猪萨佩罗病毒抗体检测方法的建立与初步应用

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硕士学位论文猪萨佩罗病毒抗体检测方法的建立与初步应用研究生姓名彭旺指导教师余兴龙教授学科专业预防兽医学研究方向病原分子生物学与免疫学二0一七年六月 分类号S85密级公开UDC单位代码10537湖南农业大学硕士学位论文猪萨佩罗病毒抗体检测方法的建立与初步应用Establishmentandapplicationofantibodydetectionmethodforporcinesapelovirus1研究生姓名彭旺指导教师余兴龙教授学科专业预防兽医学研究方向病原分子生物学与免疫学论文答辩日期20170609答辩委员会主席程天印教授论文评阅人朱战波教授陈陆教授罗锐副教授二0一七年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在指导教师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，并同意将由此产生的收益捐赠给学校教育基金会用于发展研究生教育。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日指导教师签名：时间：年月日 摘要摘要猪萨佩罗病毒（Porcinesapelovirus1，PSV-1)属于小RNA病毒科，萨佩罗病毒属，是一种无囊膜、球形的单股正链RNA病毒，可引起猪腹泻、肺炎、生殖障碍、非化脓性脑炎和脊髓炎等多系统综合征。本研究以原核表达的PSV-VP1蛋白建立了检测PSV-1抗体的间接ELISA方法，并与建立的间接免疫荧光技术（IFA）进行了比较；运用该方法研究了PSV-1的抗体消长规律。具体内容如下：1．以实验室分离的PSVHuN1/2016株制备细胞抗原板，一抗和荧光二抗均稀释300倍，建立了检测PSV-1抗体的IFA方法。2．将PSV-1编码VP1基因克隆至pET-28a(+)载体，构建重组质粒。Westernblot试验表明纯化的包涵体形式的重组蛋白具有良好的特异性和反应原性。以VP1建立的间接ELISA方法条件为：抗原包被250ng/孔、血清稀释100倍、血清在37℃孵育30min、酶标二抗稀释6000倍在37℃孵育30min、底物在37℃作用20min。以S/P值≥0.235为阳性，S/P值≤0.191值为阴性，介于两者之间为可疑。对比建立的ELISA方法和IFA方法，两者总符合率为82.6%。抗原板批内与批间变异系数为1.6～7.0%。3．以该方法对采自湖南省5个规模化猪场400份血清样品进行检测，结果显示，五个场的PSV-1抗体消长规律大致相同：第2-6周龄仔猪抗体较低且呈下降趋势；8-12周龄仔猪抗体呈上升趋势，之后到18周龄抗体平均水平基本稳定；母猪群抗体平均值较低。关键词：猪萨佩罗病毒；重组VP1蛋白；间接免疫荧光；酶联免疫吸附测定I AbstractAbstractPorcinesapelovirus1（PSV-1）isasingle-stranded,positive-senseRNAvirus,belongingtothegenusSapelovirus,withinthefamilyPicornaviridae.PSV-1infectionsoccurworldwideandareassociatedwithawidespectrumofsymptomsrangingfromasymptomatictoclinicalmanifestationsincludingdiarrhea,pneumonia,polioencephalomyelitis,andreproductivedisorders.Inthisstudy,anindirectELISAmethodforthedetectionofPSV-1antibodieswasestablished,andcomparedwiththeestablishedindirectimmunofluorescencetechnique(IFA).Thecontentsareasfollows:1．TheIFAmethodfordetectingPSV-1antibodywasestablishedbyusingPSVHuN1/2016strainisolatedbyourlaboratory.Theprimaryantibodyandfluorescentsecondaryantibodyinthemethodwerediluted300times.2．TherecombinantplasmidwasconstructedbyintroducingPSV-1encodingVP1geneintopET-28a(+)vector.Westernblotanalysisshowedthatthepurifiedrecombinantinclusionbodieshadgoodspecificityandreactivity.TheindirectELISAmethodestablishedbyVP1wasasfollows:theantigenwascoatedwith250ng/well;theserumwasdiluted100times;theserumwasincubatedat37℃for30min;theenzymelabeledsecondaryantibodywasdiluted6000timesandwasincubatedat37℃for30min;thesubstratewasincubatedat37℃for20min.Wedefinethepositive,iftheS/Pvalue≥0.235,S/Pvalue≤0.191valueisnegative,andtheremainingwassuspicious.Thetotalcoincidenceratewas82.6%betweentheestablishedELISAmethodandIFAmethod.Coefficientofvariationofintraandinterantigenplatebatchwere1.6to7.0%.3．Wedetected400serumsamplescollectedfrom5intensivepigfarms,TheresultsshowedthatdynamicchangesofPSV-1antibodyinthefivefieldsweresimilar:theantibodyof2-6weeksoldpigletswerelowandshowedadescendingtrend;theantibodyof8-12weeksoldpigletsshowedanascendingtrend;untilthe18weeksoldpiglets,theaverageantibodylevelwasbasicallystable;theaverageofantibodywaslowinsowgroup.Keywords:PSV-1;therecombinantVP1protein;IFA;ELISAIII 目录目录摘要...........................................................................................................IAbstract.....................................................................................................III目录............................................................................................................V第一章文献综述......................................................................................11.1病原特性...............................................................................................11.1.1PSV-1的分类地位............................................................................11.1.2PSV-1的形态....................................................................................21.1.3PSV-1培养特性................................................................................21.2分子病原学研究..................................................................................21.2.1PSV-1的基因组结构........................................................................21.2.2PSV-1基因组结构的功能研究........................................................31.2.3PSV-1的分子流行病学....................................................................61.3致病性研究..........................................................................................71.3.1PSV-1病理性研究............................................................................71.3.2PSV-1致病机理................................................................................81.4流行病学...............................................................................................81.4.1国外PSV-1流行现状.......................................................................81.4.2国内PSV-1流行现状.......................................................................91.5诊断方法.............................................................................................101.5.1细胞分离.........................................................................................101.5.2免疫组化.........................................................................................101.5.3反转录PCR.....................................................................................101.5.4巢式PCR.........................................................................................101.5.5实时荧光定量PCR.........................................................................111.5.6原位杂交技术.................................................................................111.6研究目的与意义................................................................................11第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化...........................................132.1材料.....................................................................................................132.1.1病毒和菌株.....................................................................................13V 湖南农业大学硕士学位论文2.1.2主要试剂.........................................................................................132.1.3主要仪器.........................................................................................132.2实验方法.............................................................................................142.2.1PSVVP1蛋白基因的获取.............................................................142.2.2重组质粒的构建与鉴定.................................................................162.2.3重组蛋白的表达.............................................................................182.2.4重组蛋白的纯化.............................................................................192.2.5重组蛋白的抗原性鉴定.................................................................202.3结果.....................................................................................................202.3.1PSV-1病毒培养..............................................................................202.3.2PSVVP1基因的PCR扩增...........................................................212.3.3重组质粒PET28-VP1的酶切鉴定................................................212.3.4重组蛋白的测序结果.....................................................................222.3.5重组蛋白的诱导表达.....................................................................222.3.6重组蛋白的纯化.............................................................................232.3.7重组蛋白的抗原性鉴定结果.........................................................242.4讨论.....................................................................................................242.4.1目的基因的选择.............................................................................242.4.2表达系统的选择.............................................................