硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制

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分类号Q5学校代码10590UDC570密级公开深圳大学硕士学位论文硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制学位申请人姓名金娜专业名称生物学学院（系、所）生命与海洋科学学院指导教师姓名倪嘉缵院士刘琼教授 深圳大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明－本人郑重声明：所呈交的学位论文《硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马ｅ淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制》是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。论文作者签名１？日期：总好：年ｊ月八日学位论文使用授权说明）（必须装订在印刷本首页目本学位论文作者完全了解深圳大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，卩：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属深圳大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其他机构送交论文的电子版和纸质版，允许论文被查阅和借阅。本人授权深圳大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（涉密学位论文在解密后适用本授权书）论文作者签少含、名：柯？＊师签名：叫＇曰期：則年Ｔ月ｕ日日期：年月日（、＂、１叫ｒ１ 摘要阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease，AD）是一种与年龄相关的渐行性神经退行性疾病，最初表现为进行性记忆力减退、获得性知识丧失，最终发展为日常生活活动能力完全丧失，给社会和家庭带来沉重负担。越来越多的研究表明硒的日摄入量与AD的发病率密切相关。研究发现硒酸钠能够显著降低微管相关蛋白tau病变模型鼠脑内tau蛋白的过度磷酸化，减少神经纤维缠结，但是硒酸钠对AD病理过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响以及对淀粉样蛋白前体（APP）的剪切过程的影响并不清楚。同时，AD病变过程与嗅球的关系、硒对AD鼠脑中嗅球病变的影响，目前报道甚少。本论文围绕这两方面开展了相关研究。本研究采用三转基因AD模型鼠，从2月龄开始给予含6g/ml硒酸钠的饮用水，给药10个月后检测其海马区的病理指标。研究发现，12月龄AD模型鼠海马区出现大量β-淀粉样蛋白（Aβ）及神经元凋亡，并且出现Wnt/β-catenin信号通路活性下调。给予硒酸钠的AD模型鼠，其海马区神经元突触密度增加，β-淀粉样蛋白减少，神经元凋亡降低。进一步研究发现：硒酸钠显著激活AD模型鼠脑内蛋白磷酸酶（PP2A）的活性、降低糖元合成酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化，提高β-链蛋白（β-catenin）的表达水平，从而激活Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的转录，使基因c-myc、survivin、TXNRD2表达水平上调，基因BACE1的表达水平下调。AD模型鼠脑内APP在其第668位的苏氨酸残基的磷酸化（APP-pT668）易被BACE1识别并剪切，造成Aβ的产生增加，本研究发现AD模型鼠硒酸钠处理组APP-pT668的表达水平显著降低，降低Aβ的产生。以上结果表明Wnt/β-catenin信号通路对阻止AD的病理变化具有重要作用，硒酸钠有可能是治疗AD的一种潜在药物。AD的早期病理变化中嗅觉功能受损，为了探究硒酸钠对嗅球早期病理变化的影响，本研究给予2月龄三转基因AD模型鼠3g/ml硒酸钠饮用水，饲养4个月后检测相关指标。结果发现，硒酸钠显著提高小鼠的空间记忆能力，相比野生型小鼠，AD组嗅球内Aβ及Tau-pS231的表达显著升高，硒酸钠处理组AD模型鼠嗅球内二者的表达水平显著降低。分别取野生型小鼠、AD模型鼠及硒酸钠饲养AD组小鼠的嗅球组织，从中提取总RNA进行转录组测序和生物信息学分析，发现与野生型小鼠相比，AD小鼠嗅球中Grin2a、Grin2b、Creb1、Gng13及Chrm2基因表达水平降低，Gfap基因表达水平I 升高；给予硒酸钠的AD模型小鼠，嗅球中显著上调的基因有Grin2a、Grin2b、Creb1、Gng13及Chrm2，下调基因有Gfap，硒酸钠给药组逆转了AD模型鼠嗅球内上述基因的表达水平。采用Q-PCR及Westernblotting验证了与突触相关的基因Grin2a和Grin2b与转录组显示的结果一致。为了在细胞水平上验证这一结果，用0.1M硒酸钠处理从AD小鼠嗅球中分离培养的原代神经元，与从野生型小鼠嗅球中分离培养的原代神经元相比较，发现AD组嗅球内神经元突触素蛋白显著下降，硒酸钠处理AD组，突触素的表达增加。综上，硒酸钠能够激活AD模型鼠脑内降低的Wnt/β-catenin信号通路，抑制APP剪切形成Aβ、减少神经元的凋亡。同时，硒酸钠降低嗅球内Aβ的产生及tau蛋白的过度磷酸化，提高嗅球中Grin2a和Grin2b基因和蛋白的表达，并且提高突触素蛋白的表达。在已有硒酸钠抑制AD病理特征的基础上，进一步揭示了硒酸钠对AD上游信号通路和早期病变组织的作用和机理。关键词：阿尔茨海默症（AD）；硒酸钠；Wnt/β-catenin信号通路；蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）；β-淀粉样蛋白前体（APP）；β-淀粉样蛋白（Aβ）II AbstractAlzheimer'sdisease(AD)isanage-relatedprogressiveneurodegenerativedisease,initiallywithprogressivelossofmemoryandacquiredknowledge,andultimatelywiththelossoftheabilityfordailylife,whichbringsaheavyburdentoboththesocietyandthefamily.AccumulatingevidencesshowthatseleniumdietaryintakeisinverselyassociatedwiththemortalityofAlzheimer’sdisease(AD).Sodiumselenatehasbeenreportedtoreduceneurofibrillarytangles(NFT)inthetauopathicmousemodels,butitseffectsontheWnt/β-cateninsignalingpathwayandamyloidproteinprecursor(APP)processingremainunknownduringADformation.Inthispaper,tripletransgenicADmice(3×Tg-AD)hadbeentreatedwith6μg/mlsodiumselenateindrinkingwaterfor10monthbeforethedetectionofhippocampalpathology.IncreasedAβgenerationandneuronalapoptosiswerefoundinthehippocampusofADmodelmouse.Down-regulationofWnt/β-cateninsignalingiscloselyassociatedwiththealterationofADpathology.Treatmentwithsodiumselenatesignificantlypromotedtheactivityofproteinphosphatasesoftype2A(PP2A)andrepressedthehallmarksofAD.ActivationofPP2Abysodiumselenatecouldincreaseactiveβ-cateninlevelandinhibitGSK3βactivityinthehippocampaltissueandprimarilyculturedneuronsofADmodelmouse,leadingtoactivationofWnt/β-cateninsignalingandtransactivationoftargetgenes,includingpositively-regulatedgenesc-myc,survivin,TXNRD2andnegatively-regulatedgeneBACE1.Meanwhile,APPphosphorylationwasalsoreducedontheThr668residueafterselenate-treatment,causingthedecreasesofAPPcleavageandAβgeneration.ThesefindingsrevealthattheWnt/β-cateninpathwayisapotentialtargetforpreventionofADandsodiumselenatemaybedevelopedasanewdrugforADtreatment.Inaddition,theearlypathologyofADhasbeenreportedtobeolfactorydysfunction.InordertoexploretheeffectofsodiumselenateonthechangeofolfactorybulbinADmodelmouse,two-month-oldtripletransgenicADmodelmiceweretreatedwith3μg/mlsodiumselenateindrinkingwaterfor4months.Theresultsshowedthatsodiumselenatesignificantlyincreasedthespatialmemoryabilityofmice.Comparedwiththenon-transgenicmice,olfactorybulbAβandTau-pS231expressionlevelsinADmiceweresignificantlyincreased,III