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《系统性红斑狼疮病人血浆miRNAs差异表达谱研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ４密级公开ＵＤＣ６１０编号１０５５５名考４梦同等学力硕士学位论文（学术学位）系统性红斑狼疮病人血浆ｍｉＲＮＡｓ差异表达谱研究研究生姓名：曾小春指导教师、职称：廖湘平教授学科专业：临床医学（内科学）研究方向：肾脏病学所在学院：南华大学附属郴州医院一所在单位：郴州市第人民医院二〇一七年五月■＇乂ｙ．．．．－．：ｌ．ｖｖ． 考４孳ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡ系统性红斑狼疮病人血浆ｍｉＲＮＡｓ差异表达谱研究论文作者签名：曾小春指导教师签名：廖湘平濟為Ｈ，论文评阅人１：江亚芳教授博导广州军区武汉总医院评阅人２：任星峰主任医师硕导广州军区武汉总医院评阅人３：李芬主任医师硕导中南大学附属湘雅二医院答辩委员会主席：张浩教授博导中南大学附属湘雅三医院委员１：罗卉副教授中南大学附属湘雅医院委员２：李海鹏主任医师硕导南华大学附属郴州医院委员３：瞿小旺研究员硕导南华大学附属郴州医院委员４：欧文胜副主仟医师硕导南华大学附属郴州医院委员５：答辩日期：２０１７年５月１９日 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：冷南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博／硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研宄成果归南华大学所有，本论文的研宄内容不得以其它单位。、的名义发表本人同意南华大学有关保使用学位论文的规定，：留即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查和借学校可以公布学位论文阅阅；的全部或，可以采用复部分内容印、缩印或其它手段保论文；学校可根据国留学位家或湖南送交学位论文。－《省有关部门规定意学校将论文加入中士同国优秀博硕学位论文全文数据库》，并按《国出》中优秀博硕士学位论文全文数据库版章程规定享受相关权益。同意授权国科《中学信息技术研宄所将本学位论文收录到中论文全文数，通过。国学位据库》并网络向社会公众提供信息服务对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。＾＾作者签：名日ｈ＾々导师签名：日＾＾ 目录摘要..............................................................................................................IAbstract..................................................................................................III主要缩略英文索引.................................................................................VII第一章引言............................................................................................11.1系统性红斑狼疮发病与研究现状..............................................11.2miRNA与系统性红斑狼疮...........................................................21.3miRNA芯片检测技术...................................................................31.4研究内容.......................................................................................3第2章材料与方法...................................................................................52.1材料.............................................................................................52.1.1标本收集及临床资料.......................................................52.1.2试剂..................................................................................52.1.3仪器设备............................................................................52.2实验方法.....................................................................................52.2.1血浆样本收集....................................................................52.2.2基因芯片检测.....................................................................52.2.3qRT-PCR检测miRNA.......................................................62.2.4生物信息学学分析...........................................................72.2.5统计分析............................................................................7第3章结果................................................................................................93.1总RNA质量合格判断................................................................9 3.2基因芯片扫描结果......................................................................93.3基因芯片检测到的差异表达miRNAs.........................................93.4miRNAs差异表达谱的聚类分析(Cluster)...........................123.5qRT-PCR检测miR-21，miR-146a表达水平.........................143.6miR-21和miR-146a生物信息学分析...................................15第4章讨论..............................................................................................194.1SLE研究现状..............................................................................194.2SLE与miRNA研究进展.............................................