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ZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文MasterDissertation中文论文题目:携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究英文论文题目：AntitumoreffectofharboringIL-24andIFN-βgenemediatedbytargetedoncolyticadenovirusincancer学科专业：生物学作者姓名：苏群舒指导教师：刘新垣院士递交日期：2017年3月20日 浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律。论文为本人亲自撰写结果由本人承担６学位论文作者签名日期：年３月ｇ日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。口》保密，在年解密后使用本版权书本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：經指导教师签名日期：地年３月之３日日期：別年３％日］７４ 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究摘要随着不断的探索，精准医学与个体化治疗逐步被大众承认。2001年，中国科学院刘新垣院士提出癌症靶向基因-病毒治疗策略（CancerTargetingGene-ViroTherapy，CTGVT）。这是一种将基因治疗与病毒治疗两种方法合二为一的全新的治疗方法，通过在病毒上插入治疗基因，靶向的进入肿瘤。经过病毒的复制，使得携带的基因的扩增。最终达到抑制肿瘤生长的作用。在本实验研究中，我们采用CTGVT策略，通过向载体的多克隆位点（TK区）插入外源基因从而增强溶瘤腺病毒对于癌细胞的杀伤效果。病毒靶向到肿瘤细胞并在其中大量复制的同时携带的治疗基因IL-24与IFN-β也随之大量的复制，从而大大提高了抗癌效果。并且运用腺病毒复制特异性Survivin启动子（sp)的优势，同时将E1B区的55bp（∆55）碱基删除，从而构建溶瘤腺病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)。通过重组技术，将IL-24与IFN-β添加于溶瘤腺病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)载体中，得到新型重组双基因靶向溶瘤腺病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)。同时我们还利用新型腺病毒构建系统。分别构建了空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，以及单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)作为对照，鉴定成功后，通过氯化铯梯度离心等纯化工艺得到滴度符合的实验样品，经过四种病毒以及无病毒对照组之间细胞实验的比较。将不同浓度梯度的病毒加于肿瘤以及正常细胞中，通过荧光显微镜、MTT检测、结晶紫染色；Hochest33342染色、流式细胞术和Westernblot分别检测OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)对癌细胞的形态学变化、细胞存活率；凋亡小体形成。凋亡信号转导相关蛋白表达的影响。结果显示，携带目的基因的腺病毒对于肝癌细胞的靶向杀伤效果明显，通过相关实验以及大量文章的查询，我们推测携带IL-24与IFN-β的腺病毒靶向感染肝癌细胞后导致下游抑制凋亡相关的基因活化水平降低，内质网应激持续进行最终触发caspase3、PARP等的级联反应走向凋亡途径。我们的研究是探索性的研究，为腺病毒载体以及IL-24与IFN-β在基因治疗中的应用提供了一定的参考，同时也为精准医学与肿瘤个性化治疗提供了一种理论上的构思与框架。关键词：CTGVT，溶瘤腺病毒，IL-24，IFN-β，caspaseI 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究AntitumoreffectofharboringIL-24andIFN-βgenemediatedbytargetedoncolyticadenovirusincancerAbstractInthecontextofprecisionmedicineandpersonalizedtreatmentgraduallyrecognizedbythepublic.AcademicianofChineseacademyofsciencesxin-yuanLiucreatedCancerTargetingGene-ViroTherapy(CTGVT)asanewstrategyin2001.Thisisanewtreatmentmethodwhichcombininggenetherapywithvirustherapy.Byinsertingthetherapeuticgeneintothevirus,withtargetingintothetumor,thereplicationofthevirusandtheamplificationofthecorrespondinggenecaninhibitthegrowthoftumorcells.Inthisstudy,weusetheCTGVTstrategytoinsertforeigngenestoTKareatoenhancethetargetedeffectofcancercellkilling.VirustargetstotumorcellswithalargenumberofcopieswhilethetherapeuticgeneIL-24andIFN-βreplicateatthesametime.Therefore,theanticancereffectisgreatlyimproved,andthenthetreatmentoftumorisachieved.AndweusethetumorspecificSurvivinpromoter,whichiskeyelementforadenovirusreplication,anddeletethe55bpDNAsequencelocatedonE1BregiontoconstructanoveloncolyticadenovirusnamedOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55).FollowedbythetechniqueofgenerecombinationwhichcloningIL-24andIFN-βgeneintooncolyticadenovirusvectorOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55),thenewrecombinantoncolyticadenovirusofdualgeneOncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)isproduced.Ascontrol,wealsousednewadenovirusstructuresystemtoconstructemptyvirusandsinglegenevirusOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55),OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)andOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β).Afterthesuccessfulidentificationprocess,titermatchedexperimentalsampleareobtainedbypurifiedofCsClgradientcentrifugation.Withcomparisonofcellexperimentsbetweenfourviralgroupsandnonviralcontrolgroups,theimpacttohepatomacarcinomacellwithmorphologicalchanges,apoptoticbodyformation,cellviability,apoptosisandtheexpressionofapoptosissignaltransductionrelatedproteinfromdoublegenetargetingoncolyticadenovirusaretestedbyfluorescencemicroscope,Hochest33342staining,MTTassay,AnnexinV/PIflowcytometryandWesternblottingetal.Theresultsshowedthattheadenoviruscarryingthetargetgenewaseffectiveinkillingcancercells.Throughtherelevantexperimentsandlotsofarticlesforthequery,wespeculatethat,afterinfectinghepatomacellbytheadenoviruscarryingthetargetgene,hepatomacellsdownstreaminhibitingapoptosisrelatedgeneactivationlevelisreducedandtheendoplasmicreticulumstresscontinuouseventuallytriggercaspasecascadetotheapoptosispathway.II 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究Ourstudyistheexploratoryresearchforadenovirusvector,IL-24andIFN-βgeneintheapplicationofgenetherapyprovidesreference,aswellasprovidesatheoreticalconceptionandframeworkforprecisionpersonalizedmedicineandcancertherapy.Keywords：CTGVT,Oncolyticadenovirus,IL-24,IFN-β,caspaseIII 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究缩略词表缩写英文全称中文全称EBEthidiumbromide溴化乙锭PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应LBLuria-BertaniculturemediumLB培养基K+Kanamicin卡那霉素MOIMultiplicityofInfection感染复数A+Ampicillin氨苄青霉素FBSFetalbovineserum胎牛血清PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液DMEMDulbecco’sModifiedEagleMedium细胞的合成培养基dNTPfourdeoxynucleotidetriphosphatesdATP，dCTP，dGTP，dTTPPIProdiumIodide碘化丙啶TBSTTris-Buffered-SalinewithTween洗膜缓冲液WBWesternblot免疫印迹AnnexinVAnnexinV-Fluoresceinisothiocyanate-FITC膜联蛋白-异硫氰酸荧光素FCMFlowcytometrymethod流式细胞术DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜MTTMethylThiazolylTetrazolium四甲基偶氮唑蓝IV 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究目录摘要........................................................................................................................................................IAbstract..................................................................................................................................................II1引言.............................................................................................................................................11.1癌症的研究现状..........................................................................................................11.2肿瘤治疗概述..............................................................................................................11.3重组病毒的改造与选择概述......................................................................................21.1.3.1Survivin启动子................................................................................................21.1.3.2肿瘤治疗基因Il-24与IFN-β的介绍..............................................................31.1.3.3病毒载体...........................