whiletheseexpressionlevelsweresignificantlydecreasedinADmicetreatedwithsodiumselenate.TheexpressionlevelsofgenesGrin2a,Grin2b,Creb1,Gng13andChrm2wereup-regulatedbythetreatmentwithsodiumselenate,whilethegeneGfapwasdown-regulated.Furtherexperimentsconfirmedthatthesynaptic-relatedgenesGrin2aandGrin2bhadsimilarresultsoftranscriptome.Inordertoverifythisresultatthecellularlevel,primaryneuronsisolatedfromolfactorybulbofADmiceweretreatedwithsodiumselenateandtheexpressionlevelofsynaptophysinwasfoundtobeincreased.Inconclusion,sodiumselenateactivatedtheWnt/β-cateninsignalingpathwaywhichwasinhibitedintheADmodelmice.ItalsoreducedneuronalapoptosisandAβgeneration.Meanwhile,sodiumselenatecouldreduceAβproductionandtauhyperphosphorylationandpromotetheexpressionlevelsofGrin2aandGrin2bgenesintheolfactorybulbofADmice,leadingtotheincreaseofthesynapticplasticity.Keywords:Alzheimer’sdisease(AD);sodiumselenate;Wnt/β-cateninsignalingpathway;proteinphosphatasesoftype2A(PP2A);amyloidproteinprecursor(APP);β-amyloid(Aβ)IV 目录摘要..................................................................................................................................................................IABSTRACT........................................................................................................................................................II第1章研究背景.............................................................................................................................................11.1阿尔茨海默病概述......................................................................................................................................11.2WNT/Β-CATENIN信号通路............................................................................................................................21.3嗅球在阿尔茨海默症中的病理变化..........................................................................................................41.4硒与阿尔茨海默症......................................................................................................................................41.5本实验研究目的和意义..............................................................................................................................6第2章材料及方法.........................................................................................................................................72.1实验材料......................................................................................................................................................72.1.1动物模型和细胞模型..........................................................................................................................72.1.2实验药物..............................................................................................................................................72.1.3实验试剂...............................................................................................................................................72.1.4实验仪器............................................................................................................................................102.1.5实验主要试剂的配制........................................................................................................................112.2实验方法....................................................................................................................................................132.2.1小鼠分组及处理.................................................................................................................................132.2.2Morris水迷宫检测小鼠空间探索和记忆能力..................