................242.4.3目的蛋白的纯化.............................................................................252.4.4重组蛋白的抗原性.........................................................................252.5小结.....................................................................................................25第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立................................273.1材料.....................................................................................................273.1.1细胞、病毒和血清.........................................................................273.1.2主要试剂.........................................................................................273.1.3主要仪器.........................................................................................283.2方法.....................................................................................................283.2.1间接免疫荧光方法的基本操作步骤.............................................283.2.2制备细胞抗原板.............................................................................283.2.3间接免疫荧光方法的条件优化.....................................................29VI 目录3.2.4特异性试验.....................................................................................303.2.5敏感度试验.....................................................................................303.2.6应用建立的IFA方法检测临床血清.............................................303.3结果.....................................................................................................303.3.1病毒培养时间的确定.....................................................................303.3.2封闭液的选择.................................................................................313.3.3血清孵育条件的确定.....................................................................313.3.4血清和荧光二抗最佳稀释度的确定.............................................313.3.5特异性试验结果.............................................................................323.3.6敏感度试验结果.............................................................................323.3.7应用建立的IFA方法检测临床血清结果.....................................323.4讨论.....................................................................................................333.4.1间接免疫荧光方法的选择.............................................................333.4.2减少非特异性干扰.........................................................................333.4.3应用建立的方法检测临床血清.....................................................343.5小结.....................................................................................................34第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用...............374.1材料.....................................................................................................374.1.1病毒和血清.....................................................................................374.1.2主要试剂.........................................................................................374.1.3主要仪器.........................................................................................374.2方法.....................................................................................................374.2.1重组PSVVP1蛋白的间接ELISA方法的建立与条件优化......374.2.2特异性试验.....................................................................................394.2.3敏感度试验.....................................................................................394.2.4重复性试验.....................................................................................404.2.5阴阳性临界值的确定.....................................................................404.2.6PSV-1间接ELISA检测方法和IFA检测方法检测血清对比....404.2.7应用建立的PSV-1间接ELISA检测方法检测临床血清...........404.3结果.....................................................................................................404.3.1最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定.................................40VII 湖南农业大学硕士学位论文4.3.2血清样品最佳孵育时间的确定.....................................................414.3.3最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间的确定.................................424.3.4底物最佳作用时间的确定.............................................................434.3.5重复性试验.....................................................................................444.3.6阴阳性临界值的确定.....................................................................464.3.7特异性试验.....................................................................................464.3.8敏感度试验.....................................................................................464.3.9PSV-1间接ELISA检测方法和IFA检测方法检测血清对比....474.3.10应用建立的PSV-1间接ELISA检测方法检测临床血清结果.474.4讨论.....................................................................................................524.4.1蛋白包被浓度.................................................................................524.4.2一抗和酶标二抗浓度以及作用时间.............................................524.4.3确定临界值.....................................................................................524.4.4ELISA方法和IFA方法对比.........................................................524.4.5五个规模化猪场PSV-1抗体消长规律.........................................52全文结论...................................................................................................55参考文献...................................................................................................57缩略词表...................................................................................................65致谢...........................................................................................................67作者简介...................................................................................................68VIII 第一章文献综述第一章文献综述1.1病原特性1.1.1PSV-1的分类地位猪萨佩罗病毒（PorcineSapelovirus1，PSV-1)是一种无囊膜、球形单股正链[1]RNA病毒，属于小RNA病毒科，萨佩罗病毒属。猪萨佩罗病毒最开始是从猪的肠道中分离获得，因此先前将其称为肠道病毒8型，命名为PEV-8，被归类为[2]猪肠道病毒A（PEV-A）。猪肠道病毒最初是根据在猪肾源IBRS-2细胞系培养中产生不同的CPE的类型和在各种宿主细胞系中的复制特性以及血清实验被[3]-[5]分成三大类型（I型：PEV1-7和11-15，II型：PEV-8，III型：PEV9和10）。后来的研究发现，猪肠道病毒8型具有多蛋白前体的N-末端的前导L蛋白和由约226个氨基酸组成的2A蛋白比其他肠道病毒的约140个氨基酸组成的2A蛋白大的多，以及5′端非编码区（UTR）具有一个高度发散的IV型5'UTR内部[6]-[8]核糖体进入位点（IRES）与其他的肠道病毒相比较差异大。随后，小RNA病毒科研究小组根据猪萨佩罗病毒的特有的L蛋白及结构高度特异的2A、2B、3C基因序列和P1cap、2C、3Cpro、3Dpol区域基因序列与其他肠道病毒比较差异很大（分别为31-37％、35-45％、39-52％、52-58％）。因此提出在小核糖核酸病毒科中建立一种新的属“Sapelovirus”，将猪肠道病毒[9]A（PEV-8）归类为猪萨佩罗病毒属。2009年，国际病毒分类委员会（ICTV）第9次报告正式将猪肠道病毒A（PorcineEnterovirusA）更名为猪萨佩罗病毒[1]（PorcinesapelovirusA）。在2014年的ICTV会议中，又将Porcinesapelovirus[10]A统一命名为porcinesapelovirus1（PSV-1）。萨佩罗病毒属由三个种组成：猪萨佩罗病毒（Porcinesapelovirus）、禽萨佩罗病毒（Aviansapelovirus）和猿萨佩罗病毒（Simiansapelovirus）。2008年，在[11]美国的野鼠粪便中检测到萨佩罗病毒的部分P1序列。2011年，在美国加利福尼亚海狮中发现了两株新的萨佩罗病毒，并暂时命名为加利福尼亚海狮萨佩罗病[12]毒1和2。猪萨佩罗病毒可感染家猪和野猪，各年龄阶段猪只都可感染。各地区分离的PSV-1毒株都为同一血清型，有研究报道PSV-1存在三种不同的基因亚型，但国际上还未有定论，尚需要进一步的研究证实。1 湖南农业大学硕士学位论文1.1.2PSV-1的形态猪萨佩罗病毒粒子结构在投射电子显微镜下观察为无囊膜、球形、表面光滑、[24]直径约为30nm（如图1-1）。猪萨佩罗病毒与其他小RNA病毒类似，病毒衣壳呈20面体，立体对称结构，具有排列整齐的壳粒，衣壳内为线状单股正链核糖核酸。图1-1投射电子显微镜下的PSV-1病毒粒子Fig.1-1ThemorphologyofthePSV-1underprojectionelectronmicroscopy1.1.3PSV-1培养特性PSV-1能在体外培养的猪肾源细胞系中增殖，1960年LamontPH等第一次用猪肾细胞分离到能使细胞产生细胞质收缩和突起病变的PSV-1毒株(PSVV13[13]株）。包括中国、韩国、印度PSV-1分离株也均用猪肾源细胞系分离培养，[14]-[17]且PSV-1能产生明显的细胞病变。此外，PSV-1也能在体外的猪肠上皮细[18]胞系（IPEC-J2）内繁殖。为了确定PSV-1在体外培养是否对猪源细胞具有严格的趋向性，KimDS等用放射性标记物标记PSV-1（KS04105株）去接种来源猪、鸡、仓鼠、猫、狗、非洲绿猴和人类的细胞系。结果显示PSV-1（KS04105株）仅在来源猪的细胞[16]（LLC-PK和PK-15）中增殖。但也研究报道，从野猪粪便中分离的PSV-1能[19]使恒河猴肾细胞系MA-104产生明显的病变。1.2分子病原学研究1.2.1PSV-1的基因组结构猪萨佩罗病毒为单股正链小RNA病毒，完整基因组由约7500个核苷酸组成，基因组两端为保守的5'和3'非编码区，中间为编码区，碱基（G+C）含量约2 第一章文献综述为47%。5'非翻译区（5’Untranslatedregion，UTR）约含490nt，具有次级RNA[20,21]结构（包括IRES），该结构是RNA翻译和复制过程中所需要的。3'非编码区（3’Untranslatedregion，UTR）约含79nt，具有与其他肠道病毒一样的poly[22,23]（A）尾，poly（A）尾参与维持病毒感染力所必需的X茎环结构的形成。