化酶，继而生成环磷鸟苷（cGMP），后者继续激活下游的信号通路，cGMP依赖的磷酸二酯酶（PDEs）和蛋白激酶（PKGs），继而发挥利钠、排尿、血管舒张的作用[8,16,19]。然而，当Corin基因缺陷或者表达异常时，活化的ANP生成减少，cGMP降低，而PDE5、磷酸化的磷酸二酯酶5（p-PDE5）、PKGII、β-ENaC明显升高，但是水通道蛋白2（AQP2）未见明显改变[8]（参见图1）。ENaC表达增多，钠重吸收增多，继而钠水潴留。但是应用阿米洛利可以抑制钠离子通道，从而纠正Corin降低而引起的钠水潴留。提示ANP对水钠的调节与钠离子通道有关，而与AQP2无关。▪6.总结Corin在肾脏中的表达及在尿液中的水平与慢性肾脏病有关。随着慢性肾脏病进展，Corin的表达含量降低，钠离子通道表达升高，钠重吸收增加，钠水潴留，血压升高，是形成高血压的原因之一。进一步研究Corin在肾脏病中的意义和作用，将为研究慢性肾脏病尤其是肾性高血压的发生和发展机制提供很好的理论依据。参考文献(1).GladyshevaIP,RobinsonBR,HoungAK,KovatsTandKingSM:Corinisco-expressedwithpro-ANPandlocalizedonthecardiomyocytesurfaceinbothzymogenandcatalyticallyactiveforms.JMolCellCardiol,2008.44:131-142,(2).DongL,WangH,DongN,ZhangC,XueBandWuQ:Localizationofcorinandatrialnatriureticpeptideexpressioninhumanrenalsegments.ClinSci(Lond),2016.130:1655-1664,(3).WuQ:Theserineproteasecorinincardiovascularbiologyanddisease.Front27 综述Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究Biosci,2007.12:4179-4190,(4).ChenS,SenS,YoungD,WangW,MoravecCSandWuQ:Proteasecorinexpressionandactivityinfailinghearts.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2010.299:H1687-1692,(5).YanW,ShengN,SetoM,MorserJandWuQ:Corin,amosaictransmembraneserineproteaseencodedbyanovelcDNAfromhumanheart.JBiolChem,1999.274:14926-14935,(6).YanW,WuF,MorserJandWuQ:Corin,atransmembranecardiacserineprotease,actsasapro-atrialnatriureticpeptide-convertingenzyme.ProcNatlAcadSciUSA,2000.97:8525-8529,(7).deBoldAJ,BorensteinHB,VeressATandSonnenbergH:Arapidandpotentnatriureticresponsetointravenousinjectionofatrialmyocardialextractinrats.ReprintedfromLifeSci.28:89-94,1981.JAmSocNephrol,2001.12:403-409;discussion403-408,408-409,(8).PolzinD,KaminskiHJ,KastnerC,etal.:Decreasedrenalcorinexpressioncontributestosodiumretentioninproteinurickidneydiseases.KidneyInternational,2010.78:650-659,(9).HooperJD,ScarmanAL,ClarkeBE,NormyleJFandAntalisTM:Localizationofthemosaictransmembraneserineproteasecorintoheartmyocytes.EurJBiochem,2000.267:6931-6937,(10).ChenS,CaoP,DongN,etal.:PCSK6-mediatedcorinactivationisessentialfornormalbloodpressure.2015.21:1048-1053,(11).WuQ,Xu-CaiYO,ChenSandWangW:Corin:newinsightsintothenatriureticpeptidesystem.KidneyInternational,2009.75:142-146,(12).IchikiT,HuntleyBK,HeubleinDM,etal.:Corinispresentinthenormalhumanheart,kidney,andblood,withpro-B-typenatriureticpeptideprocessinginthecirculation.ClinChem,2011.57:40-47,(13).CharoenpanichA,WallME,TuckerCJ,AndrewsDM,LalushDSandLoboaEG:Microarrayanalysisofhumanadipose-derivedstemcellsinthree-dimensionalcollagenculture:osteogenesisinhibitsbonemorphogenicproteinandWntsignalingpathways,andcyclictensilestraincausesupregulationofproinflammatorycytokineregulatorsandangiogenicfactors.TissueEngPartA,2011.17:2615-2627,28 