................................................................132.2.3N2aSW细胞系的培养与保种.............................................................................................................142.2.4海马神经元培养................................................................................................................................152.2.5细胞免疫荧光....................................................................................................................................162.2.6腺病毒感染细胞................................................................................................................................172.2.7小鼠组织解剖及石蜡切片制作........................................................................................................172.2.8组织免疫荧光染色............................................................................................................................172.2.9TUNEL细胞凋亡检测.......................................................................................................................182.2.10Gallyas-Braak银染............................................................................................................................202.2.11Q-PCR检测........................................................................................................................................202.2.12Western-Blot检测小鼠脑内相关蛋白的表达情况.........................................................................23第3章实验结果...........................................................................................................................................263.1硒酸钠降低AΒ产生的分子机制..............................................................................................................263.1.1硒酸钠提高阿尔茨海默病模型鼠海马区突触的表达.....................................................................263.1.2硒酸钠对阿尔茨海默病模型鼠海马区Aβ通路的影响..................................................................273.1.3硒酸钠提高PP2A的活性降低GSK3的活性.................................................................................283.1.4硒酸钠提高-catenin的活性...........................................................................................................293.1.5硒酸钠抑制神经细胞的凋亡............................................................................................................313.1.6硒酸钠激活AD模型鼠脑内失活的Wnt通路.................................................................................313.1.7硒酸钠激活Wnt通路的靶点是PP2A..............................................................................................323.1.8敲低β-catenin对Aβ级联通路相关蛋白的影响.............................................................................353.1.9敲低β-catenin对神经元内相关硒酶的影响...................................................................................36 3.2硒酸钠对AD模型鼠脑部嗅球的作用及转录组研究..............................................................................373.2.1硒酸钠对AD模型鼠嗅球早期病理发生的干预..............................................................................373.2.2硒酸钠对AD模型鼠嗅球作用的转录组研究..................................................................................39第4章讨论..................................................................................................................................................42第5章结论..................................................................................................................................................47参考文献.......................................................................................................................................................48 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制第1章研究背景1.1阿尔茨海默病概述阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，并且与年龄有关。有关引起阿尔茨海默症疾病的假说主要有β淀粉样多肽（Aβ）级联反应假说、Tau蛋白功能异常假说、炎症反应学说、基因突变或多型性假说等[1]。AD主要病理症状为脑内出现大量的胞内神经纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFTs）及胞外老年斑（amyloidplaques,APs）的产生，且伴随着神经元突触（synapses）[2，3]的丢失。造成神经纤维缠结的主要原因是tau蛋白的过度磷酸化，tau蛋白的功能主要是负责微管的组装并保持其稳定，它的成分是一种微管结合蛋白。只有tau蛋白的磷酸化和去磷酸化维持一个平衡状态才是正常的，但是当tau蛋白磷酸化超标时，导致胞内的微管稳定性降低，引起微管解聚，造成神经纤维缠结。老年斑主要由β淀粉样多肽组成[4]，β淀粉样多肽由分泌酶剪切淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein,APP）形成的。APP是一种Ⅰ型跨膜蛋白，主要由APP770，APP751，APP695这三种剪接异构体组成。