携带抑瘤基因IL24的rDNA区靶向载体构建及抑瘤效果的初步验证

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1、中图分类号UDC硕士学位论文学校代码密级携带抑瘤基因IL-24的rDNA区靶向载体构建及抑瘤效果的初步验证ConstructionofrDNATargetingVectorCarr'"TumorSnGeneIL．一‘andcarryinglumorSuppressorene24and—PreliminaryVerificationfortheInhibitoryEffect作者姓名：寸金涛学科专业：遗传学学院(系、所)：医学遗传学国家重点实验室导师：梁德生教授指导小组：刘雄吴副教授邬玲仟教授夏家辉院士论文答辩日期塑垦：墨：堑答辩委员会主中南大学二。一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位

2、论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：——年一月一日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中

3、国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：——导师签名——日期：——年一月一日硕士学位论文中文摘要携带抑瘤基因IL．24的rDNA区靶向载体构建及抑瘤效果的初步验证摘要近年来，随着人类对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗获得了突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟，获准进入临床试验的基因治疗药物逐年增多。其中载体和治疗基因的选择是其成功的关键；目前大部分基因治疗研究的载体都集中于病毒载体，我室从对双随体小染色体的研究出发，构建了一种非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体(pHrneo)，其后又改进构建了pHr2载体系统。我们前期研究结果表明该载

4、体系统能在细胞内安全且稳定表达外源基因。IL一24是一个既能抑制肿瘤生长，又可调节免疫系统的基因。多项研究显示IL-24具有广泛的抗肿瘤作用，所以利用该载体结合IL-24可能会是肿瘤基因治疗的一个新策略。目的：以pHrneo和pHr2两个载体构架为基础，构建能在细胞内稳定表达有生物学活性的工L一24蛋白的核糖体基因区靶向载体，并拟利用该载体对肿瘤的基因治疗进行探究。方法：1．载体的构建：PCR分别扩增IL一24基因、CMV启动子和CAG启动子后连入pEGFP—N1质粒，构成与EGFP融合或者非融合表达框，再分别连入pHrneo和pHr2构架，构建出分别以CMV和CAG为启动子的两套质粒。2

5、．构建完成的质粒用磷酸钙转染法转染293细胞，观察荧光表达情况并通过ELISA检测IL一24蛋白的表达情况。3．G418筛选转染的细胞，以获得能稳定表达IL一24蛋白的单克隆细胞。再利硕士学位论文中文摘要用Transwell技术分别与乳腺癌细胞及胶质瘤细胞共培养，用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果：1．通过酶切和测序鉴定，表明成功将融合了EGFP蛋白和非融合EGFP蛋白的工L一24基因表达框插入到pHrneo和pHr2构架2．利用磷酸钙转染法将构建完成的质粒转入293细胞，以CMV为启动子的质粒，转染24h后即可观察到绿色荧光蛋白的表达。48h后收集混合克隆上清用ELISA进行初步检

6、测，可检测到高达123．396±i0．397ng／ml的IL-24蛋白浓度。而以CAG为启动子的质粒未见绿色荧光蛋白和未检测到IL-24蛋白的表达。3．用高浓度的G418筛选转染以CMV为启动子的实验组细胞获得稳定转染的单克隆，收集上清用ELISA可检测到高达834．963±138．11ing／ml的IL一24蛋白。4．通过ELISA结果挑选出高表达工L一24蛋白的细胞克隆与乳腺癌细胞(MCF一7)共培养后，凋亡率为6．74％明显高于对照组1．34％(p<0．01)，但是与胶质瘤细胞(GBM-U251)共培养的实验组未见凋亡率显著升高(p>0．05)。结论：成功的构建了携带抑瘤基因IL-2

7、4的rDNA区靶向载体，初步验证该载体能把IL一24基因导入到细胞内，并在细胞内稳定表达分泌有活性的IL一24蛋白，为后续的结合干细胞打靶对肿瘤基因治疗研究打下基础。关键词：核糖体基因区靶向载体；IL一24基因；乳腺癌细胞；胶质瘤细胞；肿瘤基因治疗硕士学位论文英文摘要ConstructionofrDNATargetingVectorCarryingTumorSuppressorGeneIL-24andPreliminar