中间编码区仅含有约7000nt长的单一开放阅读框（openreadingframe，ORF）基因组，编码一个长度2322～2331个氨基酸的多聚蛋白前体，多聚蛋白前体被自身编码的蛋白酶切割成12种较小的功能活性蛋白，从5’～3’端顺序分别为：前导L、VP4、VP3、VP2、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D，如下图1-2所示。其中，P1（VP4、VP3、VP2、VP1）组成病毒结构蛋白，P2（2A、2B、[24,25]2C）和P3（3A、3B、3C、3D）组成病毒非结构蛋白。图1-2PSV-1全基因组结构图Fig.1-2ThemapofPSV-1completegenomestructure1.2.2PSV-1基因组结构的功能研究从目前已知对猪萨佩罗病毒的基因结构研究发现，猪萨佩罗病毒大部分基因结构与其他小RNA病毒基因结构有高度相似，因此参考其他小RNA病毒科病毒的研究分析猪萨佩罗病毒的基因结构功能具有重要的研究意义。小RNA病毒科是核糖核酸病毒中结构最小的类群，但却是一个极为繁杂的病毒科。目前，国际病毒分类委员会（ICTV）将小RNA病毒科分为35个属，82个种类，感染猪的有口蹄疫病毒、猪萨佩罗病毒、猪肠道病毒、猪捷申病毒[1]等。小RNA病毒科的不同属与成员之间的差异，主要因为病毒一级基因结构的差别，即氨基酸残基的排列顺序的不同，从而导致不同属间存在抗原性、各种细胞内的生长能力和对外界环境的抵抗力的差异。尽管不同的小核糖核酸病毒显示出不同程度的相关性，但所有小核糖核酸病毒的基因组含有RNA病毒复制所需要的几种不同的顺式活性RNA元件，如在5'的内部核糖体进入位点（internal3 湖南农业大学硕士学位论文ribosomeentrysite，IRES）、存在多区域的顺式复制元件(Cis-actingreplication[26]element，CRE）和poly（A）尾。小RNA病毒蛋白的合成，是一种非帽子结构依赖性的翻译模式，依靠内部核糖体进入位点（internalribosomeentrysite，IRES）能够被核糖体识别并与之结合，从而直接启动病毒基因的翻译。当小RNA病毒感染宿主细胞时，依靠IRES这种特殊结构，使病毒自身的蛋白翻译不受影响。目前为止，已经有5种IRES[27]被鉴定出来。1.2.2.1PSV-1的5'UTR结构功能研究PSV-1的5'非翻译区（5’Untranslatedregion，UTR）约含490个核苷酸，相比较而言较短，例如脊髓灰质炎病毒5'UTR长约740个核苷酸，口蹄疫病毒（FMDV）5'UTR超过1300个核苷酸。SonKY等将三株韩国分离的PSV-1序列（KS04105，KS05151，KS055217）和其他已知的PSV-1毒株序列进行对比研究，发现PSV-15'UTR存在较小的茎环结构，且结构域与IV型IRES的结构域[28,29]相似，IV型IRES主要存在于丙型肝炎病毒（HCV）和猪瘟病毒（CSFV）中。在这之前，ChardLS等也报道了PSVV13株和猿萨佩罗病毒SV2株的IRES元[30]件在结构和功能上与猪捷申病毒和丙型肝炎病毒的IV型IRES元件相似。此外，SonKY等还发现PSV5'UTR结构域存在多个亚结构域，包括一个假结体和两个高度保守的茎环，这些结构与HCVIRES类似，可能直接与40S核糖[31]体亚基相互作用，在病毒复制和翻译过程中发挥重要作用。1.2.2.2PSV-1的3'UTR结构功能研究小RNA病毒的3'UTR是一个极其复杂的结构，是调控病毒基因复制的主要位点，其核心结构由碱基互补配对形成的二级茎环结构(stem-loopstructure)组成[32]。SonKY等分析了PSV3'UTR的结构特点，基于3'UTR的大小，将PSV-1分为82个核苷酸长的V13组（此组包括KS04105、KS05151、KS055217、YC2011和V13株）和62个核苷酸长的csh组。这两个PSV-1组都有两个共同的域X和Y，可以形成一个茎环结构。不同的是V13组含有位于结构域Y上游的第三茎环结构域Z。终止密码子（UGA）所在的结构域Z是PSV3'UTR的最保守区，而结构域Y和X被认为是更可变区。此外，在结构域Z的环中由于区域之间核苷酸的（8个核苷酸：KS04105、KS05151、KS055217、YC2011株；7个核苷酸：[24]V13株）相互作用，形成内部分子“吻型”结构。有研究表明存在于病毒3'UTR[33]的内部分子“吻型”结构在病毒复制和翻译过程中扮演重要角色。4 第一章文献综述1.2.2.3PSV-1编码区的部分结构功能研究猪萨佩罗病毒只有单一开放阅读框（openreadingframe，ORF）基因组，编码一个长度2322-2331个氨基酸的多聚蛋白前体，多聚蛋白前体被自身编码的蛋白酶切割成较小的功能活性蛋白，分别为：前导L蛋白、P1（VP4、VP3、VP2、VP1）组成病毒结构蛋白、P2（2A、2B、2C）和P3（3A、3B、3C、3D）组成病毒非结构蛋白。根据已有的小RNA病毒研究显示，VP1蛋白是柯萨奇病毒诱导机体产生体[34,35]液免疫应答的优势抗原，是口蹄疫病毒具有抗原性的关键成分。此外，在肠道病毒中VP1蛋白是诱导感染机体产生中和抗体和病毒维持感染性的主要蛋白[36]。PSV-1结构蛋白VP1位于PSV-1粒子最外部的表面蛋白。陈俊伟等研究发[37]现，克隆表达的PSV-1VP1重组蛋白具有很好的反应原性。有位于结构蛋白之前的前导L蛋白的小RNA病毒科当中的病毒只有心病毒[38]属、口蹄疫病毒属、马鼻病毒属、嵴病毒属、捷申病毒属、萨佩罗病毒属。在口蹄疫病毒属和马鼻病毒属中，L蛋白是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，能够切割自己的羧基末端和引起真核起始因子（eukaryoticinitiationfactor4G，eIF4G）[39]解旋以及导致宿主细胞蛋白质合成的关闭。心肌炎病毒的L蛋白结合锌，在[38]病毒感染期间磷酸化，并且影响病毒基因组翻译的效率。PSV-1毒株的前导蛋白序列长度为252个核苷酸（84个氨基酸）具有较高的氨基酸同源性（95.2-100％）。但PSV-1上的前导L蛋白缺乏蛋白水解活性所必需的催化性残基基序，并且在前导氨基末端区域中不含有在FMDVL蛋白中发现的木瓜蛋白酶样巯基蛋白酶中的催化对子Cys、His，也不含有在心肌炎病毒中发现的锌结合基序Cys-His-Cys-Cys。PSV-1的L蛋白的具体功能还需要更多深入的研究。顺式复制元件(Cis-actingreplicationelement，CRE）是RNA病毒复制中所必[40]需的要素。CRE作为VPg尿苷酰化形成VPg-pU-pU的模板并且含有必需的基序AAAYA。这些相对短的元件可以位于基因组内的不同位置，它位于肠道病毒[41][42]的2C区域，B型鼻病毒的VP1区域，C型鼻病毒和心病毒中的VP2区域[43,44][45][46]，肝病毒的3D区域，口蹄疫病毒中的IRES上游。SonKY等通过分析CRE必需基序AAAYA，暴露AAACA基序的茎环结构只存于PSV-1的2C[66]编码区域，因此推定猪萨佩罗病毒的CRE仅位于PSV-1的2C基因编码区上。5 湖南农业大学硕士学位论文1.2.3PSV-1的分子流行病学目前，仅有15株猪萨佩罗病毒全基因序列和部分基因片段序列在Sapelovirus[47]Aseqs网站上公布。最早为1960年在英国分离的V13株（2002年上传），2009年后，中国各地区陆续有分离报道（csh、YC2011、JD2011、QT2013、HuN1、HuN2、HuN3、HuN4），2014年韩国上传三株PSV-1全基因序列（KS055217,KS05151andKS04105）。最近，在美国（IA33375、NC）和印度（C-6）也有PSV-1全基因序列公布。虽然在小核糖核酸病毒科内的猪萨佩罗病毒具有典型的小RNA病毒基因组结构5'（UTR）-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'UTR，但是PSV-1毒株群内的结构基因组特征存在差异。2016年，VilarMJ等对西班牙的某一农场同一周龄猪群分离到的9株PSV-1的多聚蛋白的部分基因比对分析，结果显示在3D聚合酶区域，鉴定出多达8个变异体，其分布在两个基因簇中，簇内同源性为97-99％，簇1与簇2间的同源性为87.20-88.63％。表明在同一个农场中存在多个不同基因型的PSV-1毒株，且可同时感染同一周龄段的猪群，形成一个突变株病毒群。此外，该研究还发现[48]PSV-1与其他肠道病毒EV-G在小猪体内可共同感染。2011年在捷克共和国[49]的一项研究调查中，几种猪肠道病毒在猪体内被同时检测到。2016年YangT等对中国湖南省分离的4株PSVVP1序列和部分已知的40个PSVVP1基因序列（500nt）进行系统进化分析研究。结果显示中国湖南省分离的4株PSVVP1序列间的同源性为72.2%～98.6%，其中HuN1株与其他三株HuN2株、HuN3株、HuN4株同源性最低。此外，基于部分和全长VP1基因序列的系统发育拓扑学分析，大多数亚洲（中国和韩国）分离株在同一簇内，但中国湖南分离株HuN2、3和4与来自其他不同地区的分离株同簇，显示分子水平上中国的PSV-1存在遗传多样性。研究还对PSV-1毒株的基因组进行重组分析，推测在PSV-1毒株群内出现病毒重组，重组毒株HuN2（潜在的亲本毒株：HuN1[15]和HuN3），这可能是影响PSV-1遗传多样性因素之一。SonKY等研究在韩国、英国和中国分离的PSV-1毒株之间进行比较分析，发现在2C编码区中的顺式复制元件（CRE）和3'UTR中的结构域不同分离株间[24]有所不同。这些基因组特征的差异可能影响近几十年来从不同地区和国家分离的PSV-1毒株的毒力和致病性。6 第一章文献综述1.3致病性研究1.3.1PSV-1病理性研究早在上世纪80年代就已经有研究报道在自然和人工感染条件下PSVV13株[50,51]（以前称PEV-8）与猪腹泻、肺炎和生殖疾病存在一定的联系。1996年MelnickJL等根据在猪中观察到的神经元病理学发现，PSV-1与其它嗜神经小RNA病毒科病毒类似，主要攻击靶标是大的运动神经元和背根神经[52]节神经元。2014年英国SchockA等报道了神经侵袭性猪萨佩罗病毒引起的脑脊髓炎的爆发。在2008年中的2－3个月内，约发生35例，该疾病发生在仔猪断奶后3－4周，对四头患病猪中枢神经系统的组织病理学检查显示，有明显的亚急性多灶性非化脓性脑脊髓炎。在脑干尾端和脊髓的灰质中存在不同区域的损伤，其中[53]小脑和大脑皮质出现神经元噬神经细胞现象和溶解病理特征。2016年9月，PHEArruda等报道了在美国由萨佩罗病毒引起的猪脑炎和脊髓灰质炎爆发。研究显示，约有3000只11周龄左右的育肥猪发生了非典型的神经症状疾病，总发病率为20％，病死率为30％。发病猪出现食欲不振、行动不便、共济失调、精神迟钝、麻痹和对外界环境刺激的反应减少的临床症状。组织病理学检查显示发病猪的大脑、小脑和脊髓有严重的淋巴细胞和浆细胞浸润、伴有神经胶质增生和神经元卫星现象的坏死性脊髓灰质炎。下一代基因测序（Next-generationsequencing）显示仅检测到PSV-1而未检测到其他或新的病原[54]体。2016年9月，韩国KimDS等用PSV-1分离毒株（KS04105毒株）口服接种3日龄仔猪，实时荧光PCR检测显示，在接种后第3天，仔猪体内PSV-1病毒含量达到峰值，第5天后开始下降。组织病理学和免疫组化检查结果显示，仔猪小肠绒毛萎缩、隐窝增生，大肠隐窝上皮细胞增生，肺细支气管粘膜下层和细支气管周围出现淋巴细胞浸润，脑和脊髓灰白质区域出现血管周围淋巴细胞聚集和神经胶质增生，且症状随感染后器官组织中病毒含量的增长趋势而变化。而在仔猪的其它器官和组织没有观察到和病毒感染有关的特异性损伤。此外，研究还对接种PSV-1仔猪的血清、粪便、器官和组织进行定量RT-PCR测定对比分析，与接种后采集的仔猪粪便样品相比，PSV-1RNA在血清，脊髓，肺和脑中的含量相对较低。这些研究数据表明PSV-1可能通过破坏绒毛中的肠细胞从腔侧穿7 湖南农业大学硕士学位论文透肠屏障到达血液中，并产生病毒血症，然后扩散到肠道以外的器官和组织中[16]。猪萨佩罗病毒可引起动物机体出现腹泻、肺炎、生殖障碍、非化脓性脑炎和[14,51,53]脊髓炎等多系统综合征。但也有研究报道从无症状猪中的粪便检测到[55]PSV-1。这些研究表明PSV-1根据感染动物机体的年龄、饲养环境和感染途径以及感染病毒株的毒力强弱可表现为无明显症状的亚临床状态，也可表现为明显的机体多系统损伤。1.3.2PSV-1致病机理[56]所有病毒都是通过结合易感宿主细胞表面上的特异性受体来进行感染。KimDS等研究证明了PSV-1可以识别位于细胞膜表面的GD1a神经节苷脂上以α2,3连接的唾液酸作为受体，此外研究还证实了GD1a神经节苷脂，可以恢复[57]PSV-1结合和感染活性。LanD等研究发现当猪肠上皮细胞（IPEC-J2）感染PSV-1时，大量的I型干扰素被诱导以及相关的干扰素效应通路被有效激活，同时也激活了三种先天免疫受体（Toll样、NOD样和RIG-I样受体），然后通过MHCI和MHCII途径加工和呈递抗原，并且在PSV-1感染期间也激活两种外源和内源性凋亡途径。此外，研究还发现PSV-1感染早期可有效激活粘膜固有层[58]IgA的分泌。PSV-1的致病机理就目前的研究程度而言，大部分仍然是未知的，还需要更多的深入研究。1.4流行病学1.4.1国外PSV-1流行现状[13]猪萨佩罗病毒最早于1960年在英国发现，随后，1964年日本、1966年[59,60,51]加拿大、1982年澳大利亚相继出现报道。早期PSV-1的检测通常使用细[61,62]胞分离培养，再通过交叉中和试验定型，操作技术要求高，且检出率低。近年来，随着检测技术不断发展，世界各地陆续出现PSV-1研究报道。在欧洲，BuitragoD等对2004至2005年间从西班牙10个自治区采集的600[63]份猪粪便样品进行RT-PCR检测。结果显示，PSV-1阳性率为9％（18/600）。VilarMJ等对采自位于加泰罗尼亚（西班牙最重要的养猪区之一）的6个不同农场的352头猪粪便样品采用RT-PCR检测，结果显示在所有六个农场中PSV-1仅在3号农场中3周龄仔猪的10份样品（阳性率100％）中检测到，场阳性率[48]为16.6%（1/6），总样品阳性率为2.84％（10/352）。SozziE等通过对分离8 第一章文献综述[55]的40株小RNA病毒测序，证实猪萨佩罗病毒在意大利流行。ProdělalováJ等在2005年至2011年间于捷克共和国内共收集279份猪粪便和肠内容物样品，其中207份为家猪样品和72份为野猪样品。通过巢式PCR对这些样品进行检测。结果显示，家猪共检测出70份PSV-1阳性样品，阳性率为33.8%，其中家猪样品中采自哺乳仔猪阶段的阳性率为14.2%（14/96），保育猪阶段阳性率为96%（24/25），肥猪阶段的阳性率为69.5%（32/46），野猪共检测出20份PSV-1[49]阳性样品，阳性率为27.8%（20/72）。在美洲，DoninDG等对巴西南部巴拉那州采集的22份野猪粪便样品进行[64]巢式PCR检测，结果显示PSV-1阳性率为18.2%（4/22）。2016年ChenQ等对来自美国不同地理位置的217个猪粪样品进行宏基因组学测序分析。结果显示在69个样品中检测到PSV-1的序列，阳性率为31.8％。研究还测序分析了USAIA33375毒株与其他报道的PSV-1毒株的同源性为87.8％～83.9％，与亚洲[65]分离的PSV-1毒株同源性最高。在亚洲其他国家，AbeM等在2006年6月至10月期间从日本群马县采集[19]48份野猪粪便，RT-PCR检测显示6份样品为PSV-1阳性。SonKY等通过RT-PCR和巢式PCR测定分析了100份韩国猪的腹泻粪便样品，检测显示34％的腹泻样品为PSV-1阳性，分析VP1基因组序列揭示韩国和其他地方的PSV-1[66]株之间的存在遗传多样性。2017年RayPK等利用RT-PCR技术检测70份印度的临床猪腹泻样品，结果显示有5份样品检测出PSV-1阳性，阳性率为7.14%。并将其中一株印度PSV-1分离株进行全基因组测序，分析显示与英国的PSVV13[17]株同源性最高（为88％）。1.4.2国内PSV-1流行现状2009年，中国分离出第一株猪萨佩罗病毒，随后，中国对PSV-1的流行病学研究工作陆续展开。兰道新等在2009年10月～2010年12月期间，从中国华东部分地区的猪场采集临床健康猪粪便，其中上海市采集350份、江苏省310份、安徽省300份。RT-PCR检测结果显示，各地区阳性率分别为13.1%（46/350）、16.8%（52/310）、22.3%（67/300），总样品阳性率为17.2%。进化分析表明三[68]省的PSV-1基因组同源性较高，差异不大。陈俊伟等在2012年～2013年间，采集中国华南部分地区939份腹泻猪粪便样品，RT-PCR检测结果显示，阳性率为18.21%，其中哺乳仔猪阳性率为9.35%。对比分析VP1基因序列，检测阳性[69]样品之间的同源性为74.5%～88.8%。范忠良等从四川部分地区采集250份临9 湖南农业大学硕士学位论文床健康猪粪便样品，通过RT-PCR检测显示51份为PSV-1阳性样品，阳性率[70]20.4%。2016年11月，YangT等用PK15细胞从湖南省腹泻猪粪便样品成功[15]分离到4株猪萨佩罗病毒。1.5诊断方法1.5.1细胞分离猪肾源细胞系如PK-15、LLC-PK、IBRS-2是分离培养PSV-1的主要细胞系，PSV-1能使猪肾源细胞系出现明显的细胞皱缩、变圆及脱落的病变，易于观察。