APP可被α分泌酶、β-分泌酶（β-secretase,BACE1）和γ-分泌酶（γ-secretase）剪切。正常人的体内APP的形成主要是通过APP的非淀粉样降解途径(non-amyloidogenicpathway)，即在α分泌酶催化下形成具有神经营养的sAPPα及跨膜段C83片段，后者经过γ分泌酶剪切，产物为胞内可溶性片段，均对神经无危害；而在AD患者脑内，Aβ的形成主要是通过APP的淀粉样降解途径(amyloidogenicpathway)，APP被BACE1切割形成具有神经毒性的sAPP及跨膜段C-端片段（CTF）[5]，CTF进一步被γ-secretase剪切形成A[6]，如下图所示：图1.1APP的剪切在AD发病机制的作用1 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制此外，有研究发现APP的翻译后修饰也和其功能与致病机制相关。在内质网中APP发生N-糖基化，称为未成熟APP（immatureAPP，imAPP），imAPP接下来被运往高尔基复合体，并发生O-糖基化，此时的APP同时具有N-糖基化和O-糖基化称为成熟APP（matureAPP，mAPP）。在脑组织神经元中mAPP在668位点的苏氨酸被神经元细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5，糖原合成酶激酶3等激酶调节，发生磷酸化，尽管该位点磷酸化整体的生理意义仍需要进一步研究，Ming-SumLee等人发现磷酸化的APP可优先被BACE1剪切，可能通过提高BACE1对APP的剪切效率，使得脑内产生更多的A[7]。形成的Aβ主要以Aβ1-40与Aβ1-42这两种形式停留在细胞外。由于Aβ1-42的可溶性，使得大部分的Aβ1-42与伴侣蛋白分子结合，而留存在人体内少数游离状态的Aβ1-42可逐渐聚集形成低聚体，当星型胶质细胞诱导炎症反应时，低聚体即可形成直径10-120μm的成熟不可溶的老年斑[1]。许多种的神经细胞都可产生Aβ，产生的Aβ在血液，脑脊液和脑间质液中循环，虽然Aβ1-42含量比Aβ1-40低，但是Aβ1-42的毒性更大，并且Aβ1-42聚集形成Aβ沉淀较容易一些，神经毒性因此而产生。。它们在脑内不断产生，造成大脑海马及皮层部分逐渐萎缩，引起病人的认知能力逐渐降低，造成记忆力下降。该病进展缓慢，随着时间的推移不断恶化，严重影响患者的日常生活。最近几年，生活节奏的加快导致生活压力也不断增大，雾霾频现，空气污染严峻等环境因素造成AD患者年轻化，短时间内引起AD患者人数不断增加。国际阿尔茨海默病协会（ADI）在2016年公布的数据中显示全球约有4.68×107例痴呆患者，每年新增的痴呆患者约有9.90×106例，平均增加1例患者只需三秒，到2050年全球将有13.15×107位痴呆患者，其中50%-75%为AD患者。据统计，中国约有1.0×107名AD患者，预计在2040年将达到2.20×107人[8]，AD患病率超过55岁的人群大约有3%，超过65岁的人群患病率大约有5%，超过70岁的人群患病率大约有10%，超过80岁的人群患病率大约有30%，而超过85岁的人群患病率高达40%；面对如此严峻的现实，然而目前并没有有效的治疗手段，因此对AD的干预及治疗需要进行不断深入的探究。1.2Wnt/β-catenin信号通路经典的Wnt/β-catenin通路是一种进化中高度保守的信号通路，不仅在神经元的生长、发育、凋亡和干细胞维持等过程中发挥重要作用，而且在轴突的形成、突触的发生、突2 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制触囊泡循环等发挥重要的作用[9]。Wnt信号通路的组成主要包含细胞外的Wnt配体蛋白、细胞膜上的受体、细胞浆内的信号转导部分和核内的转录调控部分。经典的Wnt/β-catenin通路中最重要的信号转导因子是β-catenin，其在细胞质和细胞膜上都有存在。在Wnt/β-catenin信号通路中断失去效用时，胞质中的β-catenin被包括糖元合成酶激酶（glycogensynthasekinase-3,GSK3）在内的蛋白复合体磷酸化，E3泛素连接酶可以识别磷酸化后的-catenin，蛋白酶体可以降解被E3泛素识别后的-catenin，因此细胞质中-catenin浓度就降低了，从而影响-catenin进入核内，导致靶基因的转录停止处于抑制状态。当Wnt/β-catenin通路被激活时，就抑制了GSK3的活性，磷酸酯酶（PP2A）活性就增强了，从而阻止了-catenin的磷酸化和降解[10-12]，胞内-catenin的含量就有所提高，随后在进入细胞核内与转录因子T细胞因子及淋巴结合增强子（T-cellfactor/lymphoidenhancerbindingfactor,TCF/LEF）结合，解除靶基因转录时的抑制状态，转换到激活状态，启动Wnt通路下游的靶基因如survivin、c-myc等转录，维持细胞生[13，14]长，如下图所示：图1.2经典的Wnt/β-catenin通路示意图Wnt/β-catenin通路与AD的发生相关，β-catenin可以与Presenilin-1结合形成复合体，能够提高β-catenin的稳定性，β-catenin进入细胞核与转录因子TCF4结合，抑制BACE1基因的转录[15]，细胞表达BACE1减少，从而减少对APP的剪切，Aβ的生成减少。但是在偶发性及家族性AD患者脑内Presenilin-1蛋白发生突变，引起β-catenin降解增加，使得患者脑组织中的β-catenin水平显著下降，与此同时伴随着PP2A活性下降和GSK3β[9，16]活性过度激活，从而使神经元对Aβ沉积引起的神经元凋亡更加敏感。这些报道表3 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制明Wnt/β-catenin通路在AD的病理生理机制中发挥重要作用，激活AD患者脑内失活的Wnt/β-catenin通路有可能是治疗AD的一个有效途径。1.3嗅球在阿尔茨海默症中的病理变化嗅球主要由嗅神经层、嗅小球细胞层、外网丛细胞层、僧帽细胞层和颗粒细胞层组成。在鼻腔里面，嗅上皮上的嗅感觉神经元接触到空气中的挥发性化学物质，这些物质与相应的受体结合，激活第二信使系统引起嗅觉神经元动作电位的产生，这些动作电位沿轴突传导至嗅觉系统的第一级处理中枢—嗅球。嗅球能够投射到海马(hippocampus)和杏仁核(amygdala)等一些与记忆和情绪相关的脑区[17]。除此之外，嗅球还接受许多来自中枢神经的离心纤维(centrifugalfiber)的下行投射。这些下行投射主要分为两类，一类来自嗅觉系统高级中枢的反馈投射(feedbackprojection)，如前嗅核、内嗅皮层、皮质杏仁核(corticalamygdaloidnucleus)等，参与嗅觉学习等相关过程，另一类来自斜角带核水平支(horizontallimbofdiagonalband,HDB)、蓝斑核(locuscoeruleus,LC)、中缝背核(dorsalraphenucleus,DR)等脑区的调制投射(modulatoryprojection)，决定对气味的感知觉和与之相关的记忆[18]，它们分别以乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟色胺(serotonin,5-HT)等为递质。嗅球中的神经元可以分为投射神经元和中间神经元。哺乳动物的嗅神经是由最主要的嗅神经元的轴突和位于嗅上皮的胞体组成。在中枢神经系统中，嗅觉系统因其发育和生理的特殊性，是用来认识和了解潜在的轴突生长机制研究最多的一个模型[19]。AD患者在出现认知功能障碍之前，普遍表现出嗅觉相关功能障碍，而且嗅觉系统病变程度与AD进展密切相关。据报道嗅球病变可作为早期诊断AD及其进展的指标[20]。在[21，22]AD病理早期，过度磷酸化的tau已在嗅球出现，临床数据表明Aβ沉积能够破坏嗅神经网络[23]。目前关于三转基因AD模型鼠嗅球的病理变化及其对嗅神经元突触生长、突触可塑性等的研究有限，因此探究AD的嗅球病理变化及转录组变化，寻找干预早期AD病理的靶点具有深远意义。1.4硒与阿尔茨海默症硒作为脑内的一种重要的必需元素，在中枢神经系统中具有重要作用，尤其对记忆[24，25]和认知功能方面。有报道证明在神经退行病如阿尔茨海默病、帕金森病以及肌萎缩、4 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制癫痫等患者体内出现严重的硒缺失[24]。通过硒蛋白的研究发现其最突出的功能是抗氧化作用[24-27]，例如谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidases,GPXs）和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductases,TXNRDs）等。GPXs是由4个各含1个硒代半胱氨酸的蛋白质亚基构成的四聚体，以离子化硒醇形式组成酶的氧化还原活性中心。哺乳动物所含的GPXs有较高催化活性，可以快速的将体内过剩的活性氧（ROS）除去。GPXs家族的GPX1和GPX[25]4是目前被发现的脑内重要的蛋白。GPX1在神经元和星形胶质细胞中均有表达，是体内ROS的清道夫。ROS导致蛋白质结构发生突变，使蛋白质丢失生物活性，同时生物体内的DNA也易被ROS攻击，导致DNA双链断裂、DNA突变、DNA畸变等，这些改变的DNA进一步影响DNA的复制、转录和翻译，最终造成蛋白质的表达发生异常，GPX1清除掉脑内过多的ROS，可显著改善ROS对大脑的破坏[28]。