................194.3生物信息学分析基因芯片结果................................................21第5章结论..........................................................................................23参考文献....................................................................................................25综述............................................................................................................33在读期间发表的论文...............................................................................43致谢........................................................................................................45 系统性红斑狼疮病人血浆miRNA差异表达谱研究摘要：目的：通过基因芯片技术获得系统性红斑狼疮病人和健康人血浆中miRNA差异表达谱，以获得用于诊断和治疗系统性红斑狼疮的分子标记物。方法：收集18例系统性红斑狼疮病人和10例健康人的血浆标本，分别提取总RNA；采用miRNA基因芯片技术检测统性红斑狼疮病人和健康人血浆中差异表达的miRNA；选取表达差异最大两个miRNAs，通过qRT-PCR技术检其表达水平，并与基因芯片结果进行对比，分析这两个miRNAs在系统性红斑狼疮的发生发展中的作用。通过生物信息学方法分析这两个miRNAs所分别调控的靶基因和信号通路。结果：1.获得系统性红斑狼疮病人的miRNA差异表达谱。SLE病人血浆中有35个miRNAs表达上调，上调倍数最大的为miR-21，上调26.1235倍；有14个miRNAs表达下调，下调倍数最大的为miR-146a，下调0.0512倍。2.18例SLE病人中，miR-21的相对平均值为33.5±2.2，10例健康人中，miR-21的相对平均值为2.8±0.5，上调倍数为11.9642倍；18例SLE病人中，miR-146a的相对平均值为1.3±0.1，10例健康人中，miR-146a的相对平均值为5.7±1.3，下调倍数为0.2281倍。I 3.miR-21、miR-146a在qRT-PCR检测中的结果与基因芯片中的表达趋势一致，说明基因芯片结果是可靠的。4.生物信息学分析发现，miR-21调控的靶基因有307个，涉及到的信号通路主要有：EGF、TGF-beta、MAPK、Jak-STAT、神经营养因子信号通路等；miR-146a调控的靶基因有224个，涉及到的信号通路主要有：MAPK、Notch、Fas信号通路等。结论：1.获得了SLE病人的miRNAs差异表达谱，在SLE血浆中，上调的miRNAs有35个，下调的miRNAs有14个。2.SLE病人中，上调倍数最大的为miR-21；下调倍数最大的为miR-146a，两者RT-PCR检测结果与基因芯片结果一致。3.miR-21和miR-146a可能在SLE发生发展中具有重要作用。关键词：系统性红斑狼疮，miRNA差异表达谱，基因芯片，miR-21，miR-146a,生物信息学II STUDYONTHEDIFFERENTIALEXPRESSIONPROFILESOFmiRNAsINPLASMAOFPATIENTSWITHSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSZengXiaochunDirectedbyLiaoXiangpingAbstract:Objective:TheDifferentialexpressionprofilesofmiRNAsofplasmaofpatientswithSystemiclupuserythematosus(SLE)andhealthypersonswereobtainedbymiRNAchiptechnology.InordertoobtainthebiomarkersfordiagnosisandtreatmentofSLE.Methods:QiagenreagentwasusedtoobtainedtotalRNAfromtheplasmaof18patientswithSLEand10healthyindividuals.miRNAchipwasusedtodetectthedifferentialexpressionofmiRNAsinplasmaofpatientswithSLEandhealthypeople.TheexpressionleveloftwomiRNAswiththelargestdifferenceweredetectedbyqRT-PCR.Andcomparetotheresultofgenechip.ToseetheroleofthetwomiRNAsinoccurenceanddevelopmentofSLE.Results:1.ThedifferentiallyexpressionprofilesofmiRNAsofpatientswithSLEwereobtained.InSLEpatients,thenumberofsignificantlyupregulatedmiRNAswere35,miR-21hasthebiggesttimesofupregulationwith26.1235times.ThenumberofsignificantlydownrIII egulatedmiRNAswere14.miR-146ahasthebiggesttimesofdownregulationwith0.0512times.2.In18patientswithSLE,therelativemeanvaluesofmiR-21were33.5±2.2and2.8±0.5in10casesofhealthyindividuals,theupregulatedtimeswere11.9642.In18casesofSLEpatients,therelativemeanvaluesofmiR-146awere0.3±0.1and5.7±1.3in10casesofhealthyindividuals,thedownregulatedtimeswere0.2281.3.TheresultsofmiR-21andmiR-146ainqRT-PCRwereconsistentwiththoseofgenechip,whichindicatedthattheresultofgenechipwerereliable.4.BioinformaticsanalysisshowedthatthenumbeoftargetgenesofmiR-21were307andthatinvolvedsignalingpathwaysincludingEGF,TGF-beta,MAPK,Jak-STATandneurotrophicfactorsignalingpathways;thenumbeoftargetgenesofmiR-146awere224andthatinvolvedsignalingpathwaysincludingMAPK,NotchandFassignalingpathways.Conclusion:1.ThemiRNAsdifferentialexpressionprofileswereobtained.IntheSLEplasma,thenumberofsignificantlyupregulatedmiRNAswere35,andthenumberofsignificantlydownregulatedmiRNAswere14.2.IntheSLEpatients，miR-21hasthebiggesttimesofupregulationandmiR-146ahasthebiggesttimesofdownregulation.TheresultsofRT-PCRoftwomiRNAswasconsistentwiththatofgenechip.IV 