可取病猪的脑、脊髓、肠道及肠内容物，研磨、高速离心、过滤后接种单层猪肾源细胞系，进行病毒细胞分离培养，观察细胞病变（CPE）。但观察到CPE还不能够确诊，需要结合其他的检测方法如RT-PCR、投射电子显微镜等，因而该方法费事又费力还不能确诊，不适合需快速诊断的临床应用。1.5.2免疫组化免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）能够对组织或细胞内的病原进行定位，也可定量分析。SchockA等使用免疫组织化学和组织病理学检测[53]PSV-1感染猪的脑和脊髓，确认了PSV-1是导致组织病变的病原体。1.5.3反转录PCR反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是通过逆转录酶将单链的RNA逆转录成为互补DNA，以此为模板进行常规PCR扩增目的基因。RT-PCR是临床上检测RNA病毒的一种常见的方法。2002年PalmquistJM等以PSV-1[71]基因组5'的保守区域设计引物，建立了检测PSV-1的通用RT-PCR方法。1.5.4巢式PCR巢式PCR（NestedPCR）是使用两对PCR引物扩增目的片段。第一对引物扩增长目的片段，第二对引物（巢式引物）结合在第一对引物扩增产物的内部，如果第一引物扩增的长片段出现错误，第二次巢式引物扩增的概率极低，具有很高的特异性。因此，巢式PCR常用于RT-PCR检测PSV-1后再次确认结果准确无误的方法。SonKY等为了增加RT-PCR的灵敏度和特异性，设计了对基因特[66]异性检测的第二对引物，进行巢式PCR测定。10 第一章文献综述1.5.5实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是在常规的PCR反应中加入荧光基团，收集荧光信号实时积累的数据，再通过标准曲线对模板进行定量分析。ChenJ等在PSV-1基因组的5'非翻译区（UTR）设计一条MGB探针，建立了检测PSV-1的实时定量PCR检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，可用于[72]PSV-1在组织样品中的定量检测。1.5.6原位杂交技术原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是标记已知的核苷酸分子，检测组织或细胞，经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察，按照碱基互补配对原则，会形成特异性的杂交分子。PHEArruda等通过原位杂交技术在病猪的脊[54]髓神经元和神经根中检测到猪萨佩罗病毒的mRNA。1.6研究目的与意义猪萨佩罗病毒（PorcineSapelovirus，PSV-1)可引起动物机体出现腹泻、肺炎、生殖障碍、非化脓性脑炎和脊髓炎等多系统综合征。该病自20世纪60年代在英国成功分离出第一株PSV-1（V13）以来，已广泛分布于欧洲、美洲和亚洲。近年来，不断有PSV-1引起的猪腹泻和脑脊髓炎的报道，给猪养殖业带来巨大的损失。目前国内对猪病的研究工作重心在传统的几种疾病上，但随着规模化养殖业的发展，引起猪病的病因越来越复杂，在控制传统疾病的同时对研究力度不够的病原开展更多深入的研究工作是十分必要的。目前还没有适合用于调查猪萨佩罗病毒血清流行病学方法的报道，因此很难准确认识到本病在猪群中的流行与感染情况。本研究以实验室分离的猪萨佩罗病毒建立间接免疫荧光（IFA）方法，以及以原核表达的PSVVP1重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，为猪萨佩罗病毒的临床诊断和血清流行病学调查提供了快速、简便的试验方法。11 湖南农业大学硕士学位论文12 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化为了构建PSV-VP1重组质粒并获得目的蛋白，根据GenBank中所公布的PSV-1基因序列和实验室分离毒株的全基因序列，设计VP1蛋白基因的特异性引物，提取实验室分离的猪萨佩罗病毒的总RNA并反转录成cDNA作为PCR的扩增模板，高保真酶扩增目的基因。将PCR扩增的目的基因与质粒pET-28a(+)进行酶切，再利用T4连接酶构建重组质粒pET28-VP1，并将其转入到表达菌BL21(DE3)中进行诱导表达。在温度为37℃时使用终浓度为1mmoL/LIPTG诱导4h，并使用镍柱法纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测显示，重组蛋白以包涵体形式表达。取适量纯化的重组蛋白样品进行Western-blot鉴定，结果表明重组蛋白与PSV-1阳性血清发生特异性反应，具有很好的抗原性，可作为建立检测PSV-1的间接ELISA方法的包被抗原。2.1材料2.1.1病毒和菌株PSV-1病毒由本实验室分离鉴定与保存的PSVHuN1株（GenBank登录号：KX354740）；pET-28a(+)原核表达载体和BL21(DE3)由本实验室保存与提供。2.1.2主要试剂PrimerSTAR高保真聚合酶、PremixTaq酶、NdeⅠ、BamHⅠ、HindШ、XhoⅠ、SaLⅠ等限制性内切酶和T4DNALigase均购买于大连宝生物公司；DM2000plusMarker购于康为世纪公司；蛋白Marker（14kDa-100kDa）购于上海全式金生物科技有限公司；PCR清洁试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购买于美国Omega公司；卡那霉素购买于北京索莱宝科技有限公司；IPTG购买于美国Sigma公司；Ni亲和层析柱购买于德国Novagen公司；BCA定量试剂盒购买于美国Thermo公司；其他试剂购买于国药。2.1.3主要仪器恒温培养摇床SPH-100由上海世平生产；东胜ETC811PCR仪由北京东胜创新生物科技有限公司生产；生物超净工作台BCW-1300A由苏州安泰空气技术有限公司生产；电热恒温培养箱DNP-9162型由上海精宏实验设备有限公司生产；DYY-6C电泳仪由北京市六一仪器厂；Tanon1600R凝胶成像系统由上海天能生物科技有限公司生产；Bio-rad蛋白电泳仪由北京赛百奥科科技有限公司生产；13 湖南农业大学硕士学位论文美国SONICS超声波细胞破碎仪；LegendMicro17台式微量离心机由美国Thermo公司生产；日立高速冷冻离心机CR21由无锡凯派克斯科技有限公司生产；AY220型电子分析天平由日本生产。2.2实验方法2.2.1PSVVP1蛋白基因的获取2.2.1.1PSV-1病毒增殖将本实验室分离到的PSV-1病毒液（PSVHuN1株，GenBank登录号：KX354740）用RPMI1640培养基稀释到200TCID50，加入1mL稀释液到铺满PK15细胞的25T规格细胞培养瓶中，并同时作阴性不接毒对照。放置于37℃含5%CO2浓度的细胞培养箱中，感作1h后弃掉细胞培养瓶中病毒稀释液，再加5mL含2%浓度无支原体小牛血清的RPMI1640培养基，放置37℃5%CO2培养箱中培养，每隔12h用倒置显微镜观察，待PK15细胞出现明显病变后，收集病毒培养液冻存于-80℃冰箱备用。2.2.1.2PSV-1的总RNA提取取200μLPSV-1病毒培养液加入到1.5mL无RNA酶的EP管中。往离心管中加入500μL裂解液，上下振荡摇匀，4℃环境下静置10min后，低温高速离心41min（4℃1.2×10r/pm）。取600μL病毒与裂解混合液加入到离心吸附柱中，4低温高速离心1min（4℃1.2×10r/pm）。倒掉套管里面的穿透液，往离心吸附4柱中加入600μL洗柱液，4℃环境下静置2min后，低温高速离心1min（4℃1.2×104r/pm）。倒掉套管中的液体，空管低温高速离心1min（4℃1.2×10r/pmm）。使用1.5mL无RNA酶离心管替换原套管。加洗脱液40μL至离心吸附柱吸附膜4上，4℃环境下静置2min后，低温高速离心1min（4℃1.2×10r/pm）。弃掉吸附柱，将装有PSV-1总RNA的套管保存于-20℃冰箱备用。2.2.1.3RT-PCR反转录扩增PSV-1将上述2.2.1.2提取的PSV-1总RNA用反转录PCR技术反转录成cDNA。反转录RT-PCR体系如下表2-1所示：14 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化表2-1反转录RT-PCR体系Table2-1TheRT-PCRreactionsystem组份加入体积Water9.0μLBμffer4.0μLdNTP2.0μLRandomprimer1.0μLRNaseInhibitor1.0μLReverseTranscriptase1.0μL总RNA模板2.0μL总体积20.0μL将上述体系混合液在冰盒上配置好后加入到PCR管中，并且迅速转移到PCR仪中，进行反转录PCR。反转录PCR条件为：25℃作用20min；42℃作用45min；72℃作用5min；10℃保存。反转录实验完毕之后尽快进行常规PCR或者将反转录产物cDNA放入-80℃冰箱中保存。2.2.1.4设计PSVVP1蛋白基因引物从GenBank网站上下载已发表的PSVVP1蛋白基因序列，使用BLast网站分析其突变位点，应用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性扩增PSVVP1蛋白基因引物，并在上游引入BamHI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，（下划线字体部分为引入的酶切位点，酶切位点前为加入的三个保护碱基，）。序列引物交由华大基因生物技术有限公司合成。引物序列如下：，，上游引物：fp5-CGCGGATCCGGGGATATAAAAGAAGTGGTGCA-3，，下游引物：rp5-CCCAAGCTTCTATTGAGTTGCAGGGTAATATCT-32.2.1.5PCR扩增PSVVP1目的基因以上述2.2.1.3方法中反转录PCR获得的PSV-1总cDNA作为模板，用高保真酶进行PSVVP1蛋白基因的PCR扩增。PCR体系各成份如下表2-2所示：15 湖南农业大学硕士学位论文表2-2PCR反应体系Table2-2ThePCRreactionsystem组份加入体积5×pfuBuffer10μLdNTP5μL上游引物1μL下游引物1μL高保真pfu酶1μLcDNA模板2μLddwater20μL总体积40μL按照以下PCR反应参数进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性30s；61℃退火40s；72℃延伸40s；35个循环圈数；72℃延伸7min。PCR反应结束后取8μL产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯照射下验证结果。2.2.1.4PCR产物的切胶回收取100μLPCR扩增的产物，用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，验证结果准确后，在紫外灯照射下，将凝胶电泳分离的产物快速用刀片切下，按照美国Omega公司的DNA凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤进行PCR产物的切胶回收。回收产物用30μL洗脱液洗脱，取6μL用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯照射下验证结果，其余回收产物保存于-20℃冰箱备用。2.2.2重组质粒的构建与鉴定2.2.2.1目的基因及载体质粒的酶切将PCR扩增后切胶回收的PSVVP1目的基因和pET-28a(+)载体质粒用BamHⅠ、HindIII进行双酶切，酶切反应体系如下表2-3所示：16 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化表2-3酶切体系Table2-3TheEnzymedigestionsystempET-28a(+)载体目的基因样品24μL24μLBamHI限制内切酶2μL2μLHindIII限制内切酶2μL2μL10×Tbuffer4μL4μL总体积30μL30μL按照上述酶切体系混合液配置好后分别加入到两个PCR管中，短暂快速离心后，放置于37℃温箱中，酶切反应2h。酶切完毕后按照美国Omega公司PCR清洁试剂盒说明书的操作步骤对酶切产物清洁回收。回收产物用30μL洗脱液洗脱，取6μL用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯照射下验证结果，其余回收产物保存于-20℃冰箱备用。2.2.2.2目的基因与pET-28a(+)载体的连接将上述2.2.2.1方法切胶回收的PSVVP1酶切产物与pET-28a(+)载体使用大连宝生物公司的T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系如下：表2-4连接体系Table2-4DNALigationsystem组份加入体积载体酶切产物1μL目的基因酶切产物7μL10×T4连接Buffer1μLT4DNA连接酶1μL总体积10μL将配置好的连接体系混合液加入到PCR管中，短暂快速离心后，放置于16℃水浴锅中，连接反应12h。2.2.2.3感受态细胞的制备采用CaCl2法制备感受态细胞，具体步骤如下：取100μL本实验室保存的大肠杆菌JOM109菌液，加入到装有10mLLB培养基的50mL灭菌试管中。放置于37℃180rpm恒温摇床中，复苏培养菌液12h。取100μL复苏的菌液接种到装有10mLLB培养基的50mL灭菌试管中，放置于37℃180rpm恒温摇床中，培养菌液2.5h（此时细菌处于生长对数期）。将菌液以6000rmp转速离心6min，弃去上清，菌泥用17 湖南农业大学硕士学位论文配置的0.1moL/L浓度的CaCl2溶液轻轻吹打重悬（冰盒上操作），再以6000rmp离心6min，按此方法重悬4次。最后将CaCl2溶液重悬的菌液，放置于冰浴中，2h后即可用于转化。2.2.2.5连接产物的转化冰浴环境下，取100μL上述2.2.2.4方法制备的感受态细胞，再取5μL上述2.2.2.3方法获得连接产物，混合后放置于冰浴中，30min后将混合溶液迅速放置于42℃热冲击90s，再迅速放置于冰浴中2min，无菌环境下往混合液中加入600μLLB培养基，放置于37℃180rmp摇床中培养，45min后将混合液以4000rmp离心4min，弃掉600μL上清，用剩余100μL上清将菌泥轻轻吹打重悬，取100μL重悬后菌液均匀地涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，将平板放置于37℃恒温箱中培养，观察单菌落生长结果。2.2.2.6阳性转化子的鉴定及质粒的提取挑取上述2.2.2.5方法生长的单菌落接种划线于多块含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。此外，将每一次划线后的接种环用PBS缓冲液洗涤，作为PCR鉴定的DNA模板，PCR鉴定引物选用pET-28a(+)载体通用引物作为上游引物，PSVVP1基因特异性引物作为下游引物。挑取PCR鉴定转化成功的单菌落，加入到装有10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基的50mL试管中，放置于37℃180rmp摇床中培养12h，再按照美国Omega公司质粒小量提取试剂盒说明书的操作步骤提取质粒。将试剂盒法提取的质粒取适量送至上海铂尚生物技术有限公司进行基因序列检测鉴定，其余提取产物保存于-80℃冰箱备用。2.2.3重组蛋白的表达2.2.3.1阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞按照上述2.2.2.5的方法将基因序列检测鉴定正确的重组质粒转入CaCl2法制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。2.2.3.2重组蛋白的诱导表达用特异性引物对单菌落进行转化子的PCR鉴定。接种环挑取阳性转化子的单菌落加入到装有10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基的50mL试管中，放置于37℃180rmp摇床中培养12h。将其作为种子液，按1:100的比例取2mL培养的菌液接种到装有200mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基的中，放置于37℃180rmp摇床中培养约3h至菌液浓度OD600达0.6左右，加入终浓度为1mmoL/L18 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化的诱导剂IPTG，放置于37℃180rmp摇床中诱导培养4h。2.2.4重组蛋白的纯化2.2.4.1超声裂解表达菌体上述2.2.3.2方法中重组蛋白诱导结束后，将培养的菌液以5000rpm离心10min，弃掉上清液，用10ml超纯水20倍浓缩吹打重悬菌泥，将其转移到50mL离心管中，放置于冰水混合物上保持低温，并使用超声波裂解仪对菌体进行裂解。裂解完成后将菌液以12000rpm离心5min，分别收集菌液的上清和沉淀，沉淀用10mL超纯水吹打重悬。