在神经元的胞浆和线粒体内，GPX4催化磷脂氢过氧化物的还原，可以快速的将细胞中的过氧化物分解为醇和水，保护细胞中的膜结构免受过氧化物的损害，对维持细胞的正常功能具有重要作用[29]。TXNRDs是生物体内依赖NADPH氧化还原调节蛋白，它主要作用其底物分子硫氧还蛋白，维持细胞的氧化还原平衡及调控氧化还原所介导的信号转导，从而控制细胞的增殖、分化和凋亡等重要的生理过程。目前报道的TXNRDs家族在脑内主要有TXNRD1和TXNRD2两类，主要负责清除细胞内的过氧化氢，减少氧化应激产生的基因异常表达，降低细胞毒性反应，同时调节氧化还原敏感转录因子控制胞内转录机制[30]，这些硒酶均[28，31]对AD的治疗具有重要作用。水及食物中的硒以亚硒酸钠、硒酸钠、硒代半胱氨酸及硒代蛋氨酸等形式补充到体内。许多研究发现硒的摄入量与AD的发病率密切相关[32]。硒代蛋氨酸可改善三转基因[33，34]AD模型鼠的认知功下降能和突触功能丢失，抑制NFT的产生并且降低A斑块。过去研究认为硒酸钠因为其以高价态硒存在，因此利用率低。但是现在越来越多的研究认为相比其他硒的化合物，硒酸钠显著的促进磷酸酶的活性，可作为2A型磷酸酶（PP2A）[35，36][37]特殊的激活剂。在哺乳动物脑内tau的磷酸酶活性中PP2A占70%，且负责非活[38，39]性β-catenin和磷酸化APP的去磷酸化。常用的PP2A的抑制剂有LB-100、冈奇酸、花萼海绵抑癌素A和福司曲星等。药物靶向非活性PP2A有可能抑制tau的病理变化及[40，41]A的产生。目前关于硒酸钠治疗多种神经系统类疾病的研究均有报道，Sánchez-ElexpuruG等人研究发现硒酸钠可减轻癫痫模型小鼠记忆力下降的症状，并降低其脑内神经退行及胶质细胞过多的病理现象[42]。TanXL等人发现硒酸钠通过降低过度磷酸化的tau缓解反复5 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制性脑损伤病症[43]。ShultzSR等人研究发现硒酸钠通过提高PP2A的活性，减少过度磷酸化的tau缓解创伤性脑损伤症状。硒对嗅球的作用效果方面，张中豪等人发现硒代蛋氨酸能够显著降低三转基因AD模型鼠嗅球内的A的产生及神经纤维缠结，减少嗅球神经元的死亡。在AD模型鼠病[44，45]变的脑内，硒酸钠可激活PP2A减少过度磷酸化的tau和NFT的形成。然而，硒酸钠对AD病理过程中APP的剪切过程、Wnt/β-catenin通路及对嗅球的早期病理干预的影响并没有文献报道。1.5本实验研究目的和意义在本课题组前期研究基础中，我们发现硒酸钠可以降低三转基因AD模型鼠脑内过度磷酸化的tau、减少NFT的形成。但是关于硒酸钠减少A产生的具体机制仍不清楚。本研究发现硒酸钠通过对APPpT668的去磷酸化，减少BACE1对APP的剪切，以及硒酸钠激活AD模型鼠脑组织内失活的Wnt/β-catenin通路，抑制下游靶基因BACE1的转录，从而减少BACE1的表达，最终降低Aβ的产生。同时激活的Wnt/β-catenin通路其下游靶基因c-myc,survivin,GPX4,TXNRD2转录水平升高，提高神经元活性，降低神经元凋亡。在对AD的嗅球研究中，尽管单转基因及双转基因AD模型鼠中嗅球的病理变化已有报道，但其在三转基因AD模型鼠的病理变化以及硒酸钠的作用和机理，目前均缺乏深入研究。我们发现硒酸钠可干预三转基因AD模型鼠嗅球内发生的早期病理变化，通过对其转录组分析发现，硒酸钠影响和突触发育等相关基因的转录，提高突触的可塑性，提示硒酸钠可作为干预AD发生发展的一种潜在药物。6 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制第2章材料及方法2.1实验材料2.1.1动物模型和细胞模型2.1.1.1动物模型实验使用的3×TgAD小鼠及野生型小鼠（B6：129SF2/J）均购于美国Jax实验室。3×TgAD小鼠以杂合129/C57BL6鼠为背景构建，表达突变的人APPswe基因、tauP301L基因和突变的鼠PS1M146V基因。2.1.1.2细胞模型小鼠神经瘤母细胞(mouseneuroblastomaN2acells，N2a)，简称Neuro-2a细胞，购自中科院上海细胞所。N2a-APP695-swedish细胞（N2a-swe），是稳转APP695swedish突变基因的Neuro-2a细胞，该细胞作为AD病理研究的模型细胞，本实验室储存。2.1.2实验药物硒酸钠（Sodiumselenate）购于Sigma公司。2.1.3实验试剂表2-1实验主要试剂及厂家试剂名称产地氯化钠国药集团氯化钾国药集团磷酸氢二钠国药集团磷酸二氢钾国药集团NaOH国药集团SDS国药集团硝酸镧北京化学试剂硝酸银北京化学试剂7 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制硅钨酸北京化学试剂无水碳酸钠北京化学试剂碘化钾北京化学试剂高锰酸钾北京化学试剂多聚赖氨酸Sigma多聚甲醛Sigma醋酸钠北京化学试剂草酸北京化学试剂氯化金北京化学试剂甲醛天津大茂荧光抗猝灭封片剂碧云天蛋白酶抑制剂罗氏生物磷酸酶抑制剂罗氏生物无水乙醇天津大茂工业酒精南山化试技二甲苯国药集团石蜡Leica中性树胶南山化试技Tris碱上海生工甘氨酸（Gly）国药集团EDTA上海生工TEMED上海生工过硫酸铵上海生工Tween-20上海生工甲醇东江化学试剂有限公司4×蛋白loadingbuffer碧云天30%丙烯酰胺Biorad山羊血清武汉博士德羊抗鼠二抗Abmart羊抗兔二抗Abmart8 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制羊抗鼠DL488荧光二抗联科生物羊抗兔DL488荧光二抗联科生物羊抗兔DL594荧光二抗联科生物羊抗鼠DL594荧光二抗联科生物羊抗鸡DL594荧光二抗Abcam脱脂奶粉伊利化学发光液ECLThermol蛋白预染markerGenstarPVDF膜MilliporeAβ1-42一抗MilliporesAPPα一抗BiolegendsAPPβ一抗BiolegendCTFβ一抗BiolegendCreb一抗CellsignalingNR2A一抗AbcamNR2B一抗AbcamBACE-1一抗Abcamactiveβ-catenin一抗Cellsignalinginactiveβ-catenin一抗Cellsignalingβ-cateninpSer552一抗CellsignalingPSD-95一抗Abcamsynaptophysin一抗AbcamGSK-3β一抗CSTGSK3βpY216一抗AbcamPP2Ac一抗AbcamPP2ApTyr307一抗Abcamc-myc一抗SantaCruzsurvivin一抗ABclonalCleaved-caspase3一抗CellsignalingBcl-2一抗Cellsignaling9 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制Bax一抗CellsignalingGAPDH一抗proteintechTUNEL试剂盒Roche荧光定量PCR试剂盒Genstar总RNA提取试剂盒上海飞捷生物技术反转录试剂盒Takara2.1.4实验仪器表2-2实验主要仪器仪器名称生产厂家石蜡切片机Leica石蜡包埋机Leica通风柜深圳申立生物组织脱水机Leica立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司CO2恒温培养箱力康生物医疗科技有限公司洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司荧光定量PCR仪AABIPRISM7500水平摇床北京六一仪器厂超声波细胞粉碎机宁波新芝科技多功能酶标仪ThermoFIsher恒温水浴锅上海精宏小鼠独立通气笼苏杭科技器材有限公司Morris水迷宫仪器成都泰盟科技有限公司高压锅美的冰箱美的正置荧光显微镜CX51OlympusCorporation荧光共聚焦显微镜Zeiss微量移液器Gilson10 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制酶标仪Model550蛋白电泳仪Tanon电转仪Tanon电子分析天平（BS110S）Sartorius高速冷冻离心机5804RThermo显影仪Carestream-80度冰箱Thermo纯水仪Millipore2.1.5实验主要试剂的配制2.1.5.1WesternBlot试剂（1）10%过硫酸铵（AP）溶液：1g过硫酸铵，加ddH2O溶解后定容至10mL，现配现用，也可配好后分装后储存于-20℃。（2）分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8）：18.15gTris，加80mLddH2O溶解后，调pH至8.8，定容至100mL。（3）浓缩胶缓冲液（1mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8）：12.1gTris，加80mLddH2O溶解后，加HCl，调pH至6.8，定容至100mL。（4）10%SDS溶液：10gSDS加ddH2O溶解定容至100mL，放于37℃水浴溶解，SDS易产生泡沫，不易剧烈摇晃混匀。