................................................................................32实验材料.....................................................................................................................................42.1细胞株..........................................................................................................................42.2菌株与质粒..................................................................................................................52.3引物设计与合成..........................................................................................................52.4实验试剂与工具酶......................................................................................................62.5主要实验仪器与设备................................................................................................72.6主要实验用溶液及配制方法....................................................................................83实验方法.....................................................................................................................................93.1分子克隆部分：穿梭质粒pSD55Ad-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的构建92.2.1.1分子克隆常用的方法及步骤..........................................................................93.2病毒构建部分：OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒的包装、纯化、鉴定、大量扩增及病毒滴度测定.....................................................................................212.2.2.1重组质粒构建及病毒同源重组示意图........................................................212.2.2.2贴壁细胞的培养.............................................................................................212.2.2.3同源重组构建腺病毒.....................................................................................232.2.2.4病毒的纯化.....................................................................................................242.2.2.5病毒的鉴定.....................................................................................................242.2.2.6病毒的滴度测定.............................................................................................253.3细胞实验部分：体外实验检查OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒对肿瘤的杀伤效果.............................................................................................................272.2.3.1病毒基因的表达水平.....................................................................................272.2.3.2MTT法检测细胞存活率...............................................................................312.2.3.3细胞病变效应（CPE）实验.........................................................................312.2.3.4凋亡细胞染色实验：Hoechst33342染色...................................................312.2.3.5Annexin/PI双染色法检测细胞凋亡...........................................................324重组质粒的鉴定.......................................................................................................................333.1.1目的基因IL-24与IFN-β的获得..............................................................................333.1.2重组质粒pCA13-IL-24与pCA13-IFN-β的鉴定....................................................343.1.3穿梭质粒pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，pSD55-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的鉴定.................................................................................................................................353.1.4转入BJ5183后重组质粒的鉴定.............................................................................365重组病毒的鉴定.......................................................................................................................383.2.1细胞病变的形态学观察............................................................................................383.2.2PCR鉴定...................................................................................................................383.2.3Westernblot检测目的基因IL-24，IFN-β蛋白水平表达.....................................406体外实验证明溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果...............................................................................423.3.1MTT法检测目的病毒的肿瘤杀伤性与安全性......................................................423.3.2结晶紫实验检测细胞病变现象................................................................................443.3.3Hoechst33342染色观察细胞凋亡现象..................................................................453.3.4AnnexinⅤ/PI流式检测细胞凋亡现象....................................................................46V 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3.3.5Westernblot检测caspase通路变化........................................................................477结果讨论..................................................................................................................................48参考文献.............................................................................................................................................50致谢.....................................................................................................................................................53VI 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究1引言1.1癌症的研究现状肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，经过时间的积累，局部组织的细胞在基因水平上失去正常基因调控的从而导致异常增生与分化形成的新的细胞。新的细胞一旦形成，它的生长不受正常机体生理调节，因此不会随着病因的去除而凋亡，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。近半个世纪以来，世界上癌症的发生率和致死率在不断的攀升，在中国，癌症更是成为了疾病死因之首，对人类的健康造成了巨大威胁。据CA：ACancerJournalforClinicians杂志上2015年的统计，中国2015年估计有约429万例新增的浸润性癌症确诊病例，较2012年的312万蹿升37.5%，其中约281例癌症死亡，相当于每天平均确诊近1.2万例新的癌症病例。肺癌、肝癌、胃癌、食道癌是我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤，占到了中国癌症诊断数的57%，而发达国际这四种癌占比多在20%以下，在中国，在这几种恶性肿瘤的新增癌症病例和死亡人数均于全球首位[1]。其中肝癌也就是肝脏恶性肿瘤。除了有原发性还有继发性肝癌。其中原发性肝癌是最常见的致死性恶性肿瘤，多数患者在首次手术后一年内复发或转移，一年生存率极低[2]。而我国又是乙型肝炎感染人群最多的国家，肝癌的发病率明显较其他国家偏高[3,4]。因此，深入了解肝癌发病的分子机制并积极探索新的治疗手段是提高肝癌整体治疗效果的关键。1.2肿瘤治疗概述许多新型分子靶向治疗药物被研制出来并大量的试用于晚期肝癌的治疗[5-7]。比如许多实验证实了多靶点、多激酶抑制剂的作用。如索拉非尼[8-10]对晚期肝癌疗效明显。此外舒尼替尼、拉帕替尼、伊马替尼、硼替佐米等也显示出良好的苗头[11-17]。可是即便是索拉非尼,实际的疗效仍然比较低[18,19],因此，深入了解肝癌发病的分子机制并积极探索新的治疗手段是提高肝癌整体治疗效果的关键。结合前人的不竭探索表明，肿瘤的靶向基因-病毒治疗因其特异性最强，在基本上不影响正常组织的情况下杀伤肿瘤细胞，因此受到广泛的关注。2001年刘新垣院士提1 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究出了靶向双基因－病毒治疗（TargetingDualGene-Virotherapy）策略[21-24]。在该策略的指引下进行了大量的实验。其结果显示细胞实验及动物实验中肿瘤的杀伤效果显著。表明靶向双基因－病毒治疗肿瘤的可行性。其基本理念是利用启动子以及病毒的优化改造，提高病毒对于肿瘤的靶向性。这是一种将基因治疗与病毒治疗两种方法合二为一的全新的治疗方法，通过在病毒上插入治疗基因，从而得到新的携带有外援抑制基因的靶向溶瘤病毒。靶向的进入肿瘤后，经过病毒的复制，使得携带的基因的扩增，从而抑制肿瘤生长。1.3重组病毒的改造与选择概述1.3.1Survivin启动子Survivin由142个氨基酸构成。相对分子质量为16.5×103，属于凋亡抑制蛋白家族的一员[25-27]，该家族包含8个成员。Survivin广泛表达于人类各种肿瘤组织，但在正常、分化末期的承认组织中不表达（除正在血管形成期的基底上、内皮细胞、睾丸和分泌期子宫内膜外）。