将上清和沉淀用5×SDS蛋白上样Buffer进行处理，最后取10μL处理的菌液上清、沉淀以及阴性菌对照进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。2.2.4.2镍柱法纯化重组蛋白将成功诱导表达的菌泥吹打重悬后进行超声裂解，12000rpm离心5min后，将沉淀用含8moL/L脲的1×BindBuffer缓冲液吹打重悬，放置于4℃冰箱中溶解2h。用镍离子柱亲和层析法进行重组蛋白的纯化，操作步骤如下：1)选取一干净的10mL层析柱，下端口放入大小合适的垫片，用超纯水洗涤。用移液枪往层析柱中加入1mL的介质His•BindResin，静置，待介质完全沉淀后，打开限速器的开关，使层析柱中液体流出。用超纯水洗涤三次。2)吸取6mL配置好的镍离子溶液于层析柱中，用限速器控制流速，确保镍离子能充分挂柱。3)用10mL含8moL/L脲的1×BindingBuffer平衡层析柱两次。4)将充分溶解的样品以12000rpm离心5min，上清用0.45μm的过滤器过滤。5)将过滤后的样品加入到镍离子层析柱中，用限速器控制流速，收集流穿。6)吸取10mL含8moL/L脲的1×BindingBuffer平衡层析柱。7)依次吸取6mLTris-HCl缓冲体系（PH=8.0）含8moL/L脲的不同浓度50mM、100mM、200mM、500mM咪唑洗涤挂柱的杂蛋白和目的蛋白。8)用1×BindingBuffer和超纯水将层析柱洗涤后，吸取2mL20%乙醇，放置4℃保存层析柱。取适量纯化过程中收集的样品并用5×SDS蛋白上样Buffer进行处理，煮沸瞬时离心后跑SDS-PAGE蛋白电泳。另取适量纯化样品按照美国Thermo公司BSA定量试剂盒说明书的操作步骤，对镍柱法纯化的重组蛋白进行蛋白浓度的测定。剩余纯化样品用50%的甘油放置于-20℃保存。19 湖南农业大学硕士学位论文2.2.5重组蛋白的抗原性鉴定取适量纯化的重组蛋白与空载体阴性对照样品进行Ｗestern-blot鉴定，验证重组蛋白是否与PSV-1阳性血清发生特异性反应。SDS-PAGE蛋白电泳：各取2μL纯化的重组蛋白和空载体全菌与10μL5×SDS蛋白上样Buffer混合，煮沸瞬时离心后进行SDS-PAGE蛋白电泳。样品处理：将SDS-PAGE蛋白电泳完成后的凝胶从玻璃板上取下，用刀片切取下样品和Marker所在区域，浸泡于转膜缓冲液中，准备六张稍大于凝胶的滤纸和一张PVDF膜浸泡于转膜液中。湿转法转膜：按照顺序从下到上放置海绵、三张滤纸、凝胶、PVDF膜、三张滤纸、海绵于转膜夹中，排除每一层中的气泡。将转膜夹放置于转膜电泳槽中，转膜夹下层接通电源后为负极。往电泳槽中加入转膜液，液面最少盖住膜上方。低温环境下启动仪器，220V电压恒流转膜80min。预染色：轻轻取下转膜完成后的PVDF膜，用适量的丽春红染料对PVDF进行预染色，观察样品是否转移到PVDF膜上。样品与阳性血清特异性反应：用PBST缓冲液对PVDF膜进行洗涤，轻轻振荡，洗涤三次，每次洗涤10min。用5%脱脂奶粉4℃封闭12h。PBST洗涤三次，每次洗涤10min。用5%脱脂奶粉将PSV-1阳性血清稀释100倍，加入到PVDF膜上，放置于37℃180rpm摇床中孵育1h。PBST洗涤三次，每次洗涤10min。用5%脱脂奶粉将羊抗猪酶标二抗稀释100倍，加入到PVDF膜上，放置于37℃180rpm摇床中孵育1h。PBST洗涤三次，每次洗涤10min。取适量显色剂于PVDF膜上，曝光观察并拍照。2.3结果2.3.1PSV-1病毒培养将本实验室分离到的PSV-1病毒液用RPMI1640培养基稀释到200TCID50，加入1mL稀释液到铺满PK15细胞的25T规格细胞培养瓶中，并同时作阴性不接毒对照，感作1h后弃掉细胞培养瓶中病毒稀释液，再加细胞维持液，放置37℃5%CO2培养箱中培养，每隔12h用倒置显微镜观察，待PK15细胞出现明显病变后（细胞变圆、皱缩、脱落），收集病毒培养液冻存于-80℃冰箱备用。如下图2-1所示：A图为正常未接毒的PK15细胞，B图为接种了200TCID50PSV-1后72h的PK15细胞。20 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化AB图2-1接毒后PK15细胞形态Fig2-1PK15cellmorphologypost-injectionA：正常PK15细胞B：PK15细胞接种PSV-1后72hCPE2.3.2PSVVP1基因的PCR扩增增殖培养实验室分离到的PSV-1病毒，试剂盒法提取PSV-1病毒液中的总RNA，利用RT-PCR技术反转录成cDNA，并将其作为PCR扩增模板，使用高保真酶进行扩增，取适量扩增产物用1%琼脂糖跑DNA凝胶电泳并在紫外灯下检测并拍照。结果显示PCR扩增得到一条与预期目的片段大小相符的特异性条带，大小约为852bp，如图2-2所示。图2-2PSVVP1基因的PCR扩增Fig2-2AmplificationofPSVVP1genomebyPCR1：阴性对照2：VP1目的基因M：DNAMarker2.3.3重组质粒PET28-VP1的酶切鉴定将构建成功的PET28-VP1的重组质粒用BamHI酶和HindIII酶进行双酶切，21 湖南农业大学硕士学位论文酶切反应后取8μL产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯照射下验证结果。如下图2-3所示，酶切产物大小约为852bp，与插入的目的片段大小相符，表明重组质粒构建成功。图2-3重组质粒双酶切鉴定Fig2-3IdentificationofPET28-VP1weredigestedbyBamHIandHindIII1：阴性对照2、3：PET28-VP1酶切鉴定M：DNAMarker2.3.4重组蛋白的测序结果将构建成功的重组质粒送由上海铂尚生物技术公司进行序列测定，将测序的结果与插入的目的基因进行比对分析，未出现碱基位移。因此确定构建的重组质粒为目的基因与载体重组。重组蛋白的氨基酸序列如下：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGDIKEVVQAHINNTLQSALTTRPQQEQVSNGIMINQGDAPALGAAETGESDTNSGGSTMELQATNCVFSLRETDLEYLMSRYSLMYEDILDYTSSTGRRHLVYNVDFRTIGKSGSDITKFRAFTYWRFDLDVVVMMLEDKASKVSNVMFQVLFTPHGGAVPGTHNTAIWNAPNSTSIYTRVGNAPASFRIPFMSVCNYYTSFYDGDGNFDRNGASYGINPGNFIGTISIRMANDFQTDATTGAFRAKIFLRPVNIEAYMPRPLISYKANGTAREDSSRYYPATQ.2.3.5重组蛋白的诱导表达将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，放置于37℃180rmp摇床中诱导表达，表达后菌液离心，浓缩重悬菌泥，低温下超声波裂解菌体。高速离心后，收集诱导后的上清和沉淀以及诱导前阴性对照全菌，用5×SDS蛋白上样Buffer进行处理，取适量样品进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果显22 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化示表达的重组蛋白主要存在于沉淀中，表明该重组蛋白以包涵体形式表达，如下图2-4所示。图2-4重组蛋白表达产物的电泳结果Fig2-4SDS-PAGEofrecombinantproteinM：蛋白Marker1：诱导前全菌2：诱导后上清3：诱导后沉淀2.3.6重组蛋白的纯化将诱导表达的菌液高速离心后吹打重悬，进行超声裂解，高速离心后，将沉淀用含8moL/L脲的1×BindBuffer缓冲液吹打重悬，4℃溶解。将溶解完全后的样品用镍离子柱亲和层析法进行重组蛋白的纯化，依次用6mLTris-HCl缓冲体系（PH=8.0）含8moL/L脲的不同浓度50mM、100mM、200mM、500mM咪唑洗涤挂柱的杂蛋白和目的蛋白。取适量纯化过程中收集的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳。结果显示用500mM浓度咪唑洗涤液洗脱蛋白时，仅在约40kDa处有一条与目的蛋白大小一样的条带，表明获得了纯度较高的重组蛋白。图2-5重组蛋白纯化产物SDS-PAGE电泳结果Fig2-5SDS-PAGEofthepurifiedrecombinantproteinM：蛋白Marker1：表达沉淀2：流川3：平衡液4：50mM咪唑洗涤5：100mM咪唑洗涤6：200mM咪唑洗涤7：500mM咪唑洗涤23 湖南农业大学硕士学位论文2.3.7重组蛋白的抗原性鉴定结果取适量纯化的重组蛋白与空载体阴性对照样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳后将目的区域利用湿转法转移到PVDF膜上，与猪萨佩罗病毒阳性血清进行反应。结果显示在约40kDa大小的位置上出现了相应的条带，与重组蛋白大小相符，表明重组蛋白与PSV-1阳性血清发生特异性反应，具有很好的抗原性，可作为下一步建立检测PSV-1抗体的间接ELISA方法的包被抗原。图2-6重组蛋白的Western-Blot鉴定Fig2-6thepurifiedrecombinantproteinanalysisbyWestern-Blot1：阴性对照2：纯化的重组蛋白M：蛋白Marker2.4讨论2.4.1目的基因的选择VP1是主要的微小RNA病毒衣壳蛋白，是最外部的病毒蛋白，VP1也是免[73][74,75]疫显性的，并且包含许多主要的中和位点。PSV-1结构蛋白VP1位于PSV-1粒子最外部的表面蛋白。陈俊伟等研究发现，克隆表达的PSVVP1重组[37]蛋白具有很好的反应原性。本研究以PSV-1的VP1蛋白基因作为目的基因插入pET-28a(+)载体构建重组质粒。2.4.2表达系统的选择真核表达系统可以将表达的重组蛋白磷酸化等加工修饰，但其表达的产量通常不高，且生产成本和工艺要求也比较高。原核表达系统遗传知识背景清楚，表达工艺相对简单，易于控制，且培养周期短适合于目的蛋白的规模生产。本研究24 第二章PSV-VP1蛋白的原核表达及纯化选择的pET-28a(+)载体，含有一个His标签蛋白，有利于重组蛋白的分离和纯化。2.4.3目的蛋白的纯化包涵体形式表达的蛋白不需要再经过蛋白复性等工艺，可直接用于诊断试剂的包被抗原。本研究的重组蛋白在37℃环境下诱导为包涵体形式表达，将表达的菌体经过大肠杆菌裂解液后进行超声裂解，经过几次重悬和12000rpm高速离心以及过滤，最后用强变性剂8mol/L的脲，打断包涵体蛋白内部的蛋白分子结构链接化学键，使蛋白的多肽伸展，从而使不溶的包涵体蛋白变溶解，利于后续的镍柱纯化。2.4.4重组蛋白的抗原性纯化的重组蛋白经SDSPAGE蛋白电泳，进行Ｗesternblot验证，PSV-1的阳性血清作一抗，IgG羊抗猪作二抗，显色反应后，在目的蛋白条带处出现特异性显色，证明重组蛋白具有很好的PSV-1特异性和抗原性，可作为检测PSV-1抗体的间接ELISA方法的包被抗原。2.5小结1)本研究利用PCR扩增出目的基因VP1，并将基因导入pET-28a(+)载体中，成功构建了重组质粒PET-VP1。2)重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功以包涵体形式表达，并用镍柱纯化法获得重组蛋白。3)Westernblot试验表明纯化的重组蛋白具有很好的特异性和反应原性，可作为间接ELISA方法的包被抗原。25 湖南农业大学硕士学位论文26 第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立猪萨佩罗病毒只有一个血清型，家猪和野猪均可感染，且感染猪只康复后依然会继续排毒，成为重要的病毒传染源，因此在饲养的猪群中感染率很高。PSV-1可引起猪脑脊髓灰质炎、肺炎、繁殖障碍、心包炎、心肌炎、皮肤损伤、腹泻等多系统综合征，同时也可出现无明显特征的亚临床症状。但无论其以何种形式存在，都对养猪业具有潜在的危害。本研究以实验室分离的猪萨佩罗病毒PSVHuN1/2016株感染PK15细胞制备抗原板，建立了检测猪血清中PSV-1抗体的间接免疫荧光（IFA）方法，工作浓度分别为：一抗最佳稀释浓度为1:300；FITC标记的羊抗猪荧光二抗最佳稀释浓度为1:300。该方法特异性强，敏感度高，既能将PSV-1抗体与PRRSV、FMDV、PCV-2、CSFV抗体区分开，也可以检测到0.128中和效价的阳性血清。旨在为猪萨佩罗病毒的血清流行病学调查提供一种高敏感度和高特异性的参考检测方法。3.1材料3.1.1细胞、病毒和血清PSVHuN1/2016分离株（GenBank登录号：KX354740）、PK15细胞由湖南农业大学动物医学院动物微生物免疫实验室分离与保存；PSV-1阴性血清由本实验室分离的健康猪血清；PSV-1阳性血清由本实验室对PSV-1病毒感染阳性猪进行采集分离的血清；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和猪瘟病毒（CSFV）抗体由本实验室制备与保存；阴阳性血清都由本实验室用中和实验再次验证；临床血清样品：采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳地区的6个规模化猪场。3.1.2主要试剂羊抗猪IgG荧光二抗（FITC-IgG）为KPL公司产品；胰酶、1640RPMI培养基为Gibco公司产品；青霉素、卡那霉素、多聚甲醛、伊文思蓝和无荧光甘油为国产。27 湖南农业大学硕士学位论文3.1.3主要仪器CO2恒温培养箱由美国NuAire公司生产；细胞计数仪由联想生物科技公司生产；AE31型倒置显微镜由Motic公司生产；BX51型荧光显微镜由Olympus公司生产。3.2方法3.2.1间接免疫荧光方法的基本操作步骤1)封闭：将已固定的细胞抗原板用200μL/孔PBS缓冲液洗涤一次，轻轻拍打，弃掉洗涤液，每孔加入100μL封闭液，封口袋密封，37℃封闭2h。2)样品孵育：甩掉封闭液，用特定血清稀释液稀释血清样品，往抗原板中每孔加入100μL，用封口袋密封好，最佳孵育条件孵育血清样品。3)洗涤：甩掉抗原板孔中液体，每孔加200μLPBST缓冲液，轻轻拍打，洗涤三次，每次5min。4)二抗孵育：用5%脱脂奶粉将羊抗猪IgG荧光二抗以最佳稀释倍数稀释，往抗原板中每孔加入100μL，用封口袋密封好，37℃温箱作用30min。5)洗涤：甩掉抗原板孔中液体，每孔加200μLPBST缓冲液，轻轻拍打，洗涤三次，每次5min。6)染色：PBS缓冲液将伊文思蓝稀释成0.01%伊文思蓝水溶液，往抗原板中每孔加入50μL，室温下染色20s。7)洗涤：甩掉抗原板孔中液体，每孔加200μLPBST缓冲液，轻轻拍打，洗涤三次，每次5min。8)封底：往抗原板中每孔加入30μL无荧光甘油。9)观察：将抗原板倒置，荧光显微镜观察。3.2.2制备细胞抗原板3.2.2.1PK15细胞培养用含8%FBS1640细胞生长液在细胞培养瓶中培养PK15细胞，选择生长状态良好的细胞，弃掉旧培养液，用PBS缓冲液洗涤两次，再用0.1%胰酶将细胞消化成单个细胞。用细胞生长液稀释细胞，调整细胞密度，用细胞密度测定仪测5定细胞密度，调整细胞密度到2.0×10CFU/mL。再将已调整好密度的细胞液以100μL/孔加入到96孔板中，放置37℃5%CO2培养箱中培养。3.2.2.2PSV-1病毒接种细胞28 第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立将3.2.2.1培养18h的96孔板PK15细胞，弃掉其旧培养液，用PBS缓冲液将细胞洗涤两次，用无血清RPMI1640培养基将PSVHuN1/2016株稀释到1000TCID50/100μL，再将100μL/孔稀释好的病毒液接种到单层的PK15细胞培养孔，同时设未接毒细胞对照，放置于37℃5%CO2培养箱中。感作1h后弃掉细胞培养瓶中病毒稀释液，再加2%无支原体小牛血清的RPMI1640培养基，放置37℃5%CO2培养箱中培养。3.2.2.3固定细胞每隔12h，倒置显微镜观察上述3.2.2.2接种PSV-1病毒的PK15细胞的病变情况，当96孔板孔内细胞出现约20%病变，取接种的细胞培养板，弃去旧培养液，用200μL/孔PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤5min，轻轻拍打去掉孔内液体后用4%多聚甲醛室温固定20min，弃掉固定液，用200μL/孔PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤5min，轻轻拍打，放置于37℃温箱干燥2h，干燥后放置于-20℃冰箱保存备用。3.2.3间接免疫荧光方法的条件优化3.2.3.1病毒培养时间的确定选择生长状态良好的PK15细胞，用PBS缓冲液洗涤，用0.1%胰酶将细胞消化成单个细胞。用细胞生长液稀释调整细胞密度，培养18h后，将稀释好的病毒混合液接种到单层的PK15细胞培养孔，同时设未接毒细胞对照。在接种病毒培养12h、24h、36h后分别取96孔细胞培养板，PBS洗涤两次，用4%多聚甲醛固定，PBS缓冲液洗涤三次后，37℃温箱干燥2h，间接免疫荧光法的操作步骤检测参考阴阳性血清，根据细胞状态的好坏和病毒增殖量确定最佳病毒培养时间。