（5）10×电泳缓冲液：于800mL蒸馏水中分别加入30.3gTris（121.1）、144.1g甘氨酸（75.7）、10gSDS（288.38），混匀后加ddH2O定容至1L，37℃水浴溶解。（6）转膜缓冲液：1.5gTris，7.2g甘氨酸，加适量ddH2O溶解后，定容至400mL，加入100mL甲醇定容至500mL，使用时提前预冷。（7）10×TBS：12.14gTris、87.75gNaCl，加适量ddH2O调PH至7.6，定容至1L。（8）1×TBST：450mLddH2O，50mL10×TBS，2.5mL吐温-100。（9）封闭液：含5%脱脂奶粉的1×TBST。（10）抗体稀释液：1×TBST。2.1.5.2细胞免疫荧光试剂（1）4%的多聚甲醛（4%PFA）：4g多聚甲醛加入PBS中定容到100ml，分装-20℃11 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制保存。（2）0.2%Triton（PBST）：0.2mlTriton加入PBS中定容到100ml，4℃保存。（3）封闭液：山羊血清：PBST=1:9,4℃保存。2.1.5.3细胞系培养试剂：（1）N2A-swe细胞培养基：含5%胎牛血清（购自Gibco公司），1%青/链霉素（购自碧云天），45%opti-MEM培养基（购自Gibco公司），50%DMEM培养基（购自Gibco公司）。（2）0.25%胰蛋白酶：0.25g胰蛋白酶粉，溶于1×PBS，定容至1L。0.22um滤膜无菌过滤，-20oC保存。（3）保种培养基：90%胎牛血清，10%的DMSO，现配现用。2.1.5.4原代神经细胞培养试剂（1）终止液（50ml）：DMEM44.5ml，胎牛血清（购自Gibco公司）：5ml，双抗（购自碧云天）：500ul。（2）饲养液（50ml）：Neurobasal-AMedium（购自Gibco公司）:47.75ml，双抗：500ul，B27（购自Gibco公司）:1ml、Glutamine（购自Gibco公司）：250ul。（3）木瓜酶悬浮液（4ml）：DMEM：4ml，木瓜酶：40ul。（4）多聚赖氨酸（购自Sigma）：用PBS配成1mg/ml的母液-20℃避光保存，使用时用PBS稀释成0.1mg/ml的工作浓度。以上试剂现配现用，配好均需用0.22m的滤膜过滤。2.1.5.5Gallyas-Braak嗜银染色试剂（1）硝酸镧液：0.5g硝酸镧，2g醋酸钠加入100ml的ddH2O溶解。（2）碱性碘化银溶液：将4g氢氧化钠，10g碘化钾加入50ml的ddH2O中溶解，搅拌至清亮，加入1%的硝酸银3.5ml，待彻底溶解后用ddH2O将体积调至100ml。（3）显影原液Ⅰ：5g无水碳酸钠加入100ml的ddH2O中，避光常温保存。（4）显影原液Ⅱ：依次将0.2g硝酸铵，0.2g硝酸银，1g硅钨酸加入100ml的ddH2O中，避光常温保存。（5）显影原液Ⅲ：依次将0.2g硝酸铵，0.2g硝酸银，1g硅钨酸，0.61ml40%的甲醛溶液中加入100ml的ddH2O中，避光常温保存。使用前现取适量显影原液Ⅱ加入等量的显影原液Ⅰ中，剧烈搅拌，再加入等量显影原液Ⅲ，剧烈搅拌至澄清。12 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制2.2实验方法2.2.1小鼠分组及处理（1）将硒酸钠溶于ddH2O中，至终浓度为6μg/mL，用作给药组饮用水。选取二月龄的正常出生的野生型小鼠6只，作为正常对照，从二月龄起饮用ddH2O饲养10个月。同样选取正常出生的二月龄三转基因雄性小鼠12只，分为两组、每组6只，分别作为对照组和给药组，对照组为从二月龄起饮用ddH2O饲养10个月，给药组自二月龄起给药10个月。每只小鼠平均每天摄入饮水3-4mL，相当于摄入18-24μg硒酸钠，也相当于每天摄入硒元素7.5-10.0μg，用于研究硒酸钠对AD病理治疗的机制。（2）为了探究低浓度的硒对三转基因雄性小鼠嗅球病理干预，将硒酸钠溶于ddH2O中，至终浓度为3μg/mL硒酸钠，用作给药组饮用水。选取二月龄的正常出生的野生型小鼠6只，作为正常对照，从二月龄起饮用ddH2O饲养4个月。同样选取正常出生的二月龄三转基因雄性小鼠，分为两组，每组6只，分别作为对照组和给药组，对照组为从二月龄起饮用ddH2O饲养4个月，给药组自二月龄起给药4个月。2.2.2Morris水迷宫检测小鼠空间探索和记忆能力Morris水迷宫：迷宫为直径160cm，高50cm的圆形水池，水深26cm，水温保持在(22±2)℃，水池分为4个象限，在其中在一个象限内，放置一个直径12cm，高24cm的圆形(白色表面)站台，低于水面1-2cm。实验内容：分为定位航行及空间探索两部分。其中定位航行用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力，历时5d，空间探索用于测量小鼠对平台空间位置记忆的保持能力，历时1d。定位航行实验：将小鼠置于平台上适应10S，随后将小鼠从四个象限之一的对应位置面壁放入池内，小鼠登上平台2S后终止记录，最长记录时间为60S，若小鼠在60S内不能上台，放置平台10S。每天一次,连续5天从该固定象限放入小鼠，进行定位航行训练，并记录相关数据。空间探索为72h记忆：从定位航行结束时开始计时，将平台撤去，记录小鼠在原平台所在象限停留时间及跨越原平台的次数。水迷宫内置连接显示系统的摄像头于水池正上方，可实现对小鼠运动轨迹的同步记录，随后采用Morris水迷宫视频分析系统进行相关数据和信息处理。选取从六月龄的野生型、对照组和治疗组实验小鼠分别放置在不同的饲养笼中，逐一进行水迷宫实验检测。13 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制Morris水迷宫实验数据指标参数及整理：定位航行逃避潜伏期、平均速度；72小时记忆在原平台所在象限停留时间及跨越原平台的次数。通过水迷宫跟踪系统得出数据，利用GraphpadPrism5软件进行数据整理作图分析，多因素重复性方差分析逃避潜伏期，t检验分析组间差异，p<0.05具有显著性的统计学意义。2.2.3N2aSW细胞系的培养与保种（1）细胞的复苏：遵循“缓冻速溶”的原则，取出保存在液氮中的N2aSW细胞，于37℃水浴中轻轻摇动冷冻管，使其在2分钟内全部融化，1,000rpm离心，2min加入新鲜配好的培养基重悬后，加入细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养过夜。第二天更换新鲜的完全培养基。（2）细胞传代：当细胞生长到80%~90%的时候进行传代最为合适。细胞脱离CO2后容易脱落，而且细胞比较娇弱，所以操作要轻柔迅速。1）小心弃去营养代谢完的旧培养基，用1×PBS轻轻晃洗细胞2次，吸净废液。2）加入1mL0.25%的胰蛋白酶，轻轻晃动瓶子，使得胰蛋白酶液能覆盖细胞表面，来回2~3次后将胰蛋白酶吸出，室温消化1~5min。3）显微镜下观察，细胞皱缩呈圆形。此时，吸出胰酶，加入2mL完全培养基，轻轻将细胞从壁上吹下来，成为单细胞悬液。一般按1:2~1:4分入新的培养瓶中，再加入培养基（小瓶5mL，大瓶15mL），37℃，5%CO2培养。（3）细胞的冻存：为了使细胞能免受DMSO的损害，冻存液要事先配制，同时，还要采用遵循“缓冻速溶”的原则，缓慢降温冻存。1）在冻存管中加入100µLDMSO和100µL血清（N2A细胞）或100µL完全培养基，充分混匀，放置片刻待DMSO热量散尽。2）0.25%的胰蛋白酶后吸出，加入适量培养基悬浮细胞，收集细胞悬液至离心管中，1500rpm离心3min，弃上清液。3）往沉淀中加入适量冻存液(10%的DMSO、40%血清和50%的完全培养液)。4）细胞计数，将细胞的浓度调整至2×106/mL左右。5）将细胞悬液加入冻存管中，每管1-1.5mL。6）将冻存管口用封口膜封严。7）贴上标签，写明细胞的种类和冻存日期。8）放在梯度降温盒，-80℃(过夜)，放至液氮里长期保存。14 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制（4）细胞计数1）将细胞计数板与盖玻片用75%酒精擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上2）吸出少许细胞悬液，稀释100倍后，吸出10μL靠近盖玻片边缘缓慢加入，使细胞悬液充满计数板和盖玻之间。3）静置3min，使细胞悬液均匀铺满细胞计数板。4）显微镜下观察，计算细胞计数板上四大格的细胞总数，压线细胞只计上方和左侧的。按下式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×100002.2.4海马神经元培养分别取刚出生的B6129SF2/J小鼠及三转基因小鼠的海马组织，经木瓜酶消化，获得细胞按一定浓度种植并进行培养，当细胞生长达到合适状态用于各种原代神经元细胞实验1、实验准备工作：（1）按上述试剂配制方法将培养基、木瓜酶现配现用；（2）用具准备：培养瓶用0.1mg/ml多聚赖氨酸（sigma）预处理4h以上，使用时用PBS洗2-3次，培养箱内放置晾干；解剖器械、过滤网、枪头等灭菌；准备冰袋。2、原代神经元分离培养步骤：（1）将新生的小鼠，泡在酒精消毒后，断颈，剥除脑膜取出大脑；（2）将大脑置于预冷的终止液培养基中，解剖镜下去除筋膜和血管，血管膜一定要剥离干净，没剥离干净会导致吹打的时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，这样就会造成大量的神经细胞死亡，另外血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞会分裂，导致得不到质量高的原代神经细胞。