国内外大量研究表明，Survivin可在多种转化细胞系中阳性表达，并鉴于所有人类最常见的肿瘤组织，如胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤肿瘤等等。其在抑制细胞凋亡、调控细胞周期、参与血管形成等方面发挥重要的生物学功能。Survivin在多种肿瘤组织中有大量的表达。Survivin是一种潜在的肿瘤治疗靶点。它有小分子抑制剂。因用于肿瘤治疗的研究而为人们所关注。Survivin与磷酸化的XIAP相互作用。抑制XIAP经泛素化降解。该复合物竞争结合。其活化了caspase从而抑制细胞凋亡[28]。Li等[29]验证了Survivin与caspase存在相互作用。他运用不同方法，如免疫沉淀。同时，Barrett等[30]发现了Thr34磷酸化的Survivin。它具有增强肿瘤细胞中抗凋亡能力。非caspase依赖途径认为Survivin与线粒体中促凋亡因子Smac（secondmitochondria-derivedactivatorofcaspases）相互作用，抑制细胞凋亡。Smac存在于线粒体中。凋亡时。Smac移动到细胞质中。BIR结构域与Smac竞争结合。从而消除IAPs对caspase的抑制作用[31]。总之Survivin基因主要通过抑制caspase级联反应下游的caspase-3、caspase-7。从而发挥其抗凋亡作用。其抑制肿瘤细胞凋亡的作用已有较多文献报道，因此成为肿瘤药物和基因治疗的一个理想靶点[32-35]。2 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究1.3.2肿瘤治疗基因Il-24与IFN-β的介绍白细胞介素-24（Interleukin-24，IL-24）又称为黑色素瘤分化相关因子7（MDA-7），IL-24是从终末分化的黑色素瘤细胞中分离出的一种细胞因子[36]，由624bp的碱基构成，作为目前被发现的既抑制癌细胞的生长、转移和血管形成，又刺激表达次级细胞因子免疫调节而备受关注[37]。正常表达的IL-24通过免疫应答在调控中有着重要的作用。IL-24是肿瘤抑制因子。同时还能刺激机体对肿瘤进行免疫应答。有报道称，IL-24通过介导JAK/STAT通路在机体免疫应答的调控过程中起重要作用。与此同时，一些实验室利用其它载体携带IL-24也已取得对肝癌细胞，黑色素瘤细胞等比较满意的体外实验结果[38-40]，干扰素(interferon,IFN)有IFN-β、IFN-α以及IFN-γ型。它是多功能的活性蛋白质。它是由淋巴细胞、单核细胞产生的细胞因子。它们在肿瘤细胞中有调节免疫功能的生物活性。之前的研究显示用腺病毒作为载体的干扰素β（成纤维细胞型）基因治疗对多种癌症都有明显的效果，包括卵巢癌[41]、膀胱癌[42-43]、神经胶质瘤[44]和肺癌[45]，尤其对于肝癌细胞，有研究表明干扰素β可使35%～40%丙型肝炎患者病毒完全消除，同时肝功能可恢复正常，许多学者们对IFN治疗效果的影响因子和更有效的IFN给药方法进行了多方面研究[46-48]。同时干扰素β还可增强细胞活力。如NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞。它起到免疫调节作用。并增强抗病毒能力。因此干扰素β基因成为了一个理想的治疗肿瘤的基因。1.3.3病毒载体病毒载体有多种。如腺病毒，痘病毒，慢病毒等等[49-51]。本课题选用腺病毒作为载体。因其转基因的效率高，不结合到染色体中，不易突变，能同时表达多个基因并且宿主的范围广，对人的致病性低，在良好的操作下可以制得高滴度的病毒制剂，而痘病毒和慢病毒则没有这些优势，由于腺病毒具备以上的优点，本课题选用腺病毒作为双基因治疗肿瘤的病毒载体。综上所诉，本文利用Survivin启动子以及双基因腺病毒的靶向优势，构建新的含有治疗基因IL-24与IFN-β新型腺病毒，并分别作用于正常的肝细胞和肝癌细胞和肺癌细胞，对比双基因，单基因以及空载腺病毒对于肝癌细胞的杀伤效应。3 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究2实验材料2.1细胞株表2.1细胞株名称细胞种类来源培养条件及性质一、肿瘤细胞株Huh-7人肝癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBSSMMC-7721人肝癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBSBel-7404人肝癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBSA549人肺癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBSHela人子宫颈癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBSSW480人结肠癌细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBS二、正常细胞株293A人源胚胎肾细胞中科院上海细胞库DMEM+10%FBSL-02人肝细胞株中科院上海细胞库DMEM+5%FBS三、腺病毒包装HEK293腺病毒转化的人胚肾细ATCC、Microbix公司DMEM+10%FBS胞株（含Ad5E1区）2.2菌株与质粒BJ5183感受态是能通过含有的重组组件和两个质粒上的同源序列将目的基因的载体，与腺病毒基因组的腺病毒载体同源重组，该菌株由本实验室提供。E.coli菌株DH5α买于诺唯赞生物科技有限公司。pZD55、pCA13、pShuttle、pShuttle-D55、PMD-T-HCMV-SV40作为中间的穿梭质粒载体。其均为本实验室保存。4 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究2.3引物设计与合成(1)IFN-β基因鉴定引物IFN-βSense：5’-CGTAACCGAGTAAGATTTGG-3’IFN-βAntisense：5’-GAGCCCAYCACATTCTGACG-3’(2)IL-24基因鉴定引物IL-24Sense：5’-GAGGCTGTCGCCAGCAAAGG-3’IL-24Antisense：5’-TTGGACGTAGAAGCAGCTCT-3’(3)IFN-β基因鉴定引物(含表达框)IFN-βSense：5’-GAAGATCTAATTCCCTGGCATTATGCCC-3’IFN-βAntisense：5’-GAAGATCTTCGATGCTAGACGATCCAGA-3’(4)IL-24基因鉴定引物(含表达框)IL-24Sense：5’-CGGAATTCATGACCAACAAGTGTCTCCT-3’IL-24Antisense：5’-GCTCTAGATCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3’(5)IL-24一步克隆引物IL-24Sense：5’-CCGAAGCTTATGAATTTTCAACAGAGGCT-3’IL-24Antisense：5’-CGCGGATCCTCAGAGCTTGTAGAATTTCT-3’2.4实验试剂与工具酶血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、核酸电泳DNAMarker、PCRMaster-Mixture(5×)、30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、Tris-HCl(pH=8.8)、Tris-HCl(pH=6.8)、TEMED、STE缓冲液购自于上海捷瑞生物工程有限公司。琼脂糖、氯化钠（分析纯）、SDS、APS购买自AMERCO公司，甘氨酸、Tris-Base、BSA、NaN3购买自Sigma公司。PMSF、吐温-20、胰酶细胞消化液、细胞用青霉素-链霉素溶液（100×）、IP-Lysis蛋白裂解液，上样缓冲液（5×蛋白）购自碧云5 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究天公司。BCA蛋白质定量试剂盒。AnnexinV-FITC-PI试剂盒购买自BD公司。质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒等购自捷瑞公司。ClonExpressTMIIOneStepCloningKit购自诺唯赞公司。甲醇、DMSO，培养基以及胎牛血清购买自昊鑫公司。caspase-3抗体购自纽微有限公司。GAPDH抗体、IFN-β抗体来自于格瑞斯威公司。二抗购买于联科生物公司。EffecteneTransfectionReagent购自Qiagen公司。DNA分子量Marker购自全式金公司。KOD-plus/Taq酶、dNTPs、T4连接酶、快速连接酶等购自TOYOBO。proteinaseK、RNaseA购自上海生工。6 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究2.5主要实验仪器与设备表2.2仪器设备Table2.2Instrumenttation仪器设备名称型号公司超速冷冻离心机L-80XP德国Beckman高速冷冻离心机CF16RX日本Hitachi台式低温离心机FRESCO贺利氏梯度PCR仪PTC-200型美国MJResearch三气培养箱RTG5000T-9VREVCO水平电泳槽HE-120天能生物安全柜Nuaire425-400NUAIRE超低温冰箱Nuaire6382ENUAIRE凝胶成像仪GGM/D2GeneGenius生化培养箱LRH-150L上海一恒紫外光度计HITACHIU2800日本Hitachi脱色摇床Ts－1型江苏其林贝尔公司细胞流式仪FACSAricaBD纯水系统ZMQS50F01型Millipore公司空气摇床WSL-100A型BLUDPARDPCR仪PTC-100型-96型美国MJResearch酶标仪TECANDNAexportTECAN转移仪ELITE200型WELTEC公司液氮罐Director4000ICI2.6主要实验用溶液及配制方法（1）PBS（1L）：准确称量8gNaCl，1.44gNa2HPO3，0.24gKH2PO3和0.2gKCl，将试剂放入干净的大烧杯，用去离子水定容混匀后，高温高压灭菌备用。7 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（2）MTT溶液（5mg/mL）：将0.5gMTT溶解于100mLPBS中避光搅拌至完全溶解，分装后可以直接使用也可以于-20℃避光保存。（3）10%SDS溶液（50mL）：准确称量SDS0.5g至50mL容量瓶中溶解后，用去离子水定容，常温保存。（4）10%APS溶液（50mL）：准确称量APS0.5g至50mL离心管，用去离子水定容，溶解后避光储存在-20℃冰箱中备用。（5）50×TAE缓冲液（1L）：准确称量Tris-base242g，Na2EDTA·2H2O37.2g放入1L烧杯，加入800mL的去离子水，加入57mL的冰醋酸充分混匀倒入容量瓶，用去离子水定容。（6）1×TAE缓冲液：将配置好的50×缓冲液取适量稀释到1×使用。（7）5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液（1L）：TrisBase14.7g，甘氨酸72g，SDS5g加入800mL去离子水搅拌至溶解，常温下加去离子水定容至。（8）1×变性蛋白电泳缓冲液：将配置好的5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液取适量稀释到1×使用。（9）10×湿转转膜缓冲液（1L）：准确称量Tris-Base30.3g，甘氨酸144g。800mL去离子水溶解。移至容量瓶定容。（10）1×TBST溶液（1L）：称量Tris-base2.422g，NaCl8.775g，0.5mL的吐温-20溶液，加去离子水定容至1L。（11）封闭液（25mL）：称取1.25gBSA，加入20mL去离子水在涡旋震荡仪上涡旋至完全溶解，再用去离子水加至25mL，4度冰箱保存备用。（12）一抗稀释液（100mL）：称量BSA（或用脱脂奶粉）2g，NaN30.1g加入1×TBST缓冲液定容至100mL。（13）二抗稀释液（50mL）：按二抗说明书配比稀释使用。8 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3实验方法3.1分子克隆部分：穿梭质粒pSD55Ad-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的构建3.1.1分子克隆常用的方法及步骤3.1.1.1中间载体的制备（一）质粒DNA的制备质粒DNA的小量制备:（1）将2mL培养的菌液。12000rpm离心1min，倒掉上清。（2）加入200μlSolutionI。悬浮细菌。（3）加入200μlSolutionII。迅速温和并充分地上下翻转。混合6次，使菌体充分裂解至透亮的蛋清状溶液。（4）加入350μlSolutionIII。温和并充分地上下翻转。混合10次。室温放置5min。12000rpm离心10min。（5）取步骤4中的上清将其转移。套放于2mL收集管内离心柱中。室温6000rpm，离心1min。取出离心柱，弃掉废液。（6）将离心柱重新放回收集管中，加入500μlSolutionIV，12000rpm，离心1min，（7）倒掉收集管中废液，将离心柱重新放回管中。加入500μlWashSolution。12000rpm，离心1min，弃掉废液。（8）重复步骤7一次。（9）倒掉收集管中废液，12000rpm离心1min，彻底去除WashSolution。（10）将离心柱放入洁净的离心管中。在离心柱膜中央，加入50μl-70μlElutionBuffer。37°放置2min。12000rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为目的质粒的溶液。取3μl进行电泳检测。纯化好的DNA可用于后续实验，或-20℃保存。（二）质粒DNA大量提取:9 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（1）挑新鲜单菌落。加2mL于含抗生素的LB中。37℃220rpm振荡，培养过夜。次日，取适量的菌液。接种至100mL含抗生素的LB中。37℃220rpm振荡，培养过夜。（2）取细菌培养物。分装至50mL离心管中。5000rpm离心10min，弃上清。管倒置于干燥的纸上。干燥后，放于冰上。（3）加入3mL溶液I。振荡，使菌体混匀。冰浴反应10min。（4）加入6mL溶液II。颠倒5次，混匀。室温静置10min。（5）加入5mL溶液III。混匀至出现絮状沉淀。再冰浴反应10min。（6）4℃，10000rpm离心10min，至转头自然停止。