3.miR-146aandmiR-21mayplayanimportantrolesintheoccurrenceanddevelopmentofSLE.Keywords:SLE;miRNAdifferentialexpressionprofile;Genechip;miR-21;miR-146a;BioinfomaticsV 主要缩略英文索引简写英文名称中文名称cDNAComplementaryDNA互补DNAEDTAEthylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸Genechip基因芯片mRNAMessengerRNA信使核糖核酸miRNAmicroRNA非编码小RNAILInterleukin白细胞介素IFNInterferon干扰素(IFN)qRT-PCRReal-timefluorescencequantitative实时荧光定量PCRreversetranscriptionpolymerasechainSLESystemiclupuserythematosus系统性红斑狼疮TGF-1transforminggrowthfactor-1转化生长因子1VII 第1章引言第1章引言1.1系统性红斑狼疮发病与研究现状系统性红斑狼疮(SLE)是一种临床上常见的自身免疫性疾病，是结缔组织相关性疾病中，最常见的疾病之一。SLE往往影响到多个器官和系统的生理功能，主要是导致机体出现免疫功能障碍。主要是影响皮肤、关节、脏器以及中枢神经系统等组织和器官[1,2]。SLE发病的分子机制很复杂，目前尚未完全阐明，研究认为，SLE主要是与细胞因子的表达失衡有关。研究发现，SLE患者血浆中，干扰素(IFN)和转化生长因子(TGF-1)的表达水平明显降低，而白细胞介素-6(IL-6)和IL-17的表达明显增高[3,4]。由于SLE发病过程中往往累及多个系统和器官，造成多器官、多脏器受损，故该病的预后往往较差。目前，随着诊疗技术的进一步提高，特别是糖皮质激素的应用，SLE的预后已经改善了很多[5,6]。研究发现，SLE的的预后和许多因素有关，如：性别、发病时间、是否累及心血管系统、肾脏系统、神经系统等[7,8]，这些因素都是影响SLE预后的因子，其中，国内SLE患者，临床上以出现肾脏受累，是其预后不良的主要因素之一[9,10]。因此，如何早期诊断，以及判断SLE的预后，具有重要的临床意义。目前，SLE的主要治疗手段，临床主要应用糖皮质激素和免疫抑制剂联合治疗。临床上主要通过用最小剂量的糖皮质激素来控制SLE，同时持续应用免疫抑制剂，进行联合治疗，改善SLE的症状[11,12]。通过对患者进行轻、中、重度分级，采用个体化治疗的方法，使得大部分SLE患者的预后能够得以改善和痊愈，但是，对于临床上一些重症SLE患者，由于病情的发展很快，加上往往病情严重，出现有多器官受累表现，导致疗效不佳[13]。因此，开发新的靶向治疗药物，寻找SLE预后生物标记物，是目前SLE研究当中的热点和重点。新型生物制剂的研发是SLE治疗中主要突破方向。目前，已有贝利木单抗(抗B细胞活化因子BAFF单抗)和利妥昔单抗(抗CD20单抗)靶向治疗方法已经获准用于SLE的临床治疗，目前针对这些药物有效性和安全性的大型临床Ⅲ期随机对照试验正在进行中，有望不久后进入临床治疗[14,15]。研究发现，SLE患者往往1 南华大学硕士学位论文出现有间充质细胞紊乱，增殖速度较正常人慢。近年来，间充质细胞移植已经应用于许多自身免疫性疾病的治疗当中，包括难治性SLE[16]。此外，基因靶向治疗SLE应该是最有发展前景的生物治疗方法，不过由于引起SLE的发病的基因目前尚不明确，所以很多的基因治疗尚还处于初步的研究阶段。Kyttaris等[17]通过使用基因靶向治疗技术在动物模型中治疗SLE，可以有效的治疗SLE。基因治疗SLE目前SLE研究的一个重要方向，为未来彻底治愈SLE带来了新的研究方向和希望。而基因的靶向调控主要受miRNA、lncRNA等非编码RNA分子的调控，研究miRNA、lncRNA等非编码RNA分子在SLE诊断和治疗中的作用具有重要的指导意义[18,19]。也是本研究的研究方向。1.2miRNA与系统性红斑狼疮microRNA(miRNA)是一类生物体内的小分子单链非编码RNA，长度大约19-23个核苷酸，它不能编码和转录蛋白质，都是能够参与机体的多种的生物学过程[20,21]。miRNA通过与靶基因的3'非编码区（UTR）结合，使mRNA降解，或抑制mRNA的翻译，从而引起基因沉默或降解[22,23]。许多研究表明，miRNA参与了SLE发病的过程，在SLE的发生发展中起着重要的作用[24,25]。在免疫系统方面，miRNA主要通过以下几个方面来调控免疫性疾病的发生发展[26-28]，如：调控系统的免疫反应；促进免疫细胞的发展和分化；调控免疫细胞的信号通路；调节T淋巴细胞的稳定性及功能。已有的研究表明，miRNA与自身免疫性疾病发生发展密切相关。近年来的研究发现，有关miRNA参与及调控SLE发病机制的相关研究越来越多，为探索和研究SLE发病机制的开启了新的思路[29,30]。对于SLE发病中miRNA作用机制的研究以及生物靶标的确定,可为开发SLE的新型靶向药物提供了新的方向和新思路。miRNA在参与SLE发生发展中具有重要作用，但是，目前主要的一些研究都还是处于比较粗略的状态，通过对单个miRNA的研究来观察miRNA与SLE的关系，具有一定的局限性。目前，SLE的诊断在临床上，仍然缺乏可靠的生物标志物。研究发现，SLE患者的外周血白细胞中，与健康人比较，miRNAs存在表达差异[31]。另一项研究表明，系统性红斑狼疮患者循环体液中存在着miRNAs的改变，其中有4个miRNAs可被用于诊断SLE[32]。这些研究主要集中在外周血中的粒细胞和淋巴细胞当中，2 第1章引言而关于miRNAs在SLE外周血血浆中的差异表达研究尚未见报道。由于miRNAs在外周血血浆当中的性质比较稳定，容易检测，收集和处理标本比较简单[33,34]。因此，检测SLE患者外周血血浆当中的差异miRNAs，可望用于临床上SLE患者进行早期诊断和预后判断，这也是本研究的创新之处。1.3miRNA芯片检测技术基因芯片(Genechip)，又称DNA微阵列(Microarray)，通过将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度排列在生物载体上，用于检测基因或核酸片段。检测miRNA差异表达的基因芯片技术种类繁多，功效不一，其中，美国Affymetrix基因芯片（又叫昂飞芯片），是目前基因功能研究领域当中，应用最广泛的一种基因芯片[35,36]。具有重复性高、稳定性好的特点。miRNA基因芯片，是目前研究大规模miRNA差异表达谱的主要方法之一。miRNA芯片具有高度的灵敏性，可以检测到一个碱基的微小差异；具有较宽的动态监测范围，有利于检测到更宽程度范围的miRNA；探针具有高度的重复性，每个miRNA可重复约20次，使数据更为精准；其需要的RNA总量低[37,38]。所获得的大量数据可通过生物信息学方法进行归纳和分析，包括靶基因预测、信号通路分析、相互作用分析等，通过生物信息学方法，基因芯片的结果可以得到初步的归纳，为下一步实验指明了方向。目前，miRNA芯片检测在科研和临床研究中已经得到了广泛的应用。有关miRNA芯片检测SLE血浆差异miRNA表达谱的研究，国内外尚未见相关的文献报道。1.4研究内容本研究拟通过基因芯片技术检测SLE病人和正常健康人外周血血浆的miRNAs差异表达谱，研究miRNAs在SLE发病中的作用。本研究的主要内容：（1）收集SLE病人和正常人的外周血血浆标本；（2）基因芯片检测SLE病人和正常人血浆中，差异表达的miRNAs；（3）运用qRT-PCR技术，对芯片筛选出的差异表达的关键miRNAs，进行检测和验证；（4）通过生物信息学方法分析关键miRNAs所分别调控的靶基因和信号通路。