DB32-T 3685-2019 猪萨佩罗病毒检测技术规程

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1、ICS65.020.30B40DB32江苏省地方标准DB32/T3685—2019猪萨佩罗病毒检测技术规程DetectiontechnicalregulationforPorcineSapelovirus2019-12-04发布2019-12-25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T3685—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、周金柱、俞正玉。I

2、DB32/T3685—2019猪萨佩罗病毒检测技术1范围本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测（RT-PCR法）、血清学检测（间接ELISA方法）等要求。本标准规定的RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊，间接ELISA试验适用于血清学的普查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和

3、定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪萨佩罗病毒PorcineSapelovirus（PSV）单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、腹泻、繁殖障碍和肺炎，感染猪康复后仍然会继续排毒，成为重要的病毒传播源，因此该病毒在猪群中感染率很高，严重威胁着养猪业的健康发展。4核酸检测（RT-PCR法）4.1材料准备PCR引物P15`-GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC-3`和P25`-AATACAGGATGACACAGGAAGGG-3`（见附录

4、B）。PCR相关试剂。猪萨佩罗病毒阳性病料RNA提取物反转录为cDNA作为阳性对照，水作为阴性对照。高速离心机（10000r/min）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移液器等仪器。4.2操作步骤4.2.1DNA模板制备按NY/T541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20℃以下冰箱保存。临床组织病料样品加入1×PBS缓冲液进行充分研磨后冻融3次，高速10000r/min离心5min，取上清提取病毒总RNA（参照RNA提取试剂盒说明书），并反转录成cDNA（利用反转录试剂

5、盒），保存备用。4.2.2PCR1DB32/T3685—2019PCR反应体系：2xTaqMasterMix12.5μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，模板2μL～5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应条件：预变性94℃5min，94℃30s，扩增的退火温度分别采用55℃进行扩增30s，72℃30s，35个循环72℃延伸10min。4.2.3电泳制备1%琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10μL～20μL分别与适量加样缓冲液混合后

6、，加样到电泳孔中，9V/cm恒压下电泳15min～30min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪或凝胶成像系统上观察