（7）将上清过滤于另一离心管中。加0.6倍体积（约8mL）异丙醇。混匀，室温静置10min。（8）4℃，10000rpm，离心10min。小心倒去上清。干燥后加入70%乙醇洗涤沉淀。再吸尽液滴。室温干燥。（9）加入350μlTE，摇动、吹打，充分溶解DNA，吸至1.5mLEppendorf管中，加入350μl5MLiCl，充分振荡。（10）4℃12000rpm离心10min，上清吸至另一Eppendorf管中，用等量（约700μl异丙醇充分混匀，静置沉淀15min。（11）4℃，12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤，室温干燥后加入250μlRNaseA使沉淀溶解，37℃水浴30min，使RNA降解。（12）250μl含13%（w/v）聚乙二醇（PEG8000）的1.6MNaCl充分混匀，冰上沉淀1hr。（13）4℃，12000rpm离心10min。（14）弃上清，用400μlTE(pH8.0)，将沉淀溶解，37℃水浴1hr。（15）用氯仿、氯仿各抽提一次。在不吸到交界处的蛋白质沉淀下。将上层水相吸另一离心管中。（17）加1/10体积3MNaAc。混匀后，加入2倍的无水乙醇。室温静置10min。（18）4℃，12000rpm，离心10min。小心倒掉上清。加200μl70%乙醇洗涤沉淀。小心吸尽倒掉上清。干燥。（19）加入20μl双蒸水。将沉淀溶解后冻存。（三）1%琼脂糖凝胶的配置：10 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究称取0.5g琼脂糖。放于250mL锥形瓶中。加入50mL1×TAE缓冲液。混匀后放入微波炉中加热。充分溶解后，放置室温冷却。降温后加入3μL，1mg/mL溴化乙锭溶液。混匀。倒入插有梳子的凝胶板上。待溶液凝固后即可使用。（四）DNA凝胶回收：（1）在紫外灯下。切下含有目的条带的凝胶。切碎后计算凝胶重量。（2）加入3个凝胶体积的BufferDE-A。混合均匀。于75℃加热。直至凝胶块完全熔化。（3）加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。（4）吸取混合液。转移到DNA制备管中。12000×g离心1min。弃滤液。（5）将制备管置回2mL离心管，加500μlBufferW1。12000×g离心30s弃滤液。（6）将制备管置回2mL离心管。加700μlBufferW2。12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次12000×g离1min。（7）将制备管置回2mL离心管中。12000×g离心1min。（8）将制备管放于1.5mL离心管中。在膜中央加入25-30μlEluent。（9）室温静止1min。12000×g离心1min洗DNA。（五）PCR产物纯化（1）加3个体积的BufferPCR-A于PCR反应液中。混匀，转移到制备管中。12000×g离心1min，弃滤液。（2）将制备管置回2mL离心管，加700μlBufferW2，12000×g离心1min，弃滤液。（3）将制备管置于离心管中，将制备管置回2mL离心管，加400μlBufferW2，12000×g离心1min。（4）将制备管置于干净的离心管中。在制备管膜中央。加25-30μlEluent或去离、子水。室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。（六）DH5α感受态细胞的制备：TSS法：（1）以平板上的单菌落。接种到5mLLB培养基中。37℃，220rpm活化过夜。11 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（2）取100μl活化大肠杆菌，接种到100mLLB培养基中，37℃，250rpm培养约3-4hr，至OD600为0.2-0.4。（3）分装至2个50mL离心管中，冰浴30min。（4）4℃，5000rpm离心5min，弃上清。（5）将每管菌体沉淀。悬浮于5mL的TSS中。（6）30min冰浴后分装至0.5mL离心管。每离心管可装100μl。于-80℃贮存可长期使用。氯化钙法：（1）将大肠杆菌接种于5mLLB液体培养基中。于37℃300rpm摇床振荡，培养过夜。（2）取500μl培养液转入50mLLB培养基中。37℃300rpm振荡培养1.5hr左右至OD600=0.3。（4）转入50mL离心管，冰上放置15min。（5）于4℃，5000rpm离心5min。细胞用预冷的10mL0.1MCaCl2悬浮，冰浴15min。（6）4℃，5000rpm离心5min。细胞再悬浮于2mL0.1MCaCl2中。置于冰上待用。或分装储存于-80℃冰箱待用。转化的基本步骤：从-80℃冰箱中取适量制备好的DH5α感受态。冰上融化。取连接产物10μl。加入100μl感受态细胞中。混匀。冰浴30min，42℃热休克90sec。再冰浴5min。将感受态细胞中加入500μlLB。37℃，220rpm摇床培养45min。然后5000rpm离心5min。去2/3上清，用剩下的1/3上清重悬细胞。涂布于LB板上。37℃培养箱中培养过夜。（七）基因组DNA浓度及纯度的测定得到的病毒基因组溶液用NanoDrop2000微量分光光度计测量DNA浓度以及OD260/OD280来推测DNA纯度。具体实验方法：（1）抬起样品臂加一滴去离子水清洗基座用擦镜纸擦干。（2）打开NanoDrop2000操作软件，进入核酸检测中的DNA检测模式，把0.001mL65℃水浴锅预热的ElutionBuffer加到基座上，并把样品臂放下。点击Blank来进行空白对照检测。12 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（3）重新加预热的ElutionBuffer到基座上。把它当成样品一样来检测。点击Measure来进行检测。结果应该是差不多为一水平线。吸光值变化不超过0.04A为仪器校验合格。否则回到步骤（1）。（4）抬起样品臂。加入0.001mL的病毒基因组DNA溶液到基座上。轻轻放下样品臂。点击Measure进行检测。实验记录本记录相应的DNA浓度和OD260/OD280。每检测一个样品用擦镜纸将基座擦干净。直接进行下个样品的测量。（5）使用完毕用一滴去离子水清洗基座并用擦镜纸擦干净，放下样品臂，关闭软件，罩上防尘罩，登记大型仪器使用记录本。3.1.1.2穿梭质粒pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的构建（一）重组基因病毒的示意图OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)与OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)。OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)图2.1重组基因病毒的构建图Fig.2.1constructionofrecombinantgenevirus13 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（二）中间载体pCA-IL-24与pCA-IFN-β的构建（1）目的基因的获得利用目的基因IL-24(IFN-β)的引物。通过PCR扩增而得。具体的PCR体系为：模板2μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μl目的基因sense2μl目的基因antisense2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μlPCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45S，55℃退火30S，68℃延伸1min30sec，30个循环，12℃forever；PCR反应结束后加入MgCl24μl，dNTP0.5μl，Buffer0.5μl，Taq酶1μl，72℃延伸10min；反应结束，核算电泳并回收目的片段。该片段两端含有ECORI和XbaI酶切位点。（2）pCA载体线性化pCA载体经ECORI和XbaI双酶切获得7000bp左右的大片段，反应体系如下：pCAVector20μlECORI1μlXbaI1μl10×TangoBuffer6μlddH2O2μlTotalvolume30μl37°酶切2-3hr，酶切。核酸电泳。凝胶成像仪观察。并回收目的片段。该片段两端含有ECORI和XbaI两个酶切位点。（3）pCA-IL-24与pCA-IFN-β构建回收的目的基因片段。与载体片段连接，反应体系如下：pCA载体2μlPCR回收产物8μlLigationHighver.210μlTotalvolume20μl14 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究16℃水浴连接过夜。将连接产物转化于DH5α感受态。涂AMP板。37℃生化培养箱内培养12hr。挑取单克隆。放于AMP的液体LB中。37℃摇床扩增10hr。做酶切鉴定。筛选pCA-IL-24与pCA-IFN-β阳性克隆。（4）重组质粒酶切鉴定鉴定体系如下：阳性克隆20μlEcoRⅠ1μlXbaⅠ1μl10×TangoBuffer6μlddH2O2μlTotalvolume30μl37℃水浴酶切2-3h。酶切结束后核酸电泳。观察1300-1400bp左右条带。可能为目的条带。取可能正确的重组质粒。测序分析。3.1.1.3穿梭质粒pSD55-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β),pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)以及pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的构建（一）用一步克隆法获得穿梭质粒pSD-IL-241.将pSD55载体.线性化pSD55经HindIII单酶切获得大片段。反应如下：PSD5510μlHindIII1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μl37℃水浴3hr。核酸电泳。割胶回收目的载体片段。回收片段。进行去磷酸化反应。具体操作如下：回收片段30μl里加入1μlFastAP。37℃水浴10min，75℃，5min。再回收线性且去磷酸化质粒pSD55片段。2.插入片段扩增引物设计正链为上游载体末端同源序列加上基因正向序列，负链为基因反向序列加下游载体末端同源序列，再分别加上酶切位点，从而得到所需引物。15 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究含表达框IL-24Sense：5’-CCGAAGCTTATGAATTTTCAACAGAGGCT-3’含表达框IL-24Antisense：5’-CGCGGATCCTCAGAGCTTGTAGAATTTCT-3’3.插入片段PCR扩增pCA-IL-242μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μl含表达框IL-24sense2μl含表达框IL-24antisense2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μl4.进行重组反应冰上操作如下实验ddH2OUpto20μl5×CEIIBuffer2μl线性化克隆载体50～200ngIL-24扩增产物50～200ngExnaseTMII2μl20μl体系配制完成后。混匀，置于37℃反应30min。反应完成后。立即置于冰水浴中。冷却5min。得到的反应产物。可直接进行转化或可储存于-20℃。5.反应产物转化、涂板16 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究取10μl反应物。加入到100μl感受态细胞中。混匀，冰置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入500μlLB培养基中。37℃孵育10min。复苏后37℃摇45min。取100μl菌液。均匀涂布。于含有相应抗生素的LB上。将平板倒置20min。再正置于37℃过夜培养。.克隆PCR鉴定：阳性克隆2μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μlIL-24sense2μlIL-24antisense2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μl最终获得载体pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)载体。（二）用酶切法获得穿梭质粒pSD55-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)：1.pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)线性化反应如下：模板10μlBglII1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μl如上述将产物核酸电泳后去磷酸化，再回收得到pSD-IL-24片段。2.目的基因的获得利用引物通过PCR扩增出来的。具体的PCR体系如下：pCA-IFN-β2μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μl含表达框IFN-βsense2μl含表达框IFN-βantisense2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μl17 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45S，55℃退火30S，68℃延伸1min30sec，30个循环，12℃forever；PCR反应结束后加入MgCl24μl，dNTP0.5μl，Buffer0.5μl，KOD酶1μl，72℃延伸10min；反应结束。核酸电泳回收目的片段。3.回收产物连接回收的目的基因片段。与pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)大片段连接。反应体系如下：模板2μlPCR回收产物8μlLigationHighver.210μlTotalvolume20μl16℃水浴连接过夜。将连接产物转化DH5α感受态。涂含AMP板后。37℃培养12hr。挑取单克隆。在AMP的LB溶液中。37℃摇床扩增10hr。提质粒。