本课题研究有望获得SLE血浆的差异miRNA表达谱，为临床上SLE的早期诊断和靶向治疗提供理论基础和新的靶向治疗策略。3 南华大学硕士学位论文4 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1材料2.1.1标本收集及临床资料18例原SLE病人均来自2015年1月至6月郴州市第一人民医院肾内科住院病人，年龄18-69岁，平均年龄34.7±6.5岁。SLE诊断参照美国风湿病学会2009年修订的SLE诊断标准。10例健康人血浆标本来自本院体检健康人血液标本，年龄18-70岁，平均年龄37.5±7.1岁。两组在年龄性别方面经方差分析比较无显著性差异。以上研究对象均取得签注了知情同意书，同意其血浆用于本研究，同时入院记录详细记载了研究对象的既往史和家族史等。2.1.2试剂血浆RNA提取试剂盒，为德国Qiagen公司产品氯仿、异丙醇、乙醇，均为分析化学纯，为国内公司产品。荧光定量PCR检测试剂盒，为美国invitrogen公司产品2.1.3仪器设备实时荧光定量PCR仪，为美国Bio-Rad公司产品。2.2实验方法2.2.1血浆样本收集所有患者的病例样本入院时采集的血液，健康人对照样本为正常体检时采集的血液，抽取病人外周静脉血5mL，3000rpm,4℃离心10分钟去掉血细胞分离血浆，第二次继续离心12000rpm,4℃离心15分钟，然后用医用5mL抗凝管收集血浆，4℃冰箱保存后EP管进行分装，样本于-80℃保存。2.2.2基因芯片检测（1）提取总RNA分别提取3例SLE病人和3例健康人的血浆标本5ml，通过Qiagen血浆RNA试剂盒提取提取总RNA，主要步骤如下：血浆样品先用RNAse酶处理，去除RNA酶，在EP5 南华大学硕士学位论文管中分别加入250μL抗凝血浆，再加入750μLQiagen提取试剂，进行充分的混匀，加入200μL的氯仿震荡，室温下静置5min；低温下4℃12000rpm离心15min；吸取上清液到新的EP管，加入500μL的异丙醇充分的混勾，低温下于4℃，13000rpm离心15min，加入80%的乙醇于EP管中，则管中会出现沉淀，该沉淀成分即为总RNA，7500rpm离心5min，吸弃上清，室温下静置，通过室温下自然干燥EP管15min，加入双蒸水溶解总RNA，用于下一步实验或-80℃保存备用。基因芯片检测委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成。（2）检测样品的总RNA质量总RNA样品，采用分光光度计和Agilent2100生物芯片，分析进行检测，总RNA质量合格标准如下：分光光度计检测后A260/A280的比值范围为：1.70.7)。两种方法检测总RNA质量均较好，符合芯片检测的要求。表1SLE病人和健康人血浆的总RNA检测分光光度计结果生物芯片结果样本样本名称A260/A280浓度28S/18S编号（ng/μL）1健康人血浆1.96309.61.62SLE病人血浆2.05311.71.63.2基因芯片扫描结果基因组芯片扫描结果见图1，图中的荧光信号是表示靶miRNA与探针结合后的表达强度，荧光信号的强弱代表了miRNA的表达水平，通过电脑扫描荧光强度即可分别得到SLE病人和健康人血浆中所表达的miRNA类型和浓度，对比分析获得差异表达的miRNAs。图1SLE病人和健康人的miRNA芯片扫描图（说明，A：SLE；B：健康人）3.3基因芯片检测到的差异表达miRNAs计算SLE与健康人血浆中miRNA的荧光强度后，两者差异（上调或下调）倍数>2以上认为是差异表达的miRNAs。芯片结果中，总共有49个差异miRNAs，9 南华大学硕士学位论文其中，SLE病人血浆中有35个miRNAs表达上调，上调倍数最大的为miR-21，上调26.1235倍（表2）；有14个miRNAs表达下调，下调倍数最大的为miR-146a，下调0.0512倍（表3）。表2SLE病人血浆中上调的miRNAsSLE相健康人上调倍数上调P值miRNA名称对值相对值43.33411.653326.1235上调0.000018hsa-miR-2142.73522.263520.5414上调0.000169hsa-miR-15541.31122.086320.4144上调0.000101hsa-miR-423-5p42.31342.245519.8762上调0.000201hsa-miR-63843.14142.352119.6355上调0.000019hsa-miR-66343.33482.308818.4255上调0.000203hsa-miR-32645.24352.233317.5242上调0.000012hsa-miR-148a44.54133.255514.7353上调0.000211hsa-miR-42532.35462.245514.6353上调0.000113hsa-miR-29b32.56362.524514.3245上调0.000018hsa-miR-29c31.56361.073514.2345上调0.000219hsa-miR-22431.72542.216614.1344上调0.000123hsa-miR-12635.34552.624513.6223上调0.000211hsa-miR-196a38.32453.524512.6522上调0.000012hsa-miR-18937.22763.352511.5245上调0.000000hsa-miR-6133.45253.352210.2452上调0.000000hsa-miR-2737.76524.125210.1345上调0.000111hsa-miR-7835.94553.255510.0014上调0.000000hsa-miR-142-3p34.24554.02459.2145上调0.000000hsa-miR-34233.52454.45618.2455上调0.000169hsa-miR-299-3p32.24524.61237.7356上调0.000051hsa-miR-19831.87624.42356.7645上调0.000341hsa-miR-29810 第3章结果30.45254.52116.5245上调0.000007hsa-miR-21529.35255.54635.4524上调0.000003hsa-miR-18529.45225.83975.1524上调0.000010hsa-miR-12628.12455.57644.5622上调0.000411hsa-miR-1628.34417.00724.2455上调0.000028hsa-miR-181a27.85257.00984.1524上调0.000102hsa-miR-12226.66555.53454.0285上调0.000191hsa-miR-let7b29.14356.79854.0025上调0.000001hsa-miR-22327.54546.84094.0021上调0.000009hsa-miR-371-5p26.45557.98543.8765上调0.000221hsa-miR-15024.12557.65433.7645上调0.000009hsa-miR-15b23.35248.76542.8764上调0.000007hsa-miR-1721.86137.56432.5355上调0.000013hsa-miR-574-5p表3SLE病人血浆中下调的miRNAsSLE相健康人下调下调P值miRNA名称对值相对值倍数0.41248.15320.0512下调0.000010hsa-miR-146a0.94338.34520.1563下调0.000000hsa-miR-1421.21237.62560.1578下调0.000000hsa-miR-1451.43147.19910.2155下调0.000106hsa-miR-311.61347.34130.2256下调0.000014hsa-miR-17-5b1.93627.74540.2467下调0.000109hsa-miR-296-5p1.99247.13410.2743下调0.000002hsa-miR-1012.15516.21110.3352下调0.000001hsa-miR-19b1.41113.42450.4113下调0.000009hsa-miR-3832.52456.13440.4163下调0.000008hsa-miR-20a2.34135.41450.4256下调0.000009hsa-miR-1841.98714.43760.4313下调0.000103hsa-miR-11211 南华大学硕士学位论文0.62341.41340.4451下调0.000000hsa-miR-1251.31352.8840.4672下调0.000000hsa-miR-1413.4miRNAs差异表达谱的聚类分析(Cluster)SLE病人与健康人血浆的miRNAs差异表达谱总共有49个差异表达的miRNAs，这些miRNA分子具体差异通过聚类分析作图，结果见图2。