3.2.3.2封闭液的选择将上述3.2.1方法制备的抗原板，用200μL/孔PBS缓冲液洗涤一次，轻轻拍打，弃掉洗涤液，每孔加入100μLPBST稀释的5%山羊血清、5%脱脂奶粉、10%山羊血清和1%BSA溶液，封口袋密封，放置于37℃温箱，封闭2h。按照3.2.1的间接免疫荧光法的操作步骤检测参考阴阳性血清，根据尽量减少检测中的非特异性荧光干扰确定最佳封闭液。3.2.3.3血清孵育条件的确定以确定的最优条件制备的抗原板，用200μL/孔PBS缓冲液洗涤一次，轻轻拍打，弃掉洗涤液，使用确定的最佳封闭液，向抗原板每孔加入110μL封闭液，29 湖南农业大学硕士学位论文封口袋密封，放置于37℃温箱，封闭2h。选择中和试验确定的两份参考阴阳性血清，按照3.2.1的间接免疫荧光法的操作步骤检测参考阴阳性血清，孵育条件设置对比分别为4℃孵育12h、37℃孵育1h、37℃孵育2h，根据尽量减少检测中的非特异性荧光干扰确定最佳血清孵育条件。3.2.3.4最佳血清稀释倍数与荧光二抗浓度的确定采用方阵法确定最佳血清稀释倍数与荧光二抗浓度，选择中和试验验证过的两份阳性血清和两份阴性血清，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液将阳性和阴性血清按1:100、1:200、1:300、1:400稀释，荧光二抗按1:100、1:200、1:300、1:400浓度稀释，按照3.2.1的间接免疫荧光方法的操作步骤进行检测，根据倒置荧光显微镜观察，在荧光显微镜下，阳性血清孔可见细胞浆内和膜上有绿色荧光染色，阴性血清孔没有非特异性荧光染料附着且在伊文思蓝染色下呈红色，以此为标准，判定被检测的血清。3.2.4特异性试验以建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法，选择PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、FMDV（口蹄疫病毒）、PCV-2（猪圆环2型病毒）和CSFV（猪瘟病毒）抗体进行交叉性实验，确定抗原板的特异性。3.2.5敏感度试验以建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法，将PSV-1参考阳性血清（中和效价为1:128）依次做1:10、1:100、1:1000的10倍梯度稀释，进行间接免疫荧光敏感度试验，测定方法的敏感度。3.2.6应用建立的IFA方法检测临床血清以建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法对采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳地区的6个规模化猪场的208份血清样品进行检测。初步调查猪萨佩罗病毒在湖南省的血清流行病学。3.3结果3.3.1病毒培养时间的确定分别对接种病毒后培养12h、24h、36h的细胞使用4%多聚甲醛固定，制作抗原板，进行间接免疫荧光试验，结果显示：接种培养12h抗原板的病毒量未达到免疫荧光要求，接种培养24h病毒已经在细胞中大量增殖且细胞破裂死亡的数30 第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立量非常少。而接种培养36h，由于病毒增殖使大部分细胞破裂死亡，病毒抗原从细胞中释放到培养液中，使用多聚甲醛固定时，细胞数量少，细胞间空隙大，影响了间接免疫荧光效果。因此从免疫荧光效果以及节省时间考虑，接种PSV-1培养24h后用4%多聚甲醛固定是制备间接免疫荧光抗原板的最佳条件。3.3.2封闭液的选择将制备的抗原板，用200μL/孔PBS缓冲液洗涤一次，轻轻拍打，弃掉洗涤液，每孔加入100μLPBST稀释的5%山羊血清、5%脱脂奶粉、10%山羊血清和1%BSA溶液，封口袋密封，放置于37℃温箱，封闭2h。间接免疫荧光法检测参考阴阳性血清，根据尽量减少检测中的非特异性荧光干扰确定最佳封闭液。从检测结果对比的效果来看，10%山羊血清的封闭效果，非特异性荧光干扰最少，因此10%山羊血清为最佳封闭液。3.3.3血清孵育条件的确定以确定的最优条件制备抗原板和封闭，选择中和试验确定的两份参考阴阳性血清，按照3.2.1的间接免疫荧光法的操作步骤检测参考阴阳性血清，孵育条件设置对比分别为4℃孵育12h、37℃孵育1h、37℃孵育2h，根据尽量减少检测中的非特异性荧光干扰确定最佳血清孵育条件。从检测结果对比的效果来看，4℃孵育12h非特异性荧光干扰最少，特异性荧光更强，因此确定血清孵育条件为4℃孵育12h3.3.4血清和荧光二抗最佳稀释度的确定用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液将阳性和阴性血清按1:100、1:200、1:300、1:400稀释，荧光二抗按1:100、1:200、1:300、1:400稀释，根据方阵试验结果确定，血清最佳稀释度为1:300，荧光二抗最佳稀释度为1:300，在荧光显微镜下，阳性血清孔可见细胞浆内和膜上有绿色荧光染色（图3-1A），阴性血清孔没有非特异性荧光染料附着且在伊文思蓝染色下呈红色（图3-1B），以此为标准，判定被检测的血清。31 湖南农业大学硕士学位论文AB图3-1PSV-1间接免疫荧光法检测血清的阴阳性结果（20×10）Fig3-1DetectionsofantibodiesagainstofPSV-1byIFA（20×10）A：阳性结果B：阴性结果3.3.5特异性试验结果以建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法，用PRRSV、FMDV、PCV-2和CSFV抗体进行交叉性实验，确定抗原板的特异性。结果显示：四种参考阳性血清检测孔均未见任何特异性荧光，结果为阴性，与检测PSV-1的抗原板无交叉性，表明建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光检测方法具有很好的特异性。3.3.6敏感度试验结果将PSV-1阳性血清（SN效价为1:128）依次做1:10、1:100、1:1000的10倍梯度稀释，进行间接免疫荧光敏感度试验。结果显示：当阳性血清稀释到1:1000时，血清检测孔仍然有特异性荧光，表明该方法可以检测到0.128SN效价的阳性血清。3.3.7应用建立的IFA方法检测临床血清结果应用该方法对湖南省6个规模化猪场208份临床血清样品进行检测，结果显示6个规模化猪场都检测出阳性样品，猪场阳性率100%，总样品中有142份样品为阳性，样品总阳性率68%，表明PSV-1在湖南省流行普遍。如下表3-1所示，6个规模化猪场不同阶段的血清样品检测结果。32 第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立表3-1不同阶段猪血清的检测结果Table3-1Detectionofserumfrompigsofdifferentages不同阶段猪血清血清样品来源样品数量PSV-1阳性数阳性率A场800%B场800%C场88100%哺乳仔猪D场8225%E场8338%F场800%A场8675%B场8675%C场8225%保育猪D场8788%E场88100%F场8338%A场8675%B场161594%C场88100%育肥猪D场8788%E场8788%F场8788%A场8788%C场8788%母猪D场241979%E场8788%F场8788%总计六场20814268%3.4讨论3.4.1间接免疫荧光方法的选择对PSV的检测目前主要以RT-PCR等病原检测方法为主，但是，RT-PCR检测容易出现假阳性，且组织中病毒含量低时用PCR也难以检测出结果，检测结果可能会低于实际的感染率。此外，PCR作为病原检测方法，也不适于曾经33 湖南农业大学硕士学位论文感染但病毒在猪体内已消失的调查，而针对抗体检测的免疫荧光方法可有效解决这一问题，有利于更加全面和系统地了解PSV的流行情况。3.4.2减少非特异性干扰在建立检测PSV-1抗体的间接免疫荧光方法的过程中，我们发现，将本实验室制备的参考阳性血清梯度稀释到1000倍时仍然能够检测到特异性荧光，证明了本研究建立的方法具有高敏感度。但将弱阳性血清400倍稀释时检测结果与阴性结果相差不大，而当血清稀释倍数小于200倍时，部分检测血清存在着一定[13]程度的非特异性荧光干扰，推测这可能与猪血清非特异性吸附有关，因此在临床大批量血清检测时血清最佳稀释倍数为300倍。在减少非特异性荧光干扰试验中，我们发现，用10%山羊血清作为封闭液比5%脱脂奶粉封闭液效果要好，推测这与我们使用的二抗羊抗猪来源同系的非免疫血清封闭有关。我们还发现血清孵育温度条件4℃过夜比37℃要好，推测可能在4℃条件更能保持抗体活性。此外，本研究建立的检测PSV-1抗体的间接免疫荧光方法与PRRSV、FMDV、PCV-2和CSFV抗体无交叉反应，具有很好的特异性。3.4.3应用建立的方法检测临床血清应用建立的检测方法对湖南省6个规模化猪场的204份临床血清样品进行检测，结果显示有142份样品为阳性，样品总阳性率为68%，表明PSV-1在湖南省非常普遍。进一步分析不同规模场不同年龄阶段猪群PSV-1抗体情况，PSV-1的血清抗体规律大致分为两种情况，一种如C场，哺乳仔猪群检测全阳性，而保育猪群检测阳性率相比较哺乳仔猪群降低，育肥猪阳性值升高。另外一种情况哺乳仔猪群检测阳性率低，从保育猪开始阳性率升高，育肥猪和母猪阳性率居高不下，依此可以推测PSV-1的感染规律：当哺乳仔猪群有母源抗体保护，断奶后随着母源抗体消退，抗体保护力减弱，保育阶段猪群出现PSV-1感染。而当哺乳仔猪群未获得母源抗体，断奶后因为饲养管理变差，保育阶段猪群感染PSV-1的压力增大。此外，育肥阶段和母猪阶段抗体阳性率居高不下，表明PSV-1抗体在猪体内继续时间比较长。3.5小结1)本研究以实验室分离的猪萨佩罗病毒PSVHuN1/2016株感染PK15细胞制备抗原板，建立了检测猪血清中PSV-1抗体的间接免疫荧光（IFA）方法，工34 第三章猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立作浓度分别为：一抗最佳稀释浓度为1:300；FITC标记的羊抗猪荧光二抗最佳稀释浓度为1:300。2)该方法特异性强，敏感度高，既能将PSV-1抗体与PRRSV、FMDV、PCV-2、CSFV抗体区分开，也可以检测到0.128中和效价的阳性血清。为以后的PSV-1的血清流行病学研究提供了一种高敏感度和高特异性的检测参考方法。3)应用该方法对湖南省部分规模化猪场208份临床血清样品进行检测，结果显示样品总阳性率为68%，表明PSV-1在湖南省流行普遍。35 湖南农业大学硕士学位论文36 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用猪萨佩罗病毒可引起动物机体出现腹泻、肺炎、生殖障碍、非化脓性脑炎和脊髓炎等多系统综合征，全世界多个国家和地区都有报道，且家养猪和野猪均可感染。但目前还没有一种适合于临床血清检测PSV-1的快速、简便的方法。因此，本研究以原核表达的PSVVP1重组蛋白为包被抗原，建立了检测猪血清中PSV-1抗体的间接ELISA方法，旨在为PSV-1的临床诊断、血清学流行病学调查提供一种快速、简便、准确的检测方法。4.1材料4.1.1病毒和血清PSVHuN1/2016分离株、PK15细胞、PSV-1阴阳性血清由湖南农业大学动物医学院动物微生物免疫实验室分离与保存。400份临床血清样品采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳地区的5个规模化猪场。4.1.2主要试剂96孔酶标板购自美国Costar公司；酶标二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG购自Bethyl公司；底物（TMB）购自KPL公司；其余试剂均为国产分析纯。4.1.3主要仪器自动包被仪由ThermoFisher公司生产；恒温培养箱由上海精宏公司生产；自动洗板机由ThermoFisher公司生产；FC型酶标仪由ThermoFisher公司生产。4.2方法4.2.1重组PSVVP1蛋白的间接ELISA方法的建立与条件优化4.2.1.1间接ELISA方法的基本操作步骤（1）包被：将镍柱法纯化的PSVVP1重组蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液进行倍数稀释，以100μL/孔加入到96孔酶标板中，用封口袋密封，4℃放置24h。（2）封闭：甩掉酶标板中液体，轻轻拍干，配置封闭液，以100μL/孔加入到96孔酶标板中，封口袋密封，放置于37℃温箱中封闭30min。（3）干燥：甩掉酶标板中液体，轻轻拍干，将酶标板放置于37℃温箱中，干燥2h。37 湖南农业大学硕士学位论文（4）样品孵育：用本实验室的样品稀释液将血清样品在稀释板上先按照最佳稀释倍数稀释，再以100μL/孔加入到制备好的抗原板上，37℃孵育，作用时间为确定的最佳孵育时间。（5）洗涤：甩掉抗原板中液体，用250μL/孔PBST缓冲液洗涤，洗涤3次，洗涤完后轻轻拍干。（6）二抗孵育：每孔加入100μL最佳稀释倍数的用HRP标记的羊抗猪酶标二抗，37℃孵育，时间为确定的最佳二抗作用时间。（7）洗涤：甩掉抗原板中液体，用250μL/孔PBST缓冲液洗涤，洗涤3次，洗涤完后轻轻拍干。（8）底物作用：每孔加入50μL底物，37℃避光显色，时间为确定的最佳作用时间。（9）反应终止：每孔加入50μL配置的H2SO4溶液，用450nm测定吸光度，并计算S/P值。4.2.1.2最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定采用方阵法摸索抗原的最佳包被浓度与血清的最佳稀释倍数，将镍柱法纯化的VP1重组蛋白用考马斯亮蓝试剂盒测定纯化获得的蛋白浓度，用碳酸盐缓冲包被液将纯化的重组蛋白稀释20、40、80、160倍，稀释成不同浓度（10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL），再将稀释好的重组蛋白以100μL/孔分别加入到96孔酶标板中，装入封口袋，放置于4℃冰箱包被24h。弃掉包被液，用250μL/孔PBST洗涤3次，加100μL/孔封闭液，放置于37℃温箱，封闭30min，弃掉封闭液，将抗原板放置于37℃温箱干燥2h。取4份阳性血清和3份阴性血清，用血清稀释液将7份血清分别稀释50、100、200倍，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定最佳抗原包被浓度与血清最佳稀释倍数。4.2.1.3血清最佳孵育时间的确定根据上述4.2.1.2的方法确定的最佳抗原包被浓度制备ELISA抗原板，4℃包被24h，37℃封闭30min，37℃干燥2h，再选择4份阳性血清和3份阴性血清，按照上述4.2.1.2的方法确定的最佳血清稀释倍数稀释血清，在37℃环境下分别孵育时间为：20min、30min、45min、1h，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平38 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定血清的最佳孵育时间。4.2.1.4最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间的确定采用方阵法确定最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间，根据上述4.2.1.2的方法确定的最佳抗原包被浓度制备ELISA抗原板，4℃包被24h，37℃封闭30min，37℃干燥2h，再选择4份阳性血清和3份阴性血清，按照上述4.2.1.2的方法确定的最佳血清稀释倍数稀释血清，将稀释好的血清加入到抗原板中，按照4.2.1.3确定的最佳孵育时间孵育血清，洗涤后分别加100μL/孔1/5000、1/6000、1/9000、1/12000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗，放置于37℃环境中，不同浓度的酶标二抗作用时间为30min、45min、60min，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间。4.2.1.5最佳底物作用时间的确定根据上述试验确定的最佳条件制备抗原板，选择4份阳性血清和3份阴性血清以最佳血清稀释倍数稀释，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，在37℃避光环境下，底物显色作用的时间分别为：10min、15min、20min、25min，加终止液终止反应，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定底物显色的最佳作用时间。4.2.2特异性试验4.2.2.1交叉性试验以建立的猪萨佩罗病毒的间接ELISA检测方法，对CSFV（猪瘟）、PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征）、FMDV（猪口蹄疫）、PCV-2（猪圆环2型）的阳性参考血清进行交叉性实验，同时设置PSV-1的标准阳性血清和标准阴性血清对照，确定重组蛋白制备的抗原板是否与猪的其他常见的疾病具有交叉反应。4.2.3敏感度试验选择2份标准强阳性血清和2份标准弱阳性血清，将血清按照100、200、400、800、1600、3200、6400倍稀释，以建立的猪萨佩罗病毒的间接ELISA检测方法对稀释的血清进行检测，确定间接ELISA方法的敏感度。