鉴定筛选pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)阳性克隆。4.重组质粒鉴定分别利用HindIII以及BglII做酶切。具体的鉴定体系如下：阳性克隆20μlHindIII1μl10×TangoBuffer6μlddH2O3μlTotalvolume30μl阳性克隆20μlBglII1μl10×TangoBuffer6μlddH2O3μlTotalvolume30μl酶切。核酸电泳得到1100bp左右条带。可能为的目的条带。重组质粒测序分析。18 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究分别利用IL-24与IFN-β的引物。以及含表达框IL-24与含表达框IFN-β的引物。对pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的阳性克隆做PCR。具体的PCR体系如下：模板2μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μl相应正链引物2μl相应负链引物2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μlPCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45S，55℃退火30S，68℃延伸1min30sec，30个循环，12℃forever；PCR反应结束后加入MgCl24μl，dNTP0.5μl，Buffer0.5μl，KOD酶1μl，72℃延伸10min；将反应产物进行电泳。分别得到564bp，624bp，1045bp以及1105bp的片段。3.1.1.4pAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的构建将上述鉴定的产物。转入感受态pAdEasy-BJ5183：1.pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)线性化经PmeI单酶切获得大片段。反应如下：模板10μlPmeI1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μl37℃水浴3hr。核酸电泳后回收目的片段；回收片段。进行去磷酸化。操作步骤如上。回收得到线性且去磷酸化质粒pSD-IL-24-IFN-β片段。2.将上述产物分别对pAdEasy-BJ5183和DH5α进行转化。操作步骤如上。结果pAdEasy-BJ5183上出现阳性克隆。而DH5α板上没有或有很少克隆。挑选比中等大小克隆小些的克隆后摇菌鉴定。19 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究阳性克隆的鉴定：用MluI用于重组子的鉴定。酶切体系如下：pSD-IL-24-IFN-β10μlMluI1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μl鉴定成功的酶切得到五条目的条带。分别为1k，1.8k，4k，5.8k，20k左右。3.转入感受态DH5α由于质粒在BJ5183中并不稳定。不能用鉴定剩余的菌液接种摇菌或保菌。鉴定好的质粒再扩增需要转到DH5α当中。转化反应同上。阳性克隆的鉴定：用MluI用于重组子的鉴定。酶切体系如下：pSD-IL-24-IFN-β10μlMluI1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μl鉴定成功的酶切得到五条目的条带。分别为1k，1.8k，4k，5.8k，20k左右。取鉴定成功后提取的阳性克隆质粒。再次转化，并摇菌扩增与保菌。4.筛选的重组子用PacI线性化后。用于包相应病毒酶切体系如下：模板10μlPacI1μlBufferR2μlddH2O7μlTotalvolume20μlPacI酶切。将会得到约30kb的片段。另一个为3.0或4.5kb的小片段。20 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3.2病毒构建部分：OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒的包装、纯化、鉴定、大量扩增及病毒滴度测定3.2.1重组质粒构建及病毒同源重组示意图图2.2重组质粒构建及病毒同源重组示意图Fig.2.2Structureofrecombinantvector3.2.2贴壁细胞的培养贴壁细胞HEK293的培养（1）细胞复苏做好安全措施后，从液氮罐中取出冻存的细胞，在用37℃水浴迅速解冻。用酒精擦拭冻存管后。在超净台上酒精灯旁。将冻存管理的冻存液吸出。取相应的21 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究培液1mL将底部的细胞吹起。轻轻吹打混匀后，将其转移至含有培液的培养皿中。在37℃，5%CO2中进行培养；24hr后显微镜观察细胞。如果有必要需进行传代。（2）细胞传代用倒置显微镜观察细胞。确认细胞没有污染。移去培养瓶中的培养液。用PBS清洗单层细胞。一般两次即可。按1mL胰酶消化细胞。不同的细胞消化时间不同，一般情况下肿瘤细胞的消化时间要比正常细胞久。消化为单层细胞。倒出多余的胰蛋白酶。用含血清的培液终止反应。再转移于相应大小的离心管中。900rpm离心5min。离心后弃掉上层的培液。用1mL相应培液重悬。取出100~200μl用于计数。将所需数目的细胞移至一个另一培养皿中。选择适合培养条件培养细胞系。根据细胞系的生长特征重复该步骤。直到细胞状态良好、无污染。多余可以选择冻存。（细胞传代时。不要冲击到培养皿。以免引起细胞损伤。在吹吸混匀时，要注意力度。尽量减小对细胞的损害）。（3）细胞冻存配置相应容量的冻存液。于4℃冰箱中备用。用倒置显微镜观察细胞。确认细胞没有污染的情况下。移去培养瓶中的培养液。用PBS清洗单层细胞。一般两次即可。用1mL胰酶消化细胞。不同的细胞消化时间不同。一般情况下肿瘤细胞的消化时间要比正常细胞久。消化为单层细胞后，倒出多余的胰蛋白酶。用含血清的培养液终止反应。将培养名中的含有细胞的培液移于相应大小的离心管中。900rpm离心5min。离心后弃掉上层的培液。在冻存培养液中，以3×106个细胞/mL的密度重悬细胞。汲取1mL细胞悬液。转移至标记好的冻存管中。将冻存管放置在4℃冰箱30min。放入-20℃冰箱中2hr左右。再放入-80℃冰箱过夜。最后将冷冻的冻存管移于液氮中。并记录位置。（4）细胞计数用倒置显微镜观察细胞。确认细胞没有污染的情况下。弃掉培养液。用冷PBS洗单层细胞，一至两次。用1mL胰酶消化细胞。不同的细胞消化时间不同。一般情况下肿瘤细胞的消化时间要比正常细胞久。消化为单层细胞后。倒出多余的胰蛋白酶。用少量的含新鲜血清的培养液。将反应终止。将培养名中的含有细胞的22 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究培液取出。转移至相应大小的离心管中。900rpm离心5min。离心后去掉上层的培液。用1mL相应培液重悬。取出100~200μl用于计数。盖好盖玻片。取一套血球计数槽上。用酒精擦拭。确定计数板上没有残留的细胞。制备计数用的细胞悬液。将细胞悬液稀释一定的倍数。再将稀释后的细胞液打入血球计数板的凹槽中。用计数器记数四个方框内的细胞数。再按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/mL=（四个大格子细胞数/4）×2×104×相应稀释倍数（5）细胞的维持一般细胞复苏6h后即可贴壁。24h贴壁完全。大约每三天换一次液。其换液方法比较简单。即弃去旧液。加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内维持存活。但不需要增殖。此时要换成2%小牛血清的维持液。（6）细胞的铺板取对数生长期于10cmdish的肿瘤细胞。按上述操作消化计数后。以1×105/孔密度铺于24孔板。再用完全培养液补至2mL/孔。（铺板时要注意控制细胞浓度。细胞密度太高和太低都对细胞结果的观察有影响）3.2.3同源重组构建腺病毒将大量抽提的目的质粒pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)转染HEK293细胞，转染试剂采用QIAGEN公司的Effectene®TransfectionReagent，并严格按照操作过程进行：（1）实验前一天取6孔板。以每孔4×105HEK293细胞的铺板。（2）37℃，5%CO2。培养箱中培养至细胞密度70%左右。（3）转染当天，将1μgDNA加入150μl的BufferEC中。随后加入8μlEnhancer，用移液枪吹吸几次。（4）15-25℃孵育2-5min。加入25μlEffecteneTransfectionReagent。用移液枪吹吸5次混匀。（5）15-25℃孵育5-10min（6）将HEK293细胞用PBS清洗几次。然后在六孔板每孔加入1mL培液。（7）在孵育好的混合物中加入1mL培液。混匀。迅速加入6孔板内。混匀。（8）将未加样的孔作为空白对照。37℃，5%CO2培养箱中培育8-21d。观察细胞病变状况。23 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3.2.4病毒的纯化病毒的空斑纯化：因为同源重组会出现野生型病毒。铺低熔点胶固定细胞后。挑空斑从而将病毒与野生型病毒分离。将293细胞铺于24孔板。用不同浓度的病毒样品感染的293细胞。感染4hr，用相应培养液配制的低熔点胶。铺胶于平板上。4-5d后挑取分离良好的病毒空斑。再进行进一步PCR鉴定。重复三次后可以得到纯化的病毒。3.2.5病毒的鉴定（1）病毒DNA的抽提首先将收集的细胞反复冻融三次。取200μl病毒上清样品。加入5μl20mg/mL蛋白酶K，300μlddH2O。充分混匀。56℃水浴温育3hr。加入等体积的酚、氯仿、异戊醇。12000rpm，4℃，10min。取上清于EP管中。加入1/10体积的3MNaAC。2倍体积的无水乙醇。振荡充分混匀。并于-20℃放置10-20min。13500rpm/min10min，弃掉上清。加入1mL75%乙醇洗涤沉淀物，13500rpm/min10min。沉淀物自然风干，加入20μl1×RNase。37℃30min助溶。其间轻弹管壁。随后放-20℃冻存。可用于PCR分析。（2）PCR鉴定分别利用IL-24与IFN-β的引物。以及含表达框IL-24与含表达框IFN-β的引物。对pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)阳性克隆做PCR。具体的PCR体系如下：模板2μl10×KODbuffer5μldNTP4μlMgSO42.5μl相应正链引物2μl相应负链引物2μlKOD2μlddH2O30.5μlTotalvolume50μl24 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45S，55℃退火30S，68℃延伸1min30sec，30个循环，12℃forever；PCR反应结束后加入MgCl24μl，dNTP0.5μl，Buffer0.5μl，KOD酶1μl，72℃延伸10min；将反应产物进行电泳分别得到564bp，624bp，1045bp以及1105bp的片段。将相应的质粒测序鉴定。3.2.6病毒的滴度测定病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化：提前准备好灭过菌的试剂和用品。将293细胞铺于50个10cmdish。至细胞长满。每块板加入适量滴度的病毒（约107-108pfu/mL）10µl。感染细胞，待细胞病变后（3天），每个dish中加入约500µlNP40裂解液。以裂解细胞。收集整个细胞裂解物。12000rpm离心10min。弃细胞碎片，收集上清。每200mL上清加入100mLPEG8000（20%PEG8000，2.5MNaCl）。冰上1hr沉淀病毒。再12000rpm离心上述混合物20min。弃掉上清后，将沉淀物悬浮在10mL密度为1.10g/mL的CsCl溶液中（溶剂为20mMTris-Hcl，pH8.0）。4℃8000rpm离心5min。收集悬浮液。制备CsCl梯度。用滴管轻轻加入2.0mL的CsCl（密度1.40g/mL，溶剂同上）。再轻轻加入3.0mL密度为1.30g/mL的CsCl溶液。再轻轻加入5mL的病毒悬浮液。20000rpm，室温离心2hr。收集密度在1.30-1.40g/mL之间的病毒条带。至用EDTANa2煮沸10min透析袋的中。4℃透析过夜。中间换可以一次透析液。收集病毒测定病毒滴度。病毒滴度测定：空斑形成单位(pfu)的测定：加不同稀释的病毒于60mm培养皿。37℃条件下感染2hr后。铺8mL低熔点胶（5%FBS，1.25%Agarose）。9d左右记数。病毒颗粒（OPU）的测定：将CsCl离心纯化好的病毒。以适当倍数（OD值在0.1-1.0）稀释，测OD值(260nm)。估算病毒颗粒数(OPU)：OPU/mL=OD12260×稀释倍数×1.1×10。纯化得当的病毒的PFU同OPU的关系为：PFU/mL≈OPU/50。TCID50法测定腺病毒滴度。方法如下：25 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究293细胞按1×104/孔接种于96孔板中。接种24小时后。将不同稀释梯度的病毒液。加入孔中。每个稀释度加10个孔。设置3个孔为阴性对照。37℃5%CO2培养10天。观察每个稀释度细胞病变情况。按照Admax操作手册中的公式：T=101+d(s-0.5)计算病毒的滴度，计算出重组腺病毒的滴度。腺病毒滴度试剂盒测定滴度。方法如下：（1）选取状态良好的HEK293细胞。制备2.5×105个/ML的细胞悬液。24孔板每个孔中加1ML细胞。37℃、5%CO2培养1小时。（2）准备好8倍梯度稀释的病毒样品。每孔中分别加入100ΜL病毒样品。（3）37℃、5%CO2感染2天。（4）去除培养液。沿着侧壁轻轻加入预冷的甲醇0.5ML。-20℃固定15MIN（枪头不能要接触到细胞）。（5）用预冷的PBS轻轻的冲洗细胞3次。每次5MIN（切忌将细胞冲起）。（6）使用用PBS配置的1%BSA封闭1小时。（7）加入0.2ML的1×ANTI-HEXON抗体溶液至每个孔中，37℃孵育1小时。（8）用预冷的PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5MIN。（9）在每个孔中加入0.2ML1×辣根过氧化物酶标记的二抗。37℃孵育1小时。（10）用预冷的PBS轻轻的冲洗细胞3次。每次5MIN。（11）每个孔中加入0.2ML新配置的1×DAB工作液。室温孵育5-10MIN（孵育时间不要超过10MIN）。（12）弃DAB，使用PBS清洗2次。