聚类树形图分为SLE病人和健康人，这些差异表达的miRNA谱图，看上去很容易将SLE病人和正常健康人区分开来，不同颜色深浅代表了miRNA的表达量，因此，通过聚类分析图能够够将SLE病人和正常健康人鉴别开来。12 第3章结果图2SLE病人和健康人血浆差异miRNAs的聚类分析图13 南华大学硕士学位论文3.5qRT-PCR检测miR-21，miR-146a表达水平选取差异表达增高最多的miR-21和下调最多的miR-146a分别进行验证。结果发现，18例SLE病人中，miR-21的相对平均值为33.5±2.2，10例健康人中，miR-21的相对平均值为2.8±0.5，上调倍数为11.9642倍；18例SLE病人中，miR-146a的相对平均值为1.3±0.1，10例健康人中，miR-146a的相对平均值为5.7±1.3，下调倍数为0.2281倍，两个miRNAs分子在SLE与健康人中的相对值比较，差异均有显著性意义（P＜0.01，表4）。miR-21，miR-146a在qRT-PCR检测中的结果，与基因芯片中的检测结果比较，两种方法检测到的表达变化趋势是一致的（见表4,5）。图2miR-21和miR-146a的qRT-PCR扩增结果A,miR-21扩增曲线；B,miR-21熔解曲线；C,miR-146a扩增曲线；D,miR-146a熔解曲线；表4miR-21和miR-146a在两个样本中的相对表达量名称组别相对表达量变化倍数P值SLE（18例）33.5±2.211.96420.000*miR-21健康人（10例）2.8±0.51.00SLE（18例）1.3±0.10.22810.001*miR-146a健康人（10例）5.7±1.31.00*P＜0.01，SLE与健康人比较.14 第3章结果表5microRNA芯片与qRT-PCR结果比较名称microRNA芯片qRT-PCRmiR-2126.123511.9642miR-146a0.05120.22813.6miR-21和miR-146a生物信息学分析表6miR-21和miR-146a所调控的靶基因miRNA靶基因miR-21ZNF367,GPR64,YOD1,PHF14,PLEKHA1,PIKFYVE,PBRM1,GATAD2B,SCML2,VCL,BMPR2,C17orf39,TIAM1,FGF18,FRS2,KRIT1,SKI,ST3GAL6,PELI1,PGRMC2,RP2,MTMR12,AIM1L,FAM13A,GRAMD3,PDZD2,RECK,IL12A,PLAG1,TGFBI,MSH2,SLC8A3,STAT3,ARMCX1,C17orf75,BEST3,ST6GAL1,GLIS2,LRRC57,CCL20,ACVR1C,RMND5A,CSRNP3,CNKSR2,SLC2A4RG,SOX5,PCSK6,SATB1,SLC30A10,UBE2D3,SMAD7,SPRY1,CCL1,STAG2,PDCD4,PTPN20B,PTPN20A,CD69,JHDM1D,MATN2,SRL,LATS1,C2orf18,ARHGAP24,UBR3,SEZ6L,TNFRSF11B,C2orf63,MEIS1,PFKM,C10orf12,AP1AR,KLF3,PTPN14,KLHL15,LRP6,ELF2,NTF3,SASH1,JPH1,PTPN9,MRPL9,PCBP1,NFIB,CASKIN1,GLCCI1,FASLG,KLHDC5,RAB11A,CPEB3,CHD7,ADNP,LCORL,FAM3C,SNX29,TOPORS,PAIP2B,MBLAC2,PPP1R3B,SPRY2,TBX2,BMP3,PITX2,CCR7,KCNK10,RHOB,NELL2,CHIC1,JAG1,ASPN,BCL7A,RBPJ,STK38L,XKR8,PCBP2,ARHGAP31,ZSW,IM6,WWP1,TRAPPC8,CREB5,TET1,RPRD1A,LIFR,ITGB8,CHL1,TNRC6B,SESTD1,OLR1,RAB22A,ZNF704,ARHGAP32,LANCL1,TNKS,TNPO1,PER2,CBX4,FMN1,MEF2C,XKR6,RASGRP1,BOLL,HSDL2,S100A10,DCAF7,SMARCD1,LEMD3,MSX1,WNK3,MAP2K3,KLF5,CADM1,OSR1,MRPL49,SLC10A7,RFFL,ZNF217,ASF1A,RAB6A,FBXO11,NFAT5,MICALL1,TAGAP,ATPAF1,MPRIP,MYCL1,ACVR2A,MAPK10,EPHA4,CEP68,DLGAP1,PPAR15 南华大学硕士学位论文A,ARHGEF12,SRSF3,KBTBD6,ALX4,MCTP2,DLX2,CNOT6,MAP3K1,FAM63B,CNTFR,UQCRB,BTG2,RAVER2,GTPBP1,EHD1,UNC80,SOX2,PAN3,SOX7,ZFP36L2,MSL1,FHDC1,NBEA,ALX1,DUSP8,LMBR1,SLC7A6,GLYR1,EIF2C4,ESM1,COL4A1,NFIA,FAM107B,SC5DL,BAHD1,HNRNPU,SPG20,STK40,5-Mar,POM121C,AP4E1,TGFBR2,KLF6,ABCD2,GAB1,AP3M1,POM121,EIF1AX,KLF12,DAG1,KIAA1549,RBMS3,RASA1,ZCCHC3,FBXO28,CCL22,EGR3,BCL11B,BCL11A,ZYG11B,KCNT2,SESN1,C5orf41,BRD2,YAP1,SOX6,TIMP3,BRWD3,THRB,GXYLT1,PIK3R1,GNG12,FOXP2,TSC1,AIF1L,ROBO2,UBN2,MBNL1,SECISBP2L,BCL2,PPP3CA,MBNL3,PRPF4B,CREBL2,IL6R,CUX1,GABRB2,ARHGEF26,DCUN1D3,RGS7BP,TLK2,FGD4,CDC25A,STRN,ODZ4,PAG1,EIF4EBP2,NPAS3,THBD,DNAJA2,C14orf101,SETD1B,TRIM33,PURB,SNTB2,KPNA4,SNX19,SOCS6,MTAP,PRKCE,MEGF9,TGFB2,ZBTB47,PI15,RALGPS2,FGF1,SCRN1,BNC2,PRRG4,NR2C2,FAM126B,RPS6KA3,C11orf95,DNAJC16,ERG,TRPM7,KCNA1,SPPL3,SPRY4,CDK6,IFFO2,ZADH2,TNS1,PTCH1,C17orf102,BTKmiR-146aTRAF6,IRAK1,ZBTB2,IGSF1,LCOR,TDRKH,WWC2,BCORL1,ZDHHC7,NOVA1,SIAH2,MICU1,NOS1,LFNG,LRRC15,HNRNPD,LRP2,ZNF652,DCAF12,NRAS,KLF7,SEC23IP,ERBB4,C5orf4,FBXW2,ZC3H12B,ZNRF3,CXorf1,GNL1,EIF4G2,SLC10A3,CD80,USP3,ABL2,NUMB,SMAD4,STRBP,KDM2B,ZNF512B,C6orf203,CDS1,ATG12,SRP14,ESYT2,FAF2,PAQR9,ZNF367,PCDH1,DNPEP,CARD10,PRKCE,UHRF1,CCBP2,C4orf3,RABGAP1,TMEM194A,VASN,PSMD3,C17orf78,C8orf84,GRID1,GDNF,C18orf19,IER5L,RFTN2,SLC2A3,ZNF532,SORT1,FAM26E,TMEM120B,MPPE1,KIF24,CASK,LRTOMT,SH3GL2,STC1,C5orf46,AP3M2,PM20D2,GOSR1,ROBO1,NF2,SLC39A1,YLPM1,DCDC5,BIVM,FZD1,CAPN14,LRRTM2,PPP1R11,ALX4,APPL1,ARMC8,SLC38A1,TLN2,EARS2,NPR3,TANC2,C10orf76,ADARB1,PTGFRN,RNASEL,KCTD15,GALNT10,MYBL1,ZC3H6,STRA13,NFIX,STRN,GAS7,PRC1,CASZ1,BAG1,MED1,SP8,SRRM4,VBP1,SNX21,FBXO28,HNRNPUL2,CAMSAP1,FLOT2,DDHD1,RCSD1,DYNLL2,DLGAP2,CNTFR,ZFYVE1,NOTCH2,DGKG,FAM43A,BCL11A,PHOX2B,ITG16 