39 湖南农业大学硕士学位论文4.2.4重复性试验4.2.4.1批内重复性试验以最佳抗原包被浓度制备一批抗原板，随机选择这批抗原板中的4块抗原板中的各其中一条抗原板条，按照优化的最佳ELISA条件，对4份阳性血清和3份阴性血清进行检测，计算板条间的变异系数（变异系数CV=标准偏差SD÷平均值X），确定建立的间接ELISA方法的批内稳定性。4.2.4.2批间重复性试验随机选择不同时间段以最佳抗原包被浓度制备的5批抗原板中的各其中一条抗原板条，按照优化的最佳ELISA条件，对4份阳性血清和3份阴性血清进行检测，计算板条间的变异系数（变异系数CV=标准偏差SD÷平均值X），确定建立的间接ELISA方法的批间稳定性。4.2.5阴阳性临界值的确定以所建立的间接免疫荧光方法检测56份背景较为清楚的阴性血清样品，计算其平均S/P值{S/P值=（样品检测OD450nm值－参考阴性血清OD450nm值）÷（参考阳性血清OD450nm值－参考阴性血清OD450nm值）}和标准偏差SD值，根据公式阴、阳性样品临界值=平均S/P值+2×SD值/3×SD值，得出阴阳性血清样品检测的临界判定值。4.2.6PSV-1间接ELISA检测方法和IFA检测方法检测血清对比以建立的猪萨佩罗病毒间接ELISA检测方法和猪萨佩罗病毒间接免疫荧光检测方法对采自六个规模化猪场的204份血清样品进行检测，对比两种方法的符合率。4.2.7应用建立的PSV-1间接ELISA检测方法检测临床血清以建立的猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法对采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳地区的5个规模化猪场的不同周龄阶段，每个阶段随机挑选8份样品，总共400份血清样品进行检测，初步调查猪萨佩罗病毒在不同周龄阶段猪中的血清学流行规律。4.3结果4.3.1最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定采用方阵法摸索抗原的最佳包被浓度与血清的最佳稀释倍数，将镍柱法纯化40 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用的VP1重组蛋白用考马斯亮蓝试剂盒测定纯化获得的蛋白浓度，用碳酸盐缓冲包被液将纯化的重组蛋白稀释20、40、80、160倍，稀释成不同浓度（10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL）制成抗原检测板，取4份阳性血清和3份阴性血清，用血清稀释液将7份血清分别稀释50、100、200倍，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定最佳抗原包被浓度与血清最佳稀释倍数。根据ELISA检测结果显示（见表4-1）当抗原包被浓度为2.5μg/mL，血清稀释倍数为100倍时平均P/N值最高（为10.242），因此确定最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL，最佳血清稀释倍数为100倍。表4-1最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定Table4-1Determinationoftheoptimalantigenpackageandserumdilutionfactor抗原包被浓度10μg/mL5.0μg/mL2.5μg/mL1.25μg/mL血清稀释倍数50100200501002005010020050100200P12.9122.3361.8002.9402.2751.7142.6142.1411.4142.1321.6221.270P21.7471.0420.6231.6420.9970.6191.4890.9720.5771.3430.8400.546P31.1910.6140.3601.0630.5900.3470.9980.5740.3380.8550.5030.326P40.8780.3740.2040.5910.3210.1670.4650.2460.1380.3180.1860.115N10.5490.2750.1620.3420.2150.1180.2240.1280.0910.1660.1030.074N20.3570.1730.1060.2250.1660.0830.1420.0840.0660.1110.0850.061N30.2450.1350.0900.1780.1730.0790.1050.0760.0610.0810.0670.059平均P/N值4.3845.6176.2586.2785.6637.6268.86310.2428.4879.7379.2688.7264.3.2血清样品最佳孵育时间的确定根据确定的最佳抗原包被浓度制备ELISA抗原板，选择4份阳性血清和3份阴性血清，最佳血清稀释倍数稀释血清，在37℃环境下分别孵育时间为：20min、30min、45min、1h，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定血清的最佳孵育时间。结果显示（见表4-2）当血清在37℃度孵育30min的平均P/N值最高（为11.076），因此确定血清的最佳孵育时间为30min。41 湖南农业大学硕士学位论文表4-2最佳血清孵育时间的确定Table4-2Determinationoftheserumincubationtime血清孵育时间样品编号20min30min45min60minP11.9802.2012.5542.624P21.0761.2141.6441.690P30.6920.7651.0881.160P40.2380.2800.4010.433P值平均0.9971.1151.4221.477N10.1280.1380.2060.235N20.0760.0880.1180.129N30.0670.0760.0900.102N值平均0.0900.1010.1380.155平均P/N值11.03111.07610.3039.507图4-1血清最佳孵育时间的确定Fig4-1Determinationoftheserumincubationtime4.3.3最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间的确定采用方阵法确定最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间，根据最佳抗原包被浓度制备ELISA抗原板，选择4份阳性血清和3份阴性血清，最佳血清稀释倍数稀释血清，最佳孵育时间孵育血清，洗涤后分别加100μL/孔以1/5000、1/6000、1/9000、1/12000倍稀释的HRP标记的羊抗猪酶标二抗，放置于37℃环境中，不42 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用同浓度的酶标二抗作用时间为30min、45min、60min，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定最佳酶标二抗浓度与作用时间。结果显示（见表4-3）当酶标二抗稀释倍数为6000倍，作用时间为30min时，平均P/N值最高（为11.09），因此确定酶标二抗最佳稀释倍数为6000倍，作用时间为30min。表4-3最佳酶标二抗稀释倍数与作用时间的确定Table4-3Determinationoftheoptimaldilutionfactoranddurationofaction二抗作用时间30min45min60min二抗稀释倍数500060009000120005000600090001200050006000900012000P12.4102.2441.5201.0252.9832.8111.9621.4973.2413.1002.3261.711P21.4311.2660.8000.5491.8311.6230.9600.7642.1311.9691.3240.941P30.8120.7770.4800.3121.1251.0260.6330.4641.4511.2960.8390.568P40.4020.2970.1950.1350.5100.3920.2520.1840.7210.5390.3420.225P值平均1.2641.1460.7490.5051.6121.4630.9520.7271.8861.7261.2080.861N10.1820.1450.1010.0760.2230.1940.1300.0960.2610.2490.1600.118N20.1140.0930.0700.0570.1290.1170.0870.0680.1590.1510.1080.080N30.0810.0720.0590.0500.0930.0890.0690.0580.1120.1040.0790.064N值平均0.1260.1030.0770.0610.1480.1330.0950.0740.1770.1680.1160.087平均P/N值10.0611.099.778.2810.8710.979.989.8310.6410.2710.449.864.3.4底物最佳作用时间的确定根据最佳条件制备抗原板，选择4份阳性血清和3份阴性血清以最佳血清稀释倍数稀释，按照4.2.2.1的ELISA操作步骤进行检测，在37℃避光环境下，底物显色作用的时间分别为：10min、15min、20min、25min，加H2SO4溶液终止反应，结果用OD450nm值读数，计算平均P/N值（P值为4份阳性血清检测平均值，N值为3份阴性血清检测平均值），根据平均P/N值的高低确定底物显色的最佳作用时间。结果显示（见表4-4）当底物避光作用20min时平均P/N值最高（为11.911），因此确定最佳底物作用时间为20min。43 湖南农业大学硕士学位论文表4-4底物最佳作用时间的确定Table4-4Determinationofsubstrateactiontime底物作用时间样品编号10min15min20min25minP11.9582.0492.2022.247P21.0931.1131.2721.334P30.6390.7410.7710.764P40.2310.3060.2970.303P值平均0.9801.0521.1361.162N10.1140.1340.1310.14N20.0740.0860.0870.092N30.0620.0690.0680.072N值平均0.0830.0960.0950.101平均P/N值11.76310.92311.91111.467图4-2最佳底物作用时间的确定Fig4-2Determinationofsubstrateactiontime4.3.5重复性试验4.3.5.1批内重复以最佳抗原包被浓度制备一批抗原板，随机选择这批抗原板中的4块抗原板中的各其中一条抗原板条，按照优化的最佳ELISA条件，对4份阳性血清和3份阴性血清进行检测，计算板条间的变异系数（变异系数CV=标准偏差SD÷平均值X）。结果显示（见表4-5）4块板条检测同样7份标准血清，计算结果44 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用的变异系数，最低为1.62%，最高为7.01%，均小于10%，表明本研究建立的检测猪萨佩罗病毒的间接ELISA方法的抗原板具有很好的批内稳定性。表4-5抗原板的批内变异系数Table4-5Theintra-assaycoefficientofvariationoftheantigenplate重复孔平均值标准偏差变异系数样品编号板条1板条2板条3板条4（X）（SD）（CV）P12.2402.2152.2022.1552.2030.0361.62%P21.3071.2141.2391.2161.2440.0443.50%P30.8250.7750.7630.7750.7850.0283.52%P40.3000.2890.2900.3060.2960.0082.76%N10.1440.1380.1370.1450.1410.0042.90%N20.0920.0880.1030.0910.0940.0077.01%N30.0740.0760.0730.0750.0750.0011.73%4.3.5.2批间重复随机选择不同时间段以最佳抗原包被浓度制备的5批抗原板中的各其中一条抗原板条，按照优化的最佳ELISA条件，对4份阳性血清和3份阴性血清进行检测，计算板条间的变异系数（变异系数CV=标准偏差SD÷平均值X）。结果显示：4块板条检测同样7份标准血清，计算结果（见表4-6）的变异系数，最低为3.30%，最高为6.45%，均小于10%。表明本研究建立的检测猪萨佩罗病毒的间接ELISA方法的抗原板具有很好的批间稳定性。表4-6抗原板的批间变异系数Table4-6Theinterassaycoefficientofvariationoftheantigenplate批次号平均值标准偏差变异系数样品编号抗原板1抗原板2抗原板3抗原板4抗原板5（X）（SD）（CV）P12.1092.1912.2342.2682.2962.2200.0733.30%P21.1601.2261.2631.3131.2441.2410.0564.50%P30.7320.7190.7810.7400.8040.7550.0364.74%P40.2720.2890.2950.2970.2910.2890.0103.43%N10.1340.1360.1390.1570.1410.1410.0096.45%N20.0890.0860.0900.0980.0910.0910.0044.89%N30.0690.0660.0700.0760.0710.0700.0045.18%45 湖南农业大学硕士学位论文4.3.6阴阳性临界值的确定以所建立的间接ELISA方法检测56份背景清楚的阴性血清样品（间接免疫荧光方法同时检测皆判定为阴性），表4-7为56份血清的S/P值{S/P值=（样品检测OD450nm值-参考阴性血清OD450nm值）÷（参考阳性血清OD450nm值-参考阴性血清OD450nm值）}，计算其平均S/P值结果为0.103，标准偏差（SD）值为0.044，根据公式阴阳性样品临界值Cp=0.103+3×0.044=0.235，Cn=0.103+2×0.044=0.191。即当样品检测S/P值≥0.235判定为阳性，S/P值≤0.191值为阴性，介于两者之间为可疑。表4-756份背景清楚的阴性血清S/P值结果Table4-7TheresultsofS/Pvaluesof56negativesera56份阴性血清S/P值0.150.120.100.050.130.150.090.090.120.120.140.160.130.150.140.170.060.170.090.070.110.120.130.050.070.040.040.040.160.150.140.170.060.170.090.070.110.120.130.050.070.040.180.040.040.160.060.060.110.070.100.070.110.070.100.074.3.7特异性试验用建立的方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒的抗体进行交叉性实验，确定抗原板的特异性。结果显示（见表4-8）四种参考阳性血清检测S/P值均小于阴阳性判定值0.235，血清判定为阴性，结果表明建立的检测猪萨佩罗病毒的间接ELISA方法具有很好的特异性。表4-8交叉反应试验Table4-8CrossreactiontestresultsPCV-2FMDVCSFVPRRSVPSV-1PSV-1血清种类阳性血清阳性血清阳性血清阳性血清阳性血清阴性血清S/P值0.1450.1450.1660.1001.7700.055判定－—－－＋－4.3.8敏感度试验选择1份标准强阳性血清和1份标准弱阳性血清，将血清按照100、200、46 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用400、800、1600、3200、6400倍稀释，以建立的猪萨佩罗病毒的间接ELISA检测方法对稀释的血清进行检测，确定间接ELISA方法的敏感度。结果显示（见表4-9）当血清稀释1600倍时，强阳性血清1的检测S/P值为0.25，大于阴性判定值0.235，检测结果仍然判定为阳性。结果表明本研究建立的检测猪萨佩罗病毒的间接ELISA方法具有很好的敏感度。表4-9敏感度试验结果Table4-9Sensitivitytestresults血清倍比稀释倍数100倍200倍400倍800倍1600倍3200倍6400倍阳性血清11.781.280.820.480.250.150.09判定＋＋＋＋＋－－阳性血清21.000.710.410.220.130.080.06判定＋＋＋－－－－4.3.9PSV-1间接ELISA检测方法和IFA检测方法检测血清对比以本研究建立的猪萨佩罗病毒间接ELISA检测方法和猪萨佩罗病毒间接免疫荧光检测方法对采自六个规模化猪场的208份血清样品进行检测，对比两种方法的符合率。结果显示（见表4-10）两种方法的阳性符合率为81.7%，阴性符合率为68.2%，总符合率为82.6%。