每孔加入1MLPBS。（13）每个孔随机选择5个视野。使用显微镜计算阳性细胞个数。（14）计算每孔阳性细胞的平均个数。以及相应的病毒滴度。3.3细胞实验部分：体外实验检查OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒对肿瘤的杀伤效果3.3.1.病毒基因的表达水平（一）Westernblot检测病毒携带外源基因的表达水平。26 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（1）收集样品：在六孔板中以每孔4×105的密度铺A549细胞。待细胞贴壁后。每孔分别加10MIO的目的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)。用不加病毒的细胞作空白对照。37℃，5%CO2培养24h后。吸掉细胞培养液，用预冷的PBS洗三次。向六孔板中加入含有100g/mLPMSF（PMSF为蛋白降解抑制剂，使用前加入）的裂解液100μl，冰上横放30min。可将其放于摇床上，使其反应更加充分（裂解液适量，可均匀覆盖细胞即可）。用细胞刮刀刮下裂解后的细胞。至于灭菌后的EP管。12000rpm，10min离心。收集上清于另一个灭菌后的EP管中。测定蛋白浓度。分装后-20℃保存备用。也可以立即用于PAGE凝胶电泳。（2）蛋白定量与预处理：BCA蛋白定量试剂盒比色法：先将BCA蛋白定量试剂A和B以50：1比例混合待用。取蛋白样品15μl。加入到45μlPBS中稀释4倍。在96孔板中加入150μl左右的AB混合液。每孔混合液中加入25μl蛋白样品。混匀（要做两个重复)，37℃温浴半小时，酶标仪检测。根据标准曲线计算蛋白浓度。电泳前蛋白的预处理：取适量的5×SDSloadingbuffer与蛋白样品混合。使其稀释到为1×SDSloadingbuffer，恒温金属浴95℃，10min，取出至于4℃备用。（3）SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳不同浓度分离胶的最佳分离范围参考下图：表2.3不同浓度分离胶最佳分离范围Table2.3OptimalseparationrangeofseparationgelSDS-PAGE分离胶最佳分离范围6%50-150KD8%30-90KD10%20-80KD12%12-60KD15%10-40KD27 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究根据目的条带的大小。选择适合浓度的SDS-PAGE分离胶。装好架子后用水检测是否漏液。在不会漏液的架子中配置分离胶。分离胶配好后在胶上面覆盖一层无水乙醇。这样可以去除气泡。并使分离胶的胶面平整。待分离胶凝集后。倒掉无水乙醇，待其蒸发后。配置相应浓度的浓缩胶，将浓缩胶缓慢加入其中。插入预先准备好的相应大小的梳子。本实验主要采用10%的分离胶。10％分离胶和4％浓缩胶配方如下：10％分离胶（两块胶，10mL）4％浓缩胶（两块胶，5mL）超纯水4.85mL3.16mL40％Acr/Bic（37.5：1）2.5mL0.5mL1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5mL－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26mL10％SDS100l50l10%AP（过硫酸胺）50l25lTEMED5l5l待胶凝集后，上样，电泳。浓缩胶用80V电压，当样品跑至分离胶时。改用用120V电压继续跑。直到溴酚蓝的染色部分跑至玻璃板的底部。一般电泳时间在1.5h左右。具体操作步骤如下：①清洗玻璃板：用少量的洗衣粉轻轻擦洗玻璃板。擦洗过后用自来水缓慢冲洗。再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干。②灌胶与上样1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。装好架子。用水检测是否漏液。然后垂直架在架子上准备灌胶。2按上述的配方配10％分离胶。加入TEMED（TEMED为凝固剂，是神经毒素，操作时要做好防护工作）。立即摇匀后向玻璃板的缝中灌胶。加到架子的固定线处。再加入无水乙醇，一段时间过后（因环境温度的不同，时间不同），摇晃架子。分离胶不摇晃时，说明胶已经凝固了。再等3min使胶充分凝固就倒掉无水乙醇。28 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3按上述方法配4％的浓缩胶。加入TEMED。立即摇匀并将其缓慢加入到分离胶上层（要避免出现气泡）。将剩余空间灌满浓缩胶。然后将梳子插入浓缩胶中。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固。可将玻璃板取出备用（也可暂时泡于水中于第二天用）4在电泳槽中加足够的电泳液。将玻璃板架好，轻轻的将梳子拔出。开始准备上样。（样品在加入前要混匀）③电转转移就是在电流的作用下。使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。我们选用PVDF膜湿转法。湿转主要操作流程：将电转专用夹置于预冷的电转液中，按照负极-海绵-两层滤纸-凝胶-PVDF膜-一层滤纸-海绵-正极的顺序将凝胶和PVDF膜固定（注意此过程中一定不能出现气泡，否则将影响图片的美观）。往湿转仪中倒入配置好的电转液。同时往电转仪中加入一块冰袋。400mA，90min转膜(按照条带大小来选择)。转膜过程中将整个电转仪至于冰上。以保证电转仪处于低温状态（因为电转会产生大量的热量，损害仪器和降低电转的质量）。转膜的电压和时间根据凝胶浓度，膜面积大小，蛋白大小不同而不同。本课题实验经验证，400mA，90min能很好的将蛋白转至膜上。④封闭封闭可以降低一抗的非特异结合的概率。常用的封闭液有BSA，脱脂奶粉等。我们一般用5%脱脂奶粉。预先配置好5%的脱脂奶粉(TBST溶解)。于4℃冰箱中备用。电转结束后，将膜取出（此步骤要十分小心，防止划到PVDF膜的表面）。将膜放入到脱脂奶粉中封闭(封闭室温2h)。⑤一抗孵育加入脱脂奶粉，使得终浓度为5%。加入0.01%的叠氮化钠防腐，并按照说明书的稀释比例将一抗稀释于混合液中。4℃冰箱放置，备用。封闭结束后将PVDF膜先用TBST洗膜两遍，去除残余的脱脂奶粉溶液。将PVDF膜放入一抗溶液孵育。室温2h也可以4℃孵育过夜。29 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究洗涤一抗孵育结束后，用TBST洗三遍，每遍5min。也可以缩短每次清洗时间，增加清洗次数。务必将多余的一抗溶液洗涤干净。洗涤的目的是为了让除去多余一抗。防止多余抗体与二抗结合，造成背景太高的现象。而影响扫描和结果与背景的清晰度。⑥二抗孵育将二抗原液按1:5000-10000的比例（不同的二抗稀释比例不同）用TBST稀释。4℃保存备用。将洗涤干净后的PVDF膜转入二抗溶液，摇床上室温孵育1h。洗涤二抗孵育结束后，用TBST洗涤三次，每次5min。也可以增加洗涤次数，减少每次洗涤时间。确保多余二抗被洗涤干净。防止多余的二抗造成背景太高的现象。影响扫描和结果与背景的清晰度。⑦扫膜准备好显影液AB，按1:1的比例混匀于避光的管中备用。在暗室的环境下，将PVDF膜平行放于板上）（要防止气泡的产生，否则影响结果）。吸走多余的TBST后，将显影液均匀的滴加于膜面。使其全面覆盖膜面，放入扫膜仪后扫膜，拍照的到条带效果图。扫描结束后保存结果，用于实验数据的对比。（二）Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达水平。按照每孔4×105个细胞。铺对数生长期的A549细胞于6孔板，过夜培养后加入10MOI的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，5%CO2，37℃培养箱培养48小时后，如上文方法Westernblot检测caspase3，PARP的剪接水平。30 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究3.3.2MTT法检测细胞存活率按1×104cells/well将对数生长期的肿瘤或正常细胞。植入96孔培养板，待细胞贴壁上后。按0.5、1、2、5、10、50MOI的浓度梯度加入空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，37℃培养72小时后，每孔加入20μlMTT（50μg/mL，配制于PBS缓冲液中），使MTT终浓度为5mg/mL。37℃培养4hr后。每孔再加入150μlDMSO。微量振荡器振荡15min。在酶标仪上测定OD490与OD570。实验中实验孔周围孔中应加入PBS防止实验孔的培液蒸发，影响最终的数据。并且需要设置不加细胞的孔作为空白对照。细胞存活率按以下公式计算：细胞生存率=（OD病毒感染孔-OD调零孔）/（OD对照孔-OD调零孔）×100%，进而计算细胞生存率。再讲所计算的数据以细胞生存率为纵轴，浓度为横轴，绘制细胞生长活力曲线。3.3.3细胞病变效应（CPE）实验正常细胞与肿瘤细胞。以1×105铺于24孔板，待细胞贴壁后按0.1、0.5、1、5、10MOI的浓度梯度加入空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)感染细胞，以不加病毒组作为对照。37℃继续培养72hr后。吸净培养基，用预冷的甲醇固定10Min。弃甲醇，每孔加入500μl提前配置好的结晶紫染色液。（2％结晶紫溶于20％甲醇溶液）染色30min。用预冷的PBS将多余的染液洗净，拍照。3.3.4凋亡细胞染色实验：Hoechst33342染色细胞凋亡是指基因调控的细胞自主性有序死亡。是生物为了保证生存。保持整体对内外环境变化的适应能力。维持其正常的发育而发生的细胞选择性死亡。是个主动的过程。也称程序性细胞死亡（PCD）。细胞凋亡的过程。在形态学上可以分为三个阶段。凋亡的起始：细胞皱缩。细胞接连消失。内质网膨胀。染色体固缩。并沿着核膜分布。但细胞膜依然完整。凋亡小体的形成：核膜破裂。31 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究染色体断裂为大小不等的片段。与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围。在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起。这些突起叫做凋亡小体。细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离。脱落至细胞间质。最终被周围的细胞吞噬并消化。5cells/well。将对数生长期的肝癌细胞植入24孔培养板。37℃5%CO按1×102培养箱中培养24hr。用10MOI的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)处理各种细胞，以不加病毒组作为对照。72hr后，加入5μl，1mg/mL的Hoechst33342，37℃孵育30min，在荧光显微镜下观察细胞核的变化。3.3.5Annexin/PI双染色法检测细胞凋亡（1）900rpm5min离心。弃上清，收集细胞。用预冷PBS洗细胞两次。（2）用孵育缓冲液（10mmol/LHEPES/NaOH，PH7.4，140mmol/LNaCl，5mmol/LCaCl2）洗涤1次，500~1000r/min离心5min。（3）用200-400ul的标记溶液（分别以终浓度为1ug/mL的量将FITC-AnnexinV和PI加入到孵育缓冲液中，）重悬细胞。室温下避光孵育15min。（4）1000r/min离心5min。沉淀细胞孵育。用PBS缓冲液洗1次。（5）加入荧光溶液。4℃下孵育20min。避光，室温下不时振动。（6）流式细胞仪分析：用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光。另一波长大于560nm的滤器检测PI。（流式细胞仪激发光波长用488nm）。（7）结果判断：细胞膜有损伤的细胞的DNA。可被PI着染从而激发荧光。而细胞膜保持完好的细胞则不会激发荧光。在双变量流式细胞仪的散点图上。左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）。左上象限是坏死细胞，为（FITC+/PI+）。而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。用BD流式细胞仪软件分析数据。32 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究4重组质粒的鉴定4.1目的基因IL-24与IFN-β的获得利用IL-24与IFN-β引物。在含有目的基因的载体上，通过PCR获得约624bp的IL-24与564bp的IFN-β的目的片段，PCR电泳图如下：123123图3.1目的基因IFN-β的PCR结果图3.2目的基因IL-24的PCR结果Fig.3.1ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIFN-β.Fig.3.2ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIL-24.泳道1：DNAMarker泳道2：IFN-βPCR产物泳道1：DNAMarker泳道2：IL-24PCR产物4.2重组质粒pCA13-IL-24与pCA13-IFN-β的鉴定IL-24与IFN-β的PCR产物与pCA13分别酶切。回收后得到约564bp的IFN-β和624bp的IL-24，以及约7000bp的PCA13载体大片段。并分别将目的基因与pCA13载体的TK区酶切连接，凝胶电泳鉴定如下：33 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究12345678图3.3PCA的酶切鉴定图Fig.3.3ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofPCA.泳道：DNAMarker泳道2-8：PCA的PCR产物123456123图3.4IFN-β的酶切鉴定图图3.5含IFN-β表达框的酶切鉴定图Fig.3.4ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIFN-β.Fig.3.5ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIFN-β.