第3章结果AV,CUX1,NAIF1,GLYATL3,SMYD5,GABPA,METTL21A,MYT1,JAZF1,KIAA0284,NRP2,TAF9B,KPNA6,TMEM33,SRSF12,NSD1,KIAA1274,RIMS2,KCNIP3,VAT1,THAP3,BNC1,TRDMT1,TLCD2,RUNX1T1,USP47,SEMA3G,PBX2,SSTR1,FRYL,SDK1,ELAVL1,MMP16,ZNF148,CCDC6,SH3TC2,KCMF1,ATG7,TTPAL,CSF1R,KBTBD3,CDC42BPA,DNAL1,SCN3B,PLEKHH2,STX3,SLITRK3,BTG2,SLITRK4,CCNJ,GGA2,CELF3,ARL8A,SLCO3A1,EHF,DCTN5,GRSF1,MYO5A,SIN3A,NUCKS1,SMARCA5,BEND4,XIAP,PPM1A,SYT1,ST8SIA4,NFASC,RRM2B,NRIP3,TMEM136,QKI,MAPT,MLL2,MLXIP,HIC2,CDON,MTDH,NPAS4,3-Sep,SOX5,TTL,RNF4,C17orf75,WASF3,FAM65B,KDM6B,EDNRB,WASF2,MYO6,LIN28A,EIF5A2Targetscan在线软件分析miR-21和miR-146a所分别调控的下游靶基因，结果发现：miR-21调控的靶基因有307个，miR-146a调控的靶基因有224个（表6）。通过DAVID在线程序对miR-21和miR-146a分别调控的进行聚类分析和相互作用分析，找出其中关键的信号通路。结果发现，307个miR-21所调控的靶基因涉及到的主要信号通路主要包括以下几条：EGFSignalingPathway，TGF-betasignalingpathway，MAPKsignalingpathway，Neurotrophinsignalingpathway（神经营养因子信号通路），Jak-STATsignalingpathway等；224个miR-146a所调控的靶基因涉及到的信号通路主要包括以下几条：MAPKsignalingpathway，NotchSignalingPathway，Pathwaysincancer（Fas）等。17 南华大学硕士学位论文18 第4章讨论第4章讨论4.1SLE研究现状系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的、复杂的自身免疫性疾病，其病因目前不明。SLE死亡率和发病率在以前都很高，曾经严重地威胁着人类的健康和生命。近年来，随着对本病发病机制以及发病病因的不断深入研究，研究发现，SLE往往会累及患者的心、肾、肺以及神经、消化系统等器官和系统，是一个多系统、多脏器功能受累的自身免疫性疾病[39]。SLE在我国的患病率约70/100000，近年来有逐渐增高的趋势[40]。SLE死亡率全球范围都比较高，其死亡原因很多，在发达国家，SLE的死亡原因主要是心血管疾病、严重的感染、并发肿瘤和出现多器官功能衰竭等。在我国，SLE死亡原因多与肾功能衰竭、感染、心血管病等有关。近年来，由于糖皮质激素和免疫抑制剂的普遍应用，加上诊疗技术的进步，SLE的预后有了较好地改善。临床上，如何早期诊断SLE，是提高其生存率、改善其临床预后的关键一步。SLE的首发临床表现，主要是出现皮肤黏膜的损害、关节炎或关节疼痛、肾损害、血液系统的损害以及发热等表现，这些表现有一定的特异性，但不一定会全部出现，临床上主要根据皮肤黏膜损害，为首要表现来对SLE进行早期诊断[41,42]。但是，SLE患者的临床表现具有多样性，部分患者病程短，发病急，或者临床表现隐匿，难以确诊；预后指标也没有很明确的指标。因此，如何早期诊断SLE，及对其预后进行判断，仍然是临床上的难点。SLE必须尽早发现，并迅速控制SLE的病情进展，才能减轻其器官受累损害的程度，通过早期正规的治疗，提高SLE患者的生存率。因此，如何早期诊断SLE，寻找SLE的早期生物学靶标具有重要的临床意义。4.2SLE与miRNA研究进展研究发现，SLE由于是一种自身免疫性疾病，其在疾病的早期，就往往引起了免疫系统发生了病理改变，包括细胞免疫以及体液免疫。有研究发现，在SLE患者体内，其CD4阳性的T细胞中，发现miR-126表达上调，而通过下调miR-126的表达后可以恢复CD11a和CD70启动子甲基化水平，并且逆转SLE中的CD4阳性的T细胞的活化[43]。研究表明，多个miRNA与SLE病人体内的CD4+T细19 南华大学硕士学位论文胞中的异常甲基化有关，miRNA可成为靶向治疗的候选位点[44]。同时检测SLE患者，外周血单个核细胞和外周血的CD3阳性的T细胞，结果发现，SLE患者中，miR-125a的表达明显低于正常对照组[45]。以上研究表明，miRNA在SLE发病中具有重要作用，但是，以上相关研究，均集中一个或几个miRNAs，没有从整体上去进行研究。本研究通过基因芯片技术，研究SLE患者血浆中的所有miRNA分子，并与健康人血浆中的miRNA分子做比较，以找出差异miRNAs分子，分析这些差异miRNA在SLE发生发展中的作用。最新的研究证实，由机体相关组织或细胞所产生的miRNAs房子进入血液循环以后，可以在血浆中检测到[46]。由于miRNA在人类血浆中，以一种比较稳定的状态存在，具有序列保守性和遗传稳定性，同时，miRNA的分子量比较小，在疾病的发病早期阶段就发生了改变，容易被检测到[47]。因此，通过检测血液循环中的miRNAs分子，可作为SLE的潜在生物标志物，发现用于临床诊断和治疗的分子靶标[48-50]。大规模的检测miRNAs差异表达主要是通过基因芯片技术来实现。miRNA基因芯片是一种非常精密的分子生物学检测手段，其技术水平目前发展已经是相当成熟。该技术主要是通过在芯片中，提取杂交点的荧光信号，进行强度定量分析，即可得到miRNA的差异表达谱。国内外已经有不少关于利用miRNA芯片研究miRNA差异表达谱的研究报道[51-53]。国内有人应用miRNA芯片，获得了乳腺癌与癌旁组织的miRNAs差异表达谱，发现了乳腺癌患者中，有16种差异表达的miRNAs[54]。有人首先采集SLE患者和健康人的外周静脉血，用磁珠阴性分选法，分离B淋巴细胞，并进行miRNA芯片检测，结果在SLE患者的外周血中，发现了16个差异表达的miRNAs[55]。以上研究说明，通过miRNA芯片研究差异miRNAs表达谱具有可行性和广泛的应用前景。本研究为了研究SLE病人和健康人血浆的差异miRNA表达谱，通过miRNA基因芯片技术检测，结果发现，SLE病人血浆中，有35个miRNAs表达上调，14个miRNAs表达下调。基因芯片技术大规模检测获得差异谱以后，还需要对这些差异表达miRNAs分析进一步进行验证和检测，主要是通过RT-PCR技术来进行检测，SLE病人中，基因芯片检测发现，上调倍数最大的为miR-21，其相对平均值为33.5±2.2，10例健康人中，miR-21的相对平均值为2.8±0.5，上调倍数为11.964220 第4章讨论倍；SLE病人中，miR-146a的相对平均值为1.3±0.1，10例健康人中，miR-146a的相对平均值为5.7±1.3，下调倍数为0.2281倍。