表4-10比较间接免疫荧光方法和间接ELISA方法符合率Table4-10ComparisonofELISAwithIFA血清符合数（率）ELISA阳性阴性合计116阳性26142（81.7%）56IFA阴性1066（68.2%）208合计12682（82.6%）4.3.10应用建立的PSV-1间接ELISA检测方法检测临床血清结果以本研究建立的检测猪萨佩罗病毒抗体的间接ELISA方法对采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳地区的5个规模化猪场的不同周龄阶段，每个阶段随机挑选8份样品，总共400份血清样品进行检测，初步调查猪萨佩罗病毒在不同周龄47 湖南农业大学硕士学位论文阶段猪中的血清学流行规律。检测结果如下列表图所示，400份血清样品总阳性率高达56%，表明湖南省PSV-1的感染已非常普遍。表4-11A场不同周龄段血清检测结果Table4-11Afieldofdifferentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W16W18W母猪总计平均S/P值0.070.170.120.340.380.800.720.800.830.150.44阳性率12.5%25.0%12.5%50.0%75.0%100.0%87.5%100.0%100.0%25.0%59%图4-3A场不同周龄段血清的检测结果Fig4-3Afieldofdifferentweeksofserumdetectionresults表4-12B场不同周龄段血清的检测结果Table4-12Bfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W16W18W母猪总计平均S/P值0.100.070.040.170.350.270.380.210.220.190.20阳性率0%0%0%25%63%63%63%38%75%25%35%48 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用图4-4B场不同周龄段血清的检测结果Fig4-4Bfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults表4-13C场不同周龄段血清的检测结果Table4-13Cfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W16W18W母猪总计平均S/P值0.090.060.070.230.490.450.390.360.480.250.29阳性率0%0%0%50%88%50%88%63%100%63%50%图4-5C场不同周龄段血清的检测结果Fig4-5Cfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults49 湖南农业大学硕士学位论文表4-14D场不同周龄段血清的检测结果Table4-14Dfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W16W18W20W母猪总计平均S/P值0.130.080.080.270.641.040.671.260.850.980.180.56阳性率13%0%0%38%88%100%75%100%100%100%25%58%图4-6D场不同周龄段血清的检测结果Fig4-6Dfieldofdifferentweeksofserumdetectionresults表4-15E场不同周龄段血清的检测结果Table4-15Efieldofdifferentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W后备母猪总计平均S/P值0.100.240.360.600.430.550.320.370.220.36阳性率0%25%50%100%75%88%50%63%25%53%50 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用4-7E场不同周龄段血清的检测结果Fig4-7Efieldofdifferentweeksofserumdetectionresults表4-16五个场400份不同周龄段血清的检测结果Table4-16Fivefieldof400differentweeksofserumdetectionresults血清阶段2W4W6W8W10W12W14W16W18W20W后备母猪总计平均S/P值0.100.090.080.250.460.620.530.660.600.980.370.190.41阳性率5%10%13%53%78%80%73%75%94%100%63%33%56%4-8五个场400份不同周龄段血清的检测结果总计Fig4-8Fivefieldof400differentweeksofserumdetectionresultsdetectionresults51 湖南农业大学硕士学位论文4.4讨论4.4.1蛋白包被浓度蛋白浓度包被过高，导致蛋白在包被孔中形成层叠，使大部分蛋白没有暴露，吸附在酶标板上的量少，而使结果偏低。包被蛋白浓度过低，使包被的酶标板孔有大量的空隙，酶标板孔具有较强的吸附力，可以吸附蛋白包被也能在检测过程中吸附血清，造成非特异性反应，从而影响结果判定的准确性。4.4.2一抗和酶标二抗浓度以及作用时间一抗和酶标二抗浓度以及作用时间都会影响结果的准确性。一抗和二抗浓度过高以及作用时间过长，容易造成假阳性结果。相反，一抗和二抗浓度过低以及作用时间过短，容易造成假阴性结果。本研究采用方阵法，确定了最佳一抗和二抗浓度以及最佳作用时间。4.4.3确定临界值酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）需要测定[77]结果的阴阳性报告，其依据为cut-off值（阳性临界值）。临界值的判定准确性决定了ELISA方法的可靠性。临界值的确定方法有标准差比率、阴性血清检[78]测结果平均值+3×标准方差SD值、百分位数法、ROC曲线等。本研究采用阴性血清检测结果平均值+2×标准方差SD值/3×SD值方法确定阴阳性临界值，并在此基础引入S/P值{S/P值=（样品检测OD450nm值－参考阴性血清OD450nm值）÷（参考阳性血清OD450nm值－参考阴性血清OD450nm值）}，减少人为等其他检测过程中造成的影响，使检测方法的结果更准确可靠。4.4.4ELISA方法和IFA方法对比IFA检测方法中部分检测猪血清可能存在与抗原板非特异性吸附，以及结果判定需要经验丰富的研究工作人员区别非特异性荧光和特异性荧光。此外，ELISA方法相比较IFA敏感度更高。因此检测同样一批血清，两种检测方法的阴阳性判定结果存在一定的差异。本研究建立的ELISA方法和IFA方法的总符合率为82.6%，具有较好的一致性。4.4.5五个规模化猪场PSV-1抗体消长规律A、B、C、D场第2、4、6周阶段仔猪的PSV-1抗体值都较低，且阳性率也较低。推测原因是母猪群的抗体值较低，仔猪通过母乳获得的PSV-1抗体也52 第四章猪萨佩罗病毒间接ELISA方法的建立与初步应用不多。从第8周龄仔猪阶段，抗体值开始上升，推测随着断奶后动物机体内母源抗体的消退，第6周龄阶段的仔猪体内的抗体水平无法抵抗PSV-1的感染，此时机体免疫系统受到抗原刺激后，经过免疫连锁反应，产生大量的PSV-1的特异性IgG抗体。到12周龄育肥阶段，基本达到PSV-1抗体上升的最高值，此后到18周龄育成阶段平均抗体值基本保持不变。母猪群阶段的PSV-1抗体水平相比较第12周龄后的育猪阶段抗体值要低很多，推测母猪群饲喂的营养水平、环境管理、体质等相比较肥猪群要好，从而使母猪阶段的PSV-1感染阳性率和抗体水平值有所降低。E场的PSV-1抗体消长规律相比较前4个场，基本规律保持不变，但在周龄阶段上有所提前，从第4周龄仔猪阶段抗体平均值就开始往上升，到第8周龄保育阶段达到上升的峰值。原因是该场的仔猪哺乳期相比较前4个场要短，从而使断奶仔猪的母源抗体消退时间和保育仔猪的感染时间提前。53 湖南农业大学硕士学位论文54 全文结论全文结论1.本研究以实验室分离的PSVHuN1/2016株制备细胞抗原板，一抗和荧光二抗均稀释300倍，建立了检测PSV-1抗体的IFA方法。该方法特异性强，敏感度高，既能将PSV-1抗体与PRRSV、FMDV、PCV-2、CSFV抗体区分开，也可以检测到0.128中和效价的阳性血清。2.将PSV-1编码VP1基因克隆至pET-28a(+)载体构建重组质粒。Westernblot试验表明纯化的包涵体形式的重组蛋白具有良好的特异性和反应原性。以重组VP1蛋白建立了间接ELISA方法。对比建立的ELISA方法和IFA方法，两者总符合率为82.6%。抗原板批内与批间变异系数为1.6～7.0%。3.以建立的间接ELISA方法对采自湖南省5个规模化猪场400份血清样品进行检测，结果显示，五个场的PSV-1抗体消长规律大致相同：第2-6周龄仔猪抗体较低且呈下降趋势；8-12周龄仔猪抗体呈上升趋势，之后到18周龄抗体平均水平基本稳定；母猪群抗体平均值较低。4.本研究填补了猪萨佩罗病毒血清流行病学研究的空白，为以后开展猪萨佩罗病毒的研究工作提供了参考。55 湖南农业大学硕士学位论文56 参考文献参考文献[1]InternationalCommitteeonTaxonomyofviruses,ICTV(2015)Available:http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp(accessed17.1.07).[2]KakuY,SaraiA,MurakamiY.Geneticreclassificationofporcineenteroviruses.[J].JournalofGeneralVirology,2001,82(82):417-24.。[3]DunneHW,WangJT,AmmermanEH.ClassificationofNorthAmericanporcineenteroviruses:acomparisonwithEuropeanandJapanesestrains[J].Infectionandimmunity,1971,4(5):619-631.[4]KnowlesNJ,BuckleyLS,PereiraHG.Classificationofporcineenterovirusesbyantigenicanalysisandcytopathiceffectsintissueculture:descriptionof3newserotypes[J].Archivesofvirology,1979,62(3):201-208.[5]KnowlesNJ,BuckleyLS.Differentiationofporcineenterovirusserotypesbycomplementfixation[J].Researchinveterinaryscience,1980,29(1):113-115.][6]TsengCH,TsaiHJ.Sequenceanalysisofaduckpicornavirusisolateindicatesthatittogetherwithporcineenterovirustype8andsimianpicornavirustype2shouldbeassignedtoanewpicornavirusgenus[J].Virusresearch,2007,129(2):104-114.[7]KrumbholzA,DauberM,HenkeA,etal.SequencingofporcineenterovirusgroupsIIandIIIrevealsuniquefeaturesofbothvirusgroups[J].Journalofvirology,2002,76(11):5813-5821.[8]HellenCUT,deBreyneS.Adistinctgroupofhepacivirus/pestivirus-likeinternalribosomalentrysitesinmembersofdiversepicornavirusgenera:evidenceformodularexchangeoffunctionalnoncodingRNAelementsbyrecombination[J].Journalofvirology,2007,81(11):5850-5863.[9]http://www.picornaviridae.com/sapelovirus/sapelovirus.htm[10]https://talk.ictvonline.org/ICTV/proposals/2014.016aV.A.v1.Picornaviridaespren.[11]PhanTG,KapusinszkyB,WangC,etal.Thefecalviralfloraofwildrodents[J].PLoSPathog,2011,7(9):e1002218.[12]LiL,ShanT,WangC,etal.ThefecalviralfloraofCaliforniasealions[J].Journalofvirology,2011,85(19):9909-9917.57 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湖南农业大学硕士学位论文64 附录缩略词表Abbreviations缩写Abbr.英文名Englishname中文名ChinesenamePSV-1PorcineSapelovirus1猪萨佩罗病毒UTRUntranslatedregion非编码区ORFopenreadingframe开放阅读框IRESinternalribosomeentrysite内部核糖体进入位点CRECis-actingreplicationelemen顺式复制元件IHCimmunohistochemistry免疫组织化学法RT-PCRreversetranscription-PCR反转录PCReIF4Geukaryoticinitiationfactor4G真核起始因子RestrictionenzymecuttingsiteBanmH1酶切位点BanmH1Cacl2Calciumchloride氯化钙TSATryptoseSoyaAgar大豆酪蛋白琼脂培养基DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ddH2ODoubledistilledwater双蒸水HisHlstidine组氨酸LBLysogenybroth溶菌肉汤IPTGIsopropyl-β-d-thiogalactoside异丙基-β-d-硫代半乳糖苷MixMixture混合液EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠Sodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis凝胶电泳BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白PVDFPolyvinylideneFluoride聚偏二氟乙烯PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液APAlkalinephosphatase碱性磷酸酶IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白pET28a(+)Polyethyleneterepthalate质粒JM109ChemicallyCompetentCell感受态细胞BL21(DE3)ChemicallyCompetentCell感受态细胞PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RmpRevolutionsminuteper每分钟转数MinMinute分钟TSBTrypticaseSoyBroth胰蛋白胨大豆肉汤培养基LiqLiquidation液化kDaKilodalton千道尔顿65 湖南农业大学硕士学位论文66 致谢致谢本论文是在余兴龙老师的关心与指导下完成的，余兴龙老师严谨的治学态度和渊博的学识不仅开拓了我的研究思路，让我树立了宏伟的学术目标，也教会了我许多待人接物与为人处事的道理。在此我要向余兴龙老师表示深深的谢意！本论文最终得以顺利完成与实验室的老师、师兄师姐和同学们的帮助是分不开的，他们在论文的开题和实验中也给我提供了不少的意见以及相应的一系列可行性的建议，在此我向李润成老师、葛猛老师、杨涛涛师兄以及实验室其他师兄师姐、同学们表示深深的感谢。同时也感谢湖南农业大学动物医学院为我提供良好的做毕业论文的环境。最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友，以及论文中被我引用或参考的论著的作者。三年的研究生读书生活在这个季节即将划上一个句号，而对于我的人生却只是一个逗号，我将积极面对又一次征程的开始！67 湖南农业大学硕士学位论文作者简介姓名：彭旺性别：男籍贯：湖南省衡阳市出生年月：1991-04专业：预防兽医学研究方向：病原分子生物学和免疫学主要经历：2010.09-2014.06就读于湖南农业大学动物医学院，动物医学专业2014.09-2017.06就读于湖南农业大学动物医学院，预防兽医专业攻毒硕士研究生期间以第一作者发表的学术论文：猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立与初步应用，湖南农业大学学报（自然科学版），已录用，第一作者.68