携带白介素24基因的双靶向溶瘤腺病毒特异性治疗胰腺癌的实验研究

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1、万方数据复旦大学博士生学位论文携带白介素24基因的双靶向溶瘤腺病毒特异性治疗胰腺癌的实验研究研究生姓名：匡天涛导师：靳大勇教授导师组成员：楼文辉主任医师王单松副主任医师万方数据目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5—1厶—jL一日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第一部分基因．病毒MUD55．IL．24的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21引言⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40讨{仓⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46第二部分MUD55．IL．24特异性杀伤胰腺癌细胞体外实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．59第三部分双调控病毒的体内安全性和抑制皮下移植瘤研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．62引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．62材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．66讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．73全文总结及讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯．．76参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82在学发表文章及奖励⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．108致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．109论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1lO论文使用授权声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯110万方数据携带白介素24基因的双靶向溶瘤腺病毒特异性治疗胰腺癌的实验研究中文摘要胰腺导管腺癌恶性程度高，缺乏早期诊断手段，多数患者确诊时无法切除，即便是根治性

5、切除，五年生存率亦不足20％。而传统的放化疗对胰腺癌作用有限，目前众多的新一代研究均关注于如何改善胰腺癌的预后。本课题，我们构建了一种携带白介素24(IL一24)基因的双靶向溶瘤腺病毒(MUD55一IL一24)，借以用于胰腺癌的实验研究。我们首先删除腺病毒在正常细胞内复制必需，而在肿瘤细胞中复制非必需的E1B一55K基因，使其能特异性的在肿瘤细胞内复制扩增。此外，我们注意到多数胰腺导管腺癌高表达MUCl，而正常胰腺组织不表达或低表达，这一现象提示MUCl基因转录启动子活性在胰腺导管腺癌细胞中活性较高，利用胰腺癌细胞的这一特性，采用基因重组方法，以M

6、UCl启动子代替腺病毒复制早期蛋白E1A基因的启动子，从而我们构建了这种能特异性地在胰腺导管腺癌细胞中复制增殖，溶解肿瘤细胞，而在正常细胞中复制能力较弱，毒副作用较小的病毒。为了增强这种双靶向溶瘤腺病毒的杀伤作用，我们将IL-24基因插入腺病毒基因组中构建病毒MUD55一IL一24，随着病毒的复制，IL-24也随之大量表达，从而发挥IL-24强大的抗肿瘤效应。本课题主要经过以下几方面研究：(1)构建、包装双调控溶瘤腺病毒及携带IL一24基因的双调控腺病毒并对其进行鉴定；(2)基因一病毒MUD55-IL-24体外特异性杀伤胰腺癌细胞能力研究；(3)M

7、UD55的体内安全性和MUD55一工L一24的抑制皮下移植肿瘤能力的研究。第一部分基因一病毒MUD55-IL-24的构建及鉴定目的：构建并包装双靶向溶瘤腺病毒及携带IL一24基因的双调控腺病毒方法：使用TRIzol抽提多种腺癌细胞、非腺癌肿瘤细胞及正常细胞的RNA，以1万方数据通用的反转录引物将所有的mRNA反转录成eDNA，使用实时定量PCR试剂盒RealtimeMasterMix对不同细胞内的MUCl水平进行定量，并以GAPDH作为内参，实行相对定量。以质粒pDRIVE03一DF3(h)v2为模板，PCR扩增出MUCl启动子，将其克隆进pGL3

8、-basic形成报告基因质粒pGL3一MUClp。将质粒pGL3一MUClp和内参质粒共转染入各种细胞系检测MUCl启动子