两个miRNAs分子在SLE与健康人中的相对值比较，差异均有显著性意义。他们在qRT-PCR检测中的结果，与基因芯片中的检测结果比较，两种方法检测到的表达变化趋势是一致的，说明基因芯片结果是可信的。miR-21、miR-146a在SLE发病中具有重要的作用，值得进一步研究。4.3生物信息学分析基因芯片结果面对新发现的miRNA分子，如何去研究和分析其功能，可通过生物信息学方法，归纳和预测其靶基因及其下游信号通路，预测miRNA-靶基因之间的相互作用，可通过Targetscan软件进行预测[56]。本研究通过生物信息学方法，miR-21调控的靶基因有307个，miR-146a调控的靶基因有224个，这些靶基因之间相互作用情况并不清楚，需要进一步分析他们之间所涉及的信号通路。将307个miR-21调控的靶基因和224个miR-146a调控的靶基因分别输入David在线程序，分析这些基因之间的相互作用涉及到的信号通路，结果发现，307个miR-21所调控的靶基因涉及到的信号通路主要有：EGF、TGF-beta、MAPK、Jak-STAT、神经营养因子信号通路等；224个miR-146a所调控的靶基因涉及到的信号通路主要有：MAPK、Notch、Fas信号通路等。这些靶基因和相关信号通路在SLE发病中的具体作用仍然需要进一步的分析和鉴别。miR-21定位于人染色体的17q23.2，目前，有关miR-21调控靶基因的研究不多，已被实验所证实miR-21的下游靶基因不多。主要包括：PTEN、PDCD4、TPM1、RECK、TIMP3、FasL等等[57,58]。这些靶基因的基因有一个共同特点，均具有肿瘤抑制作用。研究发现，miR-21在胰腺癌患者血浆中，其表达水平明显高于慢性胰腺炎患者及正常对照组，miR-21可作为胰腺癌的生物标志物，有助于胰腺癌的早期诊断[59]。研究发现，miR-21参与了许多肿瘤细胞的侵袭和转移的过程，miR-21所调控许多信号通路和细胞因子均与此有关，目前认为，miR-21可作为的一个理想的潜在肿瘤治疗的靶点[60,61]。有人利用miR-21的反义单核苷酸链，可以有效抑制乳腺癌细胞体外增殖作用，也可以抑制肝癌细胞的锚定依赖性生长，促进肝癌细胞的凋亡[62]。除此，miR-21出现表达异常，与乳腺癌患者的临床分期，淋巴结转移存在负相关性，miR-21表达上调与乳腺癌患者的预后不良有关，21 南华大学硕士学位论文miR-21可作为一种潜在的乳腺癌诊断和预后的标记物[63]。也有研究法发现，SLE患者外周血B细胞中，miR-21的相对表达量，明显高于健康对照组人群，且在中重度活动组患者中高于轻度活动组，也高于对照组，SLE患者外周血B细胞中，miR-21的表达增高与疾病活动度有关[64]。有关miR-21在SLE发生发展中的作用值得进一步研究。miR-146a定位于人的5q，其前体序列含99个碱基。研究发现，miR-146a在胃癌组织中，表达水平明显下调，与肿瘤的TNM分期，以及淋巴结转移有关；miR-146a在胃癌中起着抑癌基因样的作用，能够抑制胃癌细胞的侵袭和转移功能[65]。miR-146a是近年来，被广泛研究，并已经证明参与了机体的免疫反应过程，miR-146a主要通过活化树突状细胞（DC），导致SLE病人丧失了自身免疫耐受能力[66]。在SLE患者体内，研究发现，miR-146a的表达水平，也是显著低于正常对照组的，而活动性SLE患者中，miR-146a的表达水平更低[67]。研究认为，SLE患者中miR-146a表达水平过低时，往往会导致多个靶蛋白的异常堆积以及信号通路的异常激活，从而参与了SLE的发生发展[68]。因此，miR-146a可作为一个新的SLE诊断和预后判断的生物标志物，用于临床上靶向治疗研究及预后诊断。miRNA作为一种新的基因表达调控因子，已成为临床上许多疾病早期诊断和预后评价的生物标志物，也可用于SLE的诊断和预后判断[69,70]。本研究已通过基因芯片技术获得SLE血浆的差异miRNA是表达谱，并发现，miR-21和miR-146a在SLE发病可能具有重要作用，miR-21和miR-146a所调控的靶基因与关键信号通路，是我们下一步需要继续挖掘和整理的内容，尚需要进一步的实验证实和研究，以便更好地为SLE的诊断和临床治疗提供新的思路和方向。本研究尚存在一些不足之处，比如：由于miR-21和miR-146a在血浆样本中检测数目过少，他们与SLE之间的临床病理联系有待进一步扩大样本量进行实验。miR-21和miR-146a下游靶基因的功能值得进一步研究。22 第5章结论第5章结论miR-21和miR-146a可能在SLE发生发展中具有重要作用。23 南华大学硕士学位论文24 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综述自身免疫性疾病发病机理中miRNA的作用曾小春综述廖湘平审阅摘要miRNA为单链、内源性非编码小RNA，越来越多的证据表明，miRNA在调节基因表达、细胞发育、分化和功能方面至关重要。自身免疫性疾病是一种慢性全身性炎性疾病。miRNA表达谱相关的最近发现表明它们可作为自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及肖格伦综合征的生物标志物。在这篇综述中，我们将总结miRNA的特点及其在免疫系统和自身免疫性疾病中的功能性作用。此外，我们将描述miRNA在现代诊断学方面的优点。1.引言miRNA是一个小分子RNA家族，长度从18到25个核苷酸不等。它们是单链、内源性非编码RNA，在调节基因表达方面扮演着关键角色[1,2]。miRNA调节大约90%的蛋白编码基因，且在各种生物过程中发挥核心作用。毫不奇怪的是，miRNA表达的改变可能导致某些病理性疾病和临床疾病的发生发展。如今，miRNA的病理遗传作用在恶性疾病及自身免疫性疾病中得到广泛研究。已在不同的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和干燥综合征(SS)中识别miRNA表达谱的变化[3-5]。在这篇综述中，我们将总结miRNA的特点及其在免疫系统和自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮）中的功能性作用。2.miRNA生物学大部分miRNA基因来源于基因间区或反义定向以形成独立的转录单位。其它大多数miRNA存在于蛋白编码基因的内含子区域[6]。人类miRNA在基因上并不总是孤立的，有时数个miRNA组合成集群以进一步转录和表达[7]。miRNA的生物起源和成熟最先发生于细胞核，随后发生于细胞质，借助于一些蛋白质和酶的帮助来完成。miRNA生物起源的第一步是在细胞核内的DNA分子中生成原miRNA转录物(pri-miRNA)。大多数miRNA基因通过RNA聚合酶II进行转录以产生成百上千个核甘酸长度的pri-miRNA[6]。pri-miRNA具有帽子结构并被多聚腺甘酸化，有着典型的发夹结构[8]。这些pri-miRNA被一种酶-33 南华大学硕士学位论文蛋白复合物识别并被进一步裂解为70-100个核苷酸长度的前体miRNA(pre-miRNA)。这一复合物由Drosha与DiGeorge综合征危象区基因8(DGCR8)组成，被指是一种微处理器复合物[9]。Drosha是核糖核酸酶III家族的两成员之一，而DGCR8是一种双链RNA结合蛋白，在DiGeorge综合征中被删除[10]。pre-miRNA随后被exportin5运出至细胞质，exportin5是核质互换蛋白karyopherin家族成员之一。Exportin5识别pre-miRNA发夹序列3'端Drosha留下的两个突出的核苷酸，需Ran-GTP酶的GTP结合形式来提供能量[11]。非经典的miRNA生物起源途径绕过微处理器复合物裂解，加工成另一种被称为mirtron的pre-miRNA，其通过剪接体在内含子中直接拼接而成。分支pre-mirtron随后经受套素介导的去支作用来模仿pre-miRNA的结构特点[12，13]。