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Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究英文缩略词汇表英文缩略词汇表英文缩写全称中文名称ANPatrialnatriureticpeptide心房钠尿肽Aspasparticacid天冬氨酸Argarginine精氨酸BNPbrainorB-typenatriureticpeptide脑钠肽β2-MGβ2-microglobulinβ2-微球蛋白CAcaptureantibody获得性抗体cGMPcyclicguanosinemonophosphate环磷鸟苷CKDChronickidneydisease慢性肾脏病CRPC-reactiveproteinC-反应蛋白DAdetectionantibody检测性抗体eGFREstimatedglomerularfiltrationrate肾小球滤过率ENaCEpithelialsodiumchannel钠离子通道ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附法Fzfrizzleddomain卷曲样结构GNglomerulonephritis肾小球肾炎HEK293Humanembryonickidney293cells人胚肾细胞HK2近端小管上皮细胞Hishistidine组氨酸31 英文缩略词汇表Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究LDLRlowdensitylipoproteinreceptor低密度脂蛋白受体NPR-Anatriureticpeptidereceptor-A钠尿肽受体-ANSnephroticsyndrome肾病综合征ODopticaldensity光密度PDEsphosphodiesteras磷酸二酯酶抑制剂PKGsproteinkinaseG蛋白激酶GPANpuromycinaminonucleoside嘌呤霉素氨基核苷RAASrenin-angiotensin-aldosteronesystem肾素-血管紧张素-醛固酮系统SRscavengerreceptor清道夫样受体Serserine丝氨酸32 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究硕士学位期间所发表的论文*1.SunC,ShenL,ShaW,ZhouL,XuD,DongN,CytokinesIncreasedUrinaryCorininPatientswithPrimaryProteinuricKidneyDiseases.(underreview).*2.孙词，沈蕾，Corin在慢性肾脏病中的作用及相关机制，国际泌尿系统杂志，2017，33 本课题所获得的基金资助Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究本课题所获得的基金资助1.江苏省卫生科研项目：H201415。34 Corin在肾脏病中的表达及与炎性因子相关性的研究致谢致谢时光荏苒，转眼间三年的研究生阶段即将结束，回想这个阶段的经历，丰富且充实，虽遭遇挫折，经历失败，但是身边总有老师和同学的帮助、朋友的关心和家人的支持。在此，谨向关心我的老师、同学、朋友和家人致以最诚挚的感谢。首先，我要感谢我的导师沈蕾主任。我很庆幸，在研究生阶段遇到这样一位良师益友，无论在学习、工作还是生活上，都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在短短三年，所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识、成熟的思维方式、表达能力，更重要的是做人做事的方式方法，这将成为我终身受用的财富。在此，谨向您致以最崇高的敬意和衷心的感谢。其次，我要感谢苏州大学唐仲英血液中心吴庆宇和董宁征教授，因为本课题的完成主要在吴庆宇教授平台进行。在实验室期间，两位老师提供最先进的实验平台和良好的学习氛围，对我的实验更是悉心指导，在此，向您致以衷心的感谢。感谢苏大附一院肾内科的卢国元主任、沙文刚老师、周玲老师、徐德宇老师和杨静老师，感谢五位老师在我读研期间对我学术上的指导、临床上教诲和生活上的帮助。感谢实验室平台的刘萌、周田田老师，感谢李慧、张玥博士对我实验的指导。最后感谢我的父母、家人和朋友，是你们一直在背后默默的支持、理解、给予动力，感谢你们。孙词苏州大学附属第一医院肾内科35 ．硕论文（专业学位）■．＇ｓ＇；．ｌ．．．＇■ｖ．苏州大学研究生院统一印制