泳道4：DNAMarker泳道2-6：IFN-β的PCR产物泳道1：DNAMarker泳道2-3：含IFN-β表达框的PCR产物34 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究123456789123456图3.6IL-24酶切鉴定图图3.7含IL-24表达框的酶切鉴定图Fig.3.6ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIL-24.Fig.3.7ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIL-24.泳道1：DNAMarker泳道2-9：IL-24PCR产物泳道1：DNAMarker泳道2-6：含IL-24表达框的PCR产物4.3穿梭质粒pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)与pSD55-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的鉴定含表达框的IFN-β的PCR产物与PSD55经BglII单酶切。回收后得到约1045bp的含表达框的IFN-β片段。以及约6568bp的PSD55载体大片段。并将二者割胶回收并连接。含表达框的IL-24的PCR产物与PSD55经HindIII单酶切。回收后得到约1105bp的含表达框的IL-24片段。以及约9000bp的PSD55载体大片段。并将二者割胶回收并连接。凝胶电泳鉴定如图：12图3.8PSSD55的酶切鉴定图Fig.3.8ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofPSSD55.泳道1：DNAMarker泳道2：PSSD55的PCR产物35 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究1231234图3.9含IL-24表达框的酶切鉴定图图3.10含IFN-β表达框的酶切鉴定图Fig.3.9ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIL-24.Fig.3.10ElectrophoreticanalysisofPCRproductionofIFN-β.泳道1：DNAMarker泳道2-3：含IL-24表达框的的PCR产物泳道1：DNAMarker泳道2-4：含IFN-β表达框的PCR产物4.4穿梭质粒pSD55-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)与pSD55-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)转入BJ5183后重组质粒的鉴定（一）用PmeI酶切鉴定重组双基因的质粒载体。得到约10000bp的酶切产物。结果如图3.11：123图3.11PmeI的酶切后重组载体的鉴定图Fig.3.11ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道2-3：PmeI酶切后重组载体的PCR产物36 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（二）用MluI酶切鉴定四种重组基因的质粒载体。分别得到约1000bp，1800bp，4000bp，5800bp，20000bp的五条酶切产物条带，结果如图3.12：12345678910111213图3.12MluI酶切后重组载体的鉴定图Fig.3.12ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道2-13：MluI酶切后重组载体的PCR产物（三）用PacI酶切鉴定四种重组基因的质粒载体。分别得到约4500bp，30000bp的两条酶切产物条带，结果如图3.13：12345678图3.13PacI酶切后重组载体的鉴定图Fig.3.13ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道4-8：PacI酶切后重组载体的PCR产物37 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究5重组病毒的鉴定5.1细胞病变的形态学观察（A）（B）（C）(D)图3.14出病毒时的细胞病变图图A重组空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)图B重组单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)图C重组单基因病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)图D重组双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)在电镜下观察的图片。5.2PCR鉴定抽取重组病毒DNA。以病毒DNA为模板，通过PCR的方法，鉴定重组病毒是否含有目的基因。以及含表达框的目的基因。结果如下：（一）用IL-24与IFN-β的引物分别对空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)进行酶切，得到结果如图3.15：1234567891011图3.15IL-24与IFN-β酶切鉴定图Fig.3.15ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道2：阴性对照，泳道3:IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，38 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究泳道4:IL-24引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道5:IL-24引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，泳道6:IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，泳道7:IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道8:IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，泳道9:IFN-β引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道10:IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道11:IL-24阳性对照（二）用含IL-24与IFN-β表达框的引物分别对空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)进行酶切，得到结果如图3.16：1234567图3.16含表达框的IL-24与IFN-β酶切鉴定图Fig.3.16ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道2：IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道3：IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，泳道4:IFN-β引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道5:IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道6:IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55))，泳道7:IL-24引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)39 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究（三）用含IL-24与IFN-β表达框的引物分别对空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)进行酶切，得到结果如图3.17：123456图3.17含表达框的IL-24与IFN-β酶切鉴定图Fig.3.17ElectrophoreticanalysisofPCRproduction.泳道1：DNAMarker泳道2：IFN-β引物鉴定OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道3：IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，泳道4：IFN-β引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道5：IL-24引物鉴定OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，泳道6：IL-24阳性对照5.3Westernblot检测目的基因IL-24，IFN-β蛋白水平表达收集对数期肿瘤细胞Huh-7。以4×105接种至6孔板中，培养过夜。分别用10MOI的OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒处理细胞，以不加病毒的细胞作对照。5%CO2，37℃培养箱培养48小时。Westernblot检测。发现病毒感染的细胞里IL-24与IFN-β能有效的表达。40 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究图3.18Westernblot检测溶瘤腺病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)在Huh7细胞里的IL-24的表达水平图3.19Westernblot检测溶瘤腺病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)在Huh7细胞里的IFN-β的表达水平41 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究6体外实验证明溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果6.1MTT法检测目的病毒的肿瘤杀伤性与安全性OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)四种病毒以不同的MOI（1，5，10）处理不同癌细胞与正常细胞（7721，SW480，7404，Huh-7，L02）。48与72小时后MTT检测对细胞的杀伤作用。结果如下图3.20，对不同的细胞，不同的病毒杀伤效果不一样，对肝癌细胞Huh-7效果比较显著，但对肝正常细胞L02的毒性小。42 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究图3.20MTT检测溶瘤腺病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)对癌细胞的毒性与对正常细胞的安全性Fig.3.20CellviabilityandsecuritydetectionoflivercancercellsandnormalcellsinfectedwithOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)byMTTassay.6.2结晶紫实验检测细胞病变现象按1×105/孔的密度。将上述四种肿瘤细胞分别铺24孔板。24hr后细胞贴壁，分别以0.1、1、5、10MOI的浓度梯度加入OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)感染细胞。以不加病毒组作为对照，72h后染色观察。实验结果如图3.21所示。重组病毒对癌细胞杀伤效应大。说明IL-24和IFN-β具有较好的肿瘤抑制效果。43 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究图3.21结晶紫实验检测细胞病变效应Fig.3.21CytotoxcitycomparisonoflungcancercellsandnormalcellsinfectedwithOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)andOncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)bycrystalvioletstaining.6.3Hoechst33342染色观察细胞凋亡现象分别加入10MOI的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)病毒感染上述四种细胞，72hr后。加入5μl，1mg/mL的Hoechst33342。在荧光显微镜下观察细胞核的变化。结果如图3.22所示。加入对照病毒与目的病毒72小时后。肿瘤细胞的细胞核出现细胞核浓缩。染色质分裂等凋亡特征。凋亡小体明显出现。44 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究(A)(B)(C)(D)(E)7721Huh77404SW480图3.22Hochest33342染色观察细胞凋亡现象Fig.3.22ApoptosisdetectionbyHoechst33342staining(A)Control（未加病毒）(B)OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)(C)OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)(D)OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)(E)OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)6.4AnnexinⅤ/PI流式检测细胞凋亡现象AnnexinV分子量为35~36KD。它是Ca2+依赖性磷酸脂结合蛋白。可以特异性的结合细胞内膜特有的磷脂酰丝氨酸（PS）。细胞正常形态下。AnnexinV无法穿45 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究过细胞膜。当细胞发生早期凋亡时。细胞膜外翻从而暴露PS。带FITC荧光标签的AnnexinV结合到细胞内膜上。此时FITC的荧光强度与细胞早期凋亡的比例呈正相关。