整个过程在预冷的终止液中进行。（3）将分离出的组织尽量剪碎，用囊膜剪将得到的组织剪成0.5-1立方毫大小，移至15ml离心管中，移去终止液；加入2ml的木瓜酶溶液，37℃消化30min，去除木瓜酶，加入2-3ml终止液终止消化，静放3min（4）组织沉底，吸走终止液，加入2-3ml新的终止液静放3min。细胞吹打：组织沉底后，吸走旧的终止液加入3ml新鲜的终止液，用1ml枪缓慢吹打组织10下，等待组织沉到底部后，移走含有神经细胞的终止液到新的50ml管，再加入3ml新鲜的终止液，用1ml枪缓慢吹打组织10次，待组织沉底后，移走含有细胞的种植液到离心管，继续加4ml新鲜终止液缓慢吹打细胞10次，吸走含神15 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制经细胞的种植液到离心管中。最后经300目滤网过滤，经稀释到一定浓度移至处理后的培养板或瓶中，37℃，5%CO2培养箱中培养。（5）4-8h之后将终止液换成饲养液继续培养，之后每三天进行半量换液。4、原代神经元细胞种植密度原代神经元细胞种植密度与实验操作者可获得细胞悬液的密度很大关系，故本实验归纳如下：每只出生24小时内的的小鼠大脑左右半脑的上海马组织可共获得约2ml的细胞种植悬液，6孔板种植细胞悬液密度为1.5ml/孔，24孔板为500ul/孔，其他型号培养板以此类推。2.2.5细胞免疫荧光免疫荧光化学是根据抗原抗体反应的原理，将已知的抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体作为分子探针检查细胞内的相应蛋白。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞部位，从而确定相关蛋白在细胞内的分布与定位。（1）将培养好的细胞，以1ml的4%PFA固定20-30min，以4℃的PBS洗2次，每次5min。（2）0.2%TritonX-100（PBS配制）10min，PBS洗2次，每次5min；每孔500ul。（3）10%山羊血清（PBST配制），4℃封闭30min。（4）加入一抗，4℃孵育过夜；每孔300ul。（5）PBS洗3次，依次为5min，10min，15min；每孔1ml。（6）加入荧光二抗，室温避光孵育1h；每孔300ul。（7）PBS洗3次，依次为5min，10min，15min；每孔1ml。（8）5ug/mlDAPI染色3min，每孔500ul。（9）PBS洗3次，依次为5min，10min，15min；每孔1ml。（10）抗荧光猝灭剂封片，4度避光。（11）用共聚焦显微镜(Zeiss)拍片和分析数据。16 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制2.2.6腺病毒感染细胞使用构建好的含有绿色荧光蛋白（GFP）标记、β-连环蛋白（β-catenin，正向引物:TCCCAGTCCTTCACGCAAGAG；反向引物:GTGGCAAGTTCCGCGTCATC）特异的重组腺病毒感染N2aSW细胞和神经元，含有扰码序列的GFP标记重组腺病毒作为阴性对照组。重组腺病毒滴度约为5×1010pfU/ml，将已接种好的培养一定时间的细胞和神经元，根据病毒滴度与细胞数目，按照感染复数MOI=100，加入腺病毒，感染48小时后去掉培养基进行后续实验。2.2.7小鼠组织解剖及石蜡切片制作小鼠脑组织解剖流程：实验前进行解剖器械的消毒及相关准备工作，取实验小鼠用无水乙醚麻醉致死，用解剖剪剪下头部，拨开毛皮和肌肉，然后剪碎颅骨并向两侧掰开，使整个脑部暴露，迅速取出大脑及嗅球。将左右大脑及嗅球分开，左边大脑及嗅球用于病理切片检测；右边大脑及嗅球用于分子蛋白水平检测。脑组织石蜡切片流程：取出的新鲜脑组织迅速将其浸入4%多聚甲醛2-3小时后，更换一次4%多聚甲醛，并用水平摇床慢摇24h。然后放入全自动生物组织脱水机（Leica）设定的标准模式进行脱水、透明，然后用全自动包埋机浸蜡、包埋，使用切片机（Leica）进行切片。2.2.8组织免疫荧光染色免疫荧光染色与免疫组化原理大体相同，都是基于抗原抗体反应以达到对检测的抗原进行定性、定位研究。免疫荧光采用含有荧光标记的二抗，其优点在于可以最大程度降低背景色，且能够清晰的显示出所检测抗原的阳性区域。具体操作步骤如下：1）二甲苯（溶石蜡）浸洗5min；2）二甲苯1浸洗5min；3）二甲苯2浸洗5min；4）二甲苯无水乙醇溶液（1:1）浸洗3min；5）无水乙醇1浸洗3min；6）无水乙醇2浸洗3min；7）95%乙醇溶液浸洗3min；17 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制8）85%乙醇溶液浸洗3min；9）75%乙醇溶液浸洗3min；10）50%乙醇溶液浸洗3min；11）30%乙醇溶液浸洗3min；12）蒸馏水浸洗2min；13）PBS（PH7.4）浸洗3次，每次5min。14）抗原修复；加入抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液PH=6.0），高压5min，冷却后取出（并在组织周围用免疫组化油性笔画圈）。15）每块组织加50ul过氧化酶阻断溶液（免疫组化试剂盒试剂A以阻断内源性过氧化物酶的活性），室温孵育10min。16）PBS（PH7.4）浸洗3次，每次5min。17）每块组织加50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10min。18）除去血清，每块组织加50ul的第一抗体，4℃过夜。19）PBS（PH7.4）浸洗3次，每次5min。20）每块组织滴加100ul荧光标记二抗，避光操作，37℃孵育30min21）PBS（PH7.4）浸洗3次，每次5min，避光操作。22）荧光抗猝灭剂封片，镜检，拍照。2.2.9TUNEL细胞凋亡检测本研究采用罗氏凋亡检测试剂盒，按照实验说明书进行如下操作：1.组织切片的TUNEL染色。（1）组织切片脱蜡水合。1）二甲苯（溶石蜡）浸洗5min；2）二甲苯1浸洗5min；3）二甲苯2浸洗5min；4）二甲苯无水乙醇溶液（1:1）浸洗3min；5）无水乙醇1浸洗3min；6）无水乙醇2浸洗3min；7）95%乙醇溶液浸洗3min；8）85%乙醇溶液浸洗3min；18 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制9）75%乙醇溶液浸洗3min；10）50%乙醇溶液浸洗3min；11）30%乙醇溶液浸洗3min；12）蒸馏水浸洗2min；（2）将上述脱蜡水合后的组织切片浸入蛋白酶K（PCR级别）工作液，21-37℃下反应15-20min。（3）制备TUNEL反应混合液：移取100ul标记溶液（管2）至2个阴性对照样品。滴加50ul酶溶液（管1）至余下的管2标记溶液中（约450ul），得到总体积500ul的TUNEL反应混合液，将两种试剂均匀混合。（4）用PBS漂洗玻片2次。（5）吸干样品周围的水分，滴加50ulTUNEL反应混合液到样品。（6）加盖，37℃下避光和加湿环境下反应60min。（7）用PBS漂洗玻片3次，荧光显微镜下，加滴PBS，采用520-560nm激发波长，在570-620nm（红光）范围内进行荧光信号检测。1.原代神经元的TUNEL染色。（1）处理好的含有爬片的24孔板培养的原代神经元，在室温下每孔加入4%的多聚甲醛固定15min。（2）每孔加入1ml的PBS漂洗2次，每次5min。（3）每孔加入500ul的0.2%的Triton透膜10min。（4）每孔加入1ml的PBS漂洗2次，每次5min。（5）每孔加入1ml的0.3%H2O2的甲醇溶液，室温孵育15min。（6）每孔加入1ml的PBS漂洗2次，每次5min。（7）每孔加入现配好的TUNEL反应液50ul，37℃避光孵育30min。注意要确保反应液均一覆盖样品，为了避免蒸发，可盖上盖子。（8）每孔加入1ml的PBS漂洗2次，每次5min。（10）每孔加入100ul的5ug/mlDAPI复染5min，注意避光。（11）每孔加入1ml的PBS漂洗2次，每次5min。（12）荧光抗猝灭剂封片，荧光共聚焦显微镜拍片。19 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制2.2.10Gallyas-Braak银染Gallyas-Braak银染不同于传统的银染法，其使用了硝酸镧浸润组织片,去除非特异性组织结构使得神经组织中异常的变性结构更易着银显色,而不显示正常的神经组织结构，广泛用于观察脑组织切片内神经纤维缠结，老年斑等病理变化。具体染色步骤如下：1）二甲苯（溶石蜡）浸洗5min；2）二甲苯1浸洗5min；3）二甲苯2浸洗5min；4）二甲苯无水乙醇溶液（1:1）浸洗3min；5）无水乙醇1浸洗3min；6）无水乙醇2浸洗3min；7）95%乙醇溶液浸洗3min；8）85%乙醇溶液浸洗3min；9）75%乙醇溶液浸洗3min；10）50%乙醇溶液浸洗3min；11）30%乙醇溶液浸洗3min；12）蒸馏水浸洗2min；13）将以上水洗后的5μm厚的切片浸入0.3%的高锰酸钾溶液10min，自来水冲洗后ddH2O冲洗。14）硝酸镧液1h，ddH2O洗三次，每次5min。15）碱性碘化银液37℃温箱孵育45min，1%的醋酸洗三次，每次1min。16）配制好的银染显影液显影约30min，观察切片变淡棕色停止。