有趣的是，不仅可以在秀丽隐杆线虫和果蝇中发现mirtron，其在哺乳动物中也得以报道[14]。pre-miRNA在细胞质中进一步加工产生成熟的miRNA。RNaseIII家族的第二个成员Dicer与pre-miRNA5′和3′端相互作用并裂解发夹环，加工成一种19-25个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体[15，16]。miRNA*被视为过客链，因为其不稳定，而miRNA则被视为导链。在被输入Ago蛋白后miRNA/miRNA*双链体释放螺旋结构。导链仍与Ago交互来生成RNA诱导沉默复合物(RISC)，它能够促进miRNA绑定至其靶标[17]。过客链作为导链的互补链则退化为一种RISC复合物底物。然而最近的研究表明，有些miRNA*稳定表达并可能发挥重要作用[18]。成熟miRNA与基因的3`-UTR相互作用来调节基因的表达。靶mRNA也能够被miRNA“种子”区的2-7个核苷酸识别[19]。mRNA与miRNA种子区碱基配对的互补程度定义了基因调控的机制[20]。碱基互补配对完美或近乎完美时，RISC复合物中的Ago蛋白诱导靶mRNA的内源性核苷酸裂解裂解，引起mRNA片段的脱腺苷化和降解。碱基配对不完整时，由miRNA绑定引起的双链RNA的形成引起翻译受抑[2，21，22]。受抑的mRNA聚集于胞浆集合体即P小体内，此处是已知的mRNA不稳定位点[23，24]。3.免疫系统中的miRNAmiRNA不仅在免疫系统的发展中扮演至关重要的角色，也在先天和适应性免疫的调节方面发挥重要作用[5，25]。在干细胞命运和分化中miRNA充当翻译抑34 综述制剂[26]。miR-181、miR-223及miR-142s在造血细胞中大量表达并在造血谱系分化过程中表现出调节作用[27,28]。4.自身免疫性疾病中的miRNAmiRNA调控的改变似乎与免疫障碍和自身免疫性疾病的发展高度相关。最近，数项研究聚焦于miRNA在自身免疫性疾病中的作用，且不同的表达谱已被确定为某些免疫性疾病，如SLE、RA和SS等的生物标记。系统性红斑狼疮是一种最常见的系统性自身免疫性疾病。系统性红斑狼疮具有大范围的临床表现，因为该疾病会影响多个器官，包括皮肤、关节、肾脏、肺、神经系统和浆液性膜等。其临床特征的多样性与其致病因素，包括遗传、激素和环境因素等的复杂性相匹配[29]。最近的一项研究表明，相比于正常控制组，SLE患者其血浆miRNA-126水平明显更低。此外，SLE患者外周血单核细胞(PBMC)中的血浆IFN-α和干扰素诱导基因ISG56mRNA水平高于控制组。根据这些观察结果，miRNA-126可能会抑制IFN-α的产生且其表达的下降可能参与SLE的发病机制[30]。Zhu等人报道称，相比于健康儿童，miRNA-516a-3p、miRNA-629及miRNA-525-5p在儿科SLE（pSLE)患者PBMC中具有较高表达水平。此外，这三种miRNA表达水平的增加与SLEDAI评分及CRP水平呈正相关。这三种miRNA的目标基因，即Yinyang1(YY1)、Kruppel样因子13(KLF13)和干扰素调节因子5(IRF5)，被发现在pSLE发病机制中极其重要[31]。Dai等人表示，PBMC中具变异表达模式的16种miRNA，如下:miR-17-5p、miR-112、miR-141、miR-184、miR-196a、miR-383及miR-409-3p这7种在SLE中表达减少；其他9种miRNA即miR-21、miR-61、miR-78、miR-142-3p、miR-189、miR-198、miR-298、miR-299-3p及miR-342在SLE中过度表达[32]。两年后，同肾肿瘤患者的肾脏切除样本对照，他们对二类狼疮肾炎(LN)患者其肾活检样本中的miRNA进行了分析。他们报道称狼疮肾炎患者中66种miRNA受到差异性调控。其中，36种上调，其余30种则下调[33]。miR-146a的下调也会导致SLE的发展。据透露，miR-146a是一种I型IFN通路负调节因子，其通过靶向IFN调节因子5、STAT1、IRAK1及TRAF6来实现[34]。最近的两项研究聚焦于miR-155；miR-155的表达水平与SLE小鼠B细35 南华大学硕士学位论文胞中CD1d的表达呈负相关。此外，发现可通过激活TLR9靶向Ets-1来增加B细胞CD1d的表达水平。此外，相比于健康对照组，青少年SLE患者PBMCK中miR-155表达下调。据报道，miR-155的表达水平与系统性红斑狼疮疾病活动指数（SLEDAI）评分呈负相关[35,36]。据观察，miR-410的上调可显著降低纤维化因子如转变生长因子-β1(TGF-β1)的表达水平，LN发病机理中其通过抑制IL-6的分泌来实现[37]。表观遗传调节因子EZH2也许可转换狼疮性未免疫CD4+T细胞中的牵连效应子，并反抗抑制性TGF-β信号传导。miR-26a对葡萄糖可用性敏感且靶向EZH2，其表达水平与SLEDAI呈负相关[38]。当前的一项研究表明，伴活动性LN的SLE其血清及肾小球细胞中的miR-148a-3p表达水平明显更高。miR-148a-3p的上调可加速肾小球细胞的增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，从而减少PTEN的表达水平[39]。与健康对照组所测结果相比，伴早期LN的SLE患者血清中miR-130b-3p存在明显的过度表达。血清miR-130b-3p并不影响SLE的疾病活动指数(SLEDAI、ds-DNA和补体水平)，但与肾损伤相关[40]。另一方面，尿液外泌体中miR-29c的表达与慢性中毒而非肾功能(eGFR和肌酐水平)极度负相关。尿液外泌体是泌尿系上皮细胞释放的微泡，被提议为评估LN分期的生物标记的新型理想来源[41]。此外，以无细胞且删除外泌体的上清液部分为对照，对尿液外泌体尤其是含LN外泌体的数种miRNA的表达进行了评估。外泌体miRNA中，miR-146a在伴活动性LN的SLE患者中具最大程度的过度表达，以控制组或未伴LN的SLE患者为对照[42]。循环的抗磷脂抗体(aPL)会增加妊娠并发症的风险，从而导致一种被称为抗磷脂综合征（APS）的自身免疫性疾病。相比于健康妊娠对照组，具不良妊娠结局的APS患者表现出明显更高水平的循环外泌体相关miR-146a。特定aPL显著诱导滋养细胞表达更高水平的miR-146a-5p、miR-146a、miR-155和miR-210。除miR-155外，其它miRNA受到TLR4拮抗剂的抑制。抑制miR-146a可显著降低aPL诱导的滋养细胞IL-8的分泌，该分泌过程受TLR8的调控[43]。5.结论与前景miRNA的发现及其在调节基因表达方面的关键作用的识别改变了我们对基因控制的思考方式。过去十年里进行的集中研究阐明了miRNA调节细胞发育和36 综述分化的多种途径和方式。miRNA在调节免疫系统反应方面的核心作用也得以确定，尽管还有许多miRNA相关的问题有待回答。过去的几年里，miRNA在自身免疫性疾病中的功能备受关注。循环或不同细胞和组织中某些miRNA表达水平的变化是各种自身免疫性疾病的表征且可能导致疾病的发展。因此，这些分子中的有些可能被视为不同自体免疫疾病的特异性新型生物标记。然而，需要功能性实验研究来验证和建立异常表达miRNA与疾病发展间的因果联系。此外，miRNA异常表达的潜在机制以及调控miRNA的其他因素的影响也仍有待调查。在某些情况下，多种单核苷酸多态性(SNP)被证实可改变miRNA的功能，从而可能导致疾病的发展。通过基于通路的探索性分析及miRNASNP的映象和表征，更好地理解miRNA的免疫调节机制，不仅有助于阐明免疫性疾病的发病机制，也可能引导开发针对免疫疾病患者的综合性治疗方法。37 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致谢致谢首先感谢我导师廖湘平教授，廖教授具有渊博的知识，严谨的科研精神和丰富的临床经验，在我专业上，学业上给予了充分的指导和帮助，感谢廖教授三年来的悉心教导和给予我的帮助。感谢郴州市人民医院肾内科的全体同仁，你们的无私传授，让我获得宝贵的临床经验和教训，医疗水平获得了提高。随后感谢我的家人、同学和朋友，在我读研期间给予的包容、关爱和鼓励。45