同时碘化丙啶（PI）作为一种核酸染料。可以将细胞核着色。它不透过完整的细胞膜。但能将凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞核染红。因此AnnexinV-FITC-PI双染后。通过流式细胞仪对荧光进行分析。可以推测细胞的凋亡状况。用10MOI的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)的病毒分别处理HuH-7细胞，培养48小时，按说明书双染后用流式细胞仪检测荧光状况如图3.23所示。实验结果表明，四种病毒在感染48小时后均引起了Huh-7细胞的凋亡。FITC-A(A)(B)(C)FITC-A(D)(E)图3.23：AnnexinV-FITC-PI双染检测病毒感染后Huh-7凋亡的结果（A）加入等量完全培养基的对照组；（B）加入10MOI的OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)；（C）加入10MOI的OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)；（D）加入10MOI的OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)；（E）加入10MOI的OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)46 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究6.5Westernblot检测caspase通路变化细胞凋亡有两条主要通路。分别是死亡受体介导的凋亡途径（外在途径）和线粒体凋亡途径（内在途径）。虽然它们上游事件不同。但最终都要激活共同凋亡效应物。即特异的胱冬酶（caspase）。细胞凋亡受到严格调控。在正常细胞中caspase处于非活化的酶原状态。凋亡程序一旦开始，caspase被活化。随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应。引发不可逆的凋亡。按4×105每孔将Huh-7细胞接种至6孔板中，过夜培养后分别用10MOI的空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)处理细胞，5%CO2，37℃培养箱分别培养48小时。收取蛋白。Westernblot检测caspase3以及PARP的表达。结果如图：图3.24空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)以及双基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)通过激活caspase通路诱导细胞凋亡Fig.3.24ActivationofcaspasesignalpathwaybyOncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)，OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)andOncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)virus.47 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究7结果讨论癌症已成为威胁人类健康与生命的头号疾病，近半个世纪以来，世界上许多国家的癌症发病毒逐年上升。由于恶性肿瘤生长快，表面没有包膜。局部浸润明显，并且种类多样。为治疗癌症带来了巨大的难题，现如今世界各地的科学家们都在为攻克癌症，造福人类而不懈努力。其中肝癌已经成为许多国家癌症发病毒极高的癌症之一，尤其在中国，由于食品，环境等影响，肝癌病例更是占到了全球肝癌新增病例的一半，治疗肝癌的刻不容缓。目前对于肝癌治疗的研究已经进入分子水平。随着分子生物学的快速发展和基因工程技术的日臻成熟。肝癌的基因治疗已经迅速发展成为继手术切除、放化疗和介入治疗之后一个新的治疗模式。虽然已有许多将目的基因转入活细胞的方法。但仍存在转移效率不高、靶向性不高的问题。随着精准医疗的提出和生物医学研究的深入发展，科研工作者逐渐意识到单靠基因或者病毒来治疗癌症是极其困难的。在本实验室前期的工作中，研究了携带不同的单基因的腺病毒对于不同肿瘤的杀伤效果，如TSLC1、Smac、IL-24等等，后来进一步的研究了携带有连接子连接的双基因的腺病毒对于肿瘤的治疗效果，在本实验研究中，我们采用CTGVT策略。利用癌症特异性Survivin启动子的优势，同时将E1B区的55bp（∆55）碱基删除，使得病毒更具有靶向性，在这种结构优化的基础上，我们选用经大量研究证明的具有良好治疗肿瘤能力的基因IL-24与IFN-β，采用新型Adeasy腺病毒构建系统，利用含有腺病毒大部分基因组的BJ5183，将共转化改为两步转化，提高转化的成功率，进而通过向腺病毒TK区插入这两种治疗基因，从而增强溶瘤腺病毒对于癌细胞的杀伤效果，病毒靶向到肿瘤细胞并在其中大量复制的同时，携带的治疗基因IL-24与IFN-β也同时大量的复制，从而大大提高了抗癌效果，进而靶向治疗肿瘤。经过反复实验，我们成功的构建一个双靶向溶瘤腺病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)。以及空载病毒OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)，单基因病毒OncoAd-(IL-24)-surp-E1A-E1B(∆55)和OncoAd-surp-E1A-E1B(∆55)-(IFN-β)作为对照。经过后续的细胞实验，我们得出结论。以Survivin启动子启动的携带有IL-24与IFN-β基因的溶瘤腺病毒对肿瘤细胞，尤其是肝癌细胞具有一定的杀伤作用。能有效地抑制肝癌细胞的增殖，并诱导其凋亡。携带IFN-β基因的腺病毒对于肿48 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究瘤的杀伤效果尤为显著。靶向双基因溶瘤腺病毒的抗癌效果和相关的有效实验还需要继续去积累，去探索，去总结，去沉淀，本研究推进了双基因溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤相关方面的研究。为进一步运用靶向基因-病毒治疗肝癌提供了一个很有力的证据，为未来的临床应用研究抛砖引玉，并为IL-24与IFN-β在肝癌研究领域里开拓一个远大的应用前景。49 浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究参考文献[1]SiegelR,MaJ,ZouZ,JemalA.Cancerstatistics[J].CA:acancerjournalforclinicians,2014,64(1):9-29.[2]ReyaT,MorrisonSJ,ClarkeMF,WeissmanIL.Stemcells,cancer,andcancerstemcells[J].nature,2001,414(6859):105-111.[3]VisvaderJE,LindemanGJ.Cancerstemcells:Currentstatusandevolvingcomplexities[J].Cellstemcell,2012,10(6):717-728.[4]QinLX,SunHC,TangZY.Progressinresearchofprimaryhepaticcarcinoma,TheSummaryofShanghai-HongKongInternationalLiverCongress[J].ChinJSurg,2006,44(15):1070−1074.[5]ShariffMI,CoxIJ,GomaaAI,etal.Hepatocellularcarcinoma:currenttrendsinworldwideepidemiology,riskfactors,diagnosisandtherapeutics[J].ExpertRevGastroenterolHepatol,2009,3(4):353−367.[6]LiuL,CaoY,ChenC,etal.SorafenibblockstheRAF/MEK/ERKpathway,inhibitstumorangiogenesis,andinducestumorcellapoptosisinhepatocelularcarcinomamodelPLC/PRF/5[J].CancerRes,2006,66(24):11851-11858.[7]StrumbergD,RichlyH,HilgerRA,etal.PhaseIclinicalandoftheNovelRafkinaseandvascularendo-thelialgrowthfactorreceptorinhibitorBAY43-9006inpatientswithadvancedrefractorysolidtumors[J].JournalofClinicalOncology,2005,23(5):965-972.[8]Abou-AlfaGK,SchwartzL,RicciS,etal.PhaseⅡstudyofsor-afenibinpatientswithadvancedhepatocelularcarcinoma[J].JClinOncol,2006,24(26):4293-4300.[9]Abou-AlfaG,JohnsonP,KnoxJ,etal.PreliminaryresultsfromaPhaseⅡ,randomized,double-blindstudyofsorafenibplusdoxorubicinversusplaceboplusdoxorubicininpatientswithadvancedhepatocelularcarcinoma[J].EuropeanJournalofCancer,2007,5(Suppl):3500.[10]ZhuX,Sahani,DV,diTomasoE,etal.AphaseⅡstudyofSunitinibinpatientswithadvancedhepatocelularcarcinoma[J].JournalofClinicalOncology,2007,25(18Suppl):4637.[11]FaivreSJ,RaymondE,DouilardJ,etal.Assessmentofsafetyanddrug-inducedtumornecrosiswithsunitinibinpatients(pts)withunresectablehepatocellularcarcinoma(HCC)[J].JournalofClinicalOncology,2007,25(18Suppl):3546.[12]RamanathanR,BelaniC,SinghD,etal.PhaseⅡstudyoflapatinib,adualinhibitorofepidermalgrowthfactorreceptorEGFR)tyrosinekinase1and2(Her2/Neu)inpatients(pts)withadvancedbiliarytreecancer(BTC)orhepatocelularcancer(HCC).ACaliforniaConsortium(CCC-P)Trial[J].JournalofClinicalOncology,2006,24(18Suppl):4010.[13]Hegewisch-BeckerS,SterneckM,SchubertU,etal.PhaseI/Ⅱtrialofbortezomibinpatientswithunresectablehepatocelularcarcinoma(HCC)[J].JournalofClinicalOncology,2004,22(14Suppl):4089.[14]RizelM,CahlinC,OlaussonM,etal.mTORinhibitionafectsprimarylivercancer[J].JournalofClinicalOncology,2006,24(18Suppl):1406.[15]ArmbrustT,BaumhoerD,WernerJ,etal.Treatmentofhepato-celularcarcinoma(HCC)withthetyrosinekinaseinhibitorImatinib[J].JournalofClinicalOncology,2005,23(16Suppl):4210.[16]LlovetJ,RicciS,MazzaferoV,etal.Sorafenibimprovessurvivalinadvancedhepatocelularcarcinoma(HCC):ResultsofaphaseⅢrandomizedplacebo-controledtrial(SHARPtrial)[J].JournalofClinicalOncology,2007,25(18Suppl):LBA1.[17]RichlyH,HenningBF,KupschP,etal.ResultsofaPhaseItrialofsorafenib50 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浙江理工大学硕士学位论文携带IL-24及IFN-β双基因的溶瘤腺病毒靶向治疗癌症的研究致谢在论文即将画上句号的时候，回顾过去，转眼间，我的硕士生涯已接进尾声，这段科研经历让我感触颇多，也受益良多。首先我要由衷地感谢刘新垣院士对我科研及生活上无私的教诲和关心！刘院士他仍然坚持在科学研究的第一线，为科研事业献出自己毕生的精力，将是我永远的学习榜样！生活上，出国归来的糖果，圣诞节的礼物，让作为学生的我甚是感动,在此，谨向刘新垣院士致以最诚挚的祝福和感谢，由衷的希望您工作顺利，身体健康！其次我要感谢浙理工大学生科院新元所的所有老师和同学，感谢你们在生活和实验上真诚地帮助，在此，特别要感谢李恭楚老师、贾晓渊老师、王毅刚老师、周秀梅老师、吕春伟师兄和张新敏师姐，感谢他们在我研究课题的设计及论文写作方面给我的悉心指导；另外我还要感谢李亚姣，吴冰冰，秦云，赵珍珍，应畅，许婉彬，姚晨雪等同学以及谢文杰师弟与胡云师妹对我实验实施方面的支持与无私的帮助，特别感谢他们在生活和学习上所给于我的信心与信任。同时还要感谢浙江理工大学的各级领导为我们大家的学习和工作提供的良好的实验平台。再次感谢李恭楚老师对我科研实验上的极大帮助，感谢生命科学院所有其他的老师及科研中心的工作人员为我们实验的顺利开展所提供的帮助。最后，感谢在百忙之中抽出宝贵时间来参与本论文评阅和答辩的全体专家教授们，感谢你们对本论文的支持！53