17）1%醋酸洗三次，每次1min。18）0.5%氯化金溶液浸泡1min，ddH2O冲洗。19）1%的硫代硫酸钠溶液固定1min，水洗10min。20）乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检，拍照。2.2.11Q-PCR检测1、从组织及细胞中提取总的mRNA本研究使用上海飞捷生物技术生产的总RNA快速抽提试剂盒（Catalogno.22014020 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制50次）。首先将样品进行预处理，组织块：剪切成小块后放入1ml的EP管中，加入PBS（约1ml/30mg组织）用研磨棒将组织研磨，离心收集悬液，放入新的EP管中；神经元细胞：消化后用PBS充分吹打培养皿，直至没有细胞团块，取100μl了放入EP管中。1）处理好的样本中，加入RB1液1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。2）加入氯仿200μl，充分颠倒混匀1min，离心5min。3）将上清液小心转移到RNase-free的EP管中，注意只取上清，不要吸取任中间层物质。4）加入RB2液350μl，充分颠倒混匀1min。5）将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管，离心1min。6）弃去外套管中液体，内套管中加入500μl洗液，离心1min。再重复此过程洗一次。7）取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。8）将内套管移入新的EP管中，在膜中央加入洗脱液（或pH>7.0的DEPC处理水）25-50μl，室温静置1min，离心1min，获得总RNA。2、反转录获取cDNA按照Takara反转录试剂盒说明书进行如下操作。1）去除基因组DNA反应。按照如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性。进行各项反应时，应先按反应数+1的量配制mastermix，然后分装到每个反应管中，最后加入DNA样品。注意使用SYBRGreenQPCR法最多可使用1.0μg的总RNA。表2-3去除基因组DNA主要试剂及用量试剂使用量5xgDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA1.0μlRNaseFreeddH2O6.0μl2）配制好的反应液混匀，置于42℃，2min，然后冰浴。3）进行反转录反应。根据如下成分按照反应数+1的量冰上配制反应液，然后每个反应管按照10μl的量分装。21 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制表2-4反转录主要试剂及用量试剂SYBRGreenqPCR用量步骤1的反应液10μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTRrimerMix1.0μl5xPrimeScriptBuffer2(forrealtime)4.0μlRNaseFreeddH2O4.0μlTotal20μl4）将上述配制好的反应液混匀，置于37℃，反应15min，继之以85℃反应5sec，然后置于冰上，若cDNA长期保存时可放于-20℃。5）参照NCBI提供的小鼠基因序列，设计合成下表中基因的正反引物，并配置引物贮存液。表2-5目的基因正反引物PrimernameForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)GPX1CAGGAGAATGGCAAGAATGAGAAGGTAAAGAGCGGGTGGGPX4GCAGGAGCCAGGAAGTAATCGGCTGGACTTTCATCCATTTTXNRD1TCGTGGTGGACTTCTCTGAGCAACATCCTGGCAGTCATTXNRD2GTTCCCCACATCTATGCCATTGGGTTGAGGATTTCCCAAAGCGAPDHGTCGGTGTGAACGGATTTGGAATTTGCCGTGAGTGGAGGrin2aACGTGACAGAACGCGAACTTTCAGTGCGGTTCATCAATAACGGrin2bGCCATGAACGAGACTGACCCGCTTCCTGGTCCGTGTCATCCreb1CCACCTGTGCCATAGCTTTCTTTGATTCCATTTATTTGAAATTTCTCAChrm2TGGTTTGGCTATTACCAGTCCTCTGAAGGTGGCGGTTGACTTGfapCCCTGGCTCGTGTGGATTTGACCGATACCACTCCTCTGTCGng13AGAGCCTCAAGTACCAACTGGCTTCTCTACCCAAGGGTTGTTC6）建立如下PCR反应体系。表2-6PCR反应主要试剂及用量试剂使用量终浓度DNA模板1μl0.5ng/μl正向引物（4μM）1μl0.2μM反向引物（4μM）1μl0.2μM2xRealStarbGreenPowerMixture10μl1xRNase-freeH2O7μl/7）三步法PCR扩增程序：95℃，15sec；60℃，30sec；72℃，30sec，40个循环，保持曲线及溶解曲线仪器自动设置。22 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制2.2.12Western-Blot检测小鼠脑内相关蛋白的表达情况称量海马的质量，按质量与体积比1:9加入1×TBS，并加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂。超声破碎组织，离心，取上清即为可溶性蛋白，分装冻存至-80℃冰箱；采用BCA法对样品进行蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳分离，进行Western-Blot检测。1、BCA法对样品进行蛋白定量1）标准曲线的制作：取一块96孔酶标板，按下表加入试剂表2-7蛋白的浓度梯度管号01234567所加溶液BSA蛋白质标准液（μl）01248121620蒸馏水（μl）2019181612840蛋白质终浓度（μg/μl）00.51.02.04.06.08.010.02）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50/1）配制适量BCA工作液，充分混匀；取待测样品稀释至20ul加入酶标板孔中；3）各孔加入200ulBCA工作液；4）将酶标板放在振荡器上轻微振荡30s，37℃放置30分钟，酶标仪562nm下进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量（ug）为横坐标，吸光值为纵坐标，做标准曲线；5）根据待测样品吸光值与标准曲线进行计算即可获得样品相应的蛋白浓度（ug/ul）。2、Westernblot检测相关蛋白的表达（1）配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）1）配制分离胶：根据将要检测的目的蛋白分子量大小，计算出胶的浓度。2）待分离胶凝集后，吸去酒精，配制浓缩胶，插入预先准备好的梳子。3）待胶凝集好后，上蛋白样品，每孔上样蛋白10-15μg左右，蛋白预染Marker上样5μl，上样要避免产生气泡。电泳：上层浓缩胶用80V电压，当样品至下层分离胶时，用120V电压。4）一般电泳时间在2h左右。电泳时，内槽一定要用新配置的1×SDS电泳液，外槽可用回收的电泳液。（2）转膜23 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制电泳完成后将凝胶板放在电泳缓冲液中浸泡几分钟。打开胶板，将胶放置于平板上，切除浓缩胶，根据Marker大小分离出所要的分离胶并泡在电转液中。根据所取分离胶的大小剪取滤纸（三层），并根据滤纸大小剪取PVDF膜，转膜前先将膜浸泡一下甲醇，尽量避免污染滤纸和膜，将裁好的滤纸和膜完全浸泡于电泳转移缓冲液中以驱除留于滤纸的气泡。打开转移盒，将浸透后的海绵垫放于转移盒壁上，再放一张电泳转移缓冲液浸湿的滤纸于海绵上。按“黑色胶板—海绵—3层滤纸（大）—凝胶—膜—3层滤纸（小）—海绵”的顺序装置好（注意每放一层都需要赶走气泡），再倒一些电转液到膜上，保持海绵，滤纸，膜的湿润。将缓冲液槽装入冰盒，将4℃预冷的电泳转移缓冲液注满电泳槽。连接好转移电极恒流100mA转移1.5h。（3）封闭转膜结束后将膜放入5%脱脂牛奶（1×TBST溶解）中37℃水平摇床上封闭1h。（4）一抗孵育将所需检测抗体稀释至适当倍数加入封闭液中达到工作浓度，注意保证膜的所有部分同溶液接触。一般采用37℃摇床孵育2h或4℃过夜。可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。（5）洗涤一抗孵育完成后，将膜取出来放置于干净平皿中，用1×TBST在摇床适当转速洗涤10min左右，换液，反复3次。（6）二抗孵育根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（1×TBST稀释），洗涤完成后加入二抗3ml左右室温下于摇床孵育2h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。（7）洗涤弃去二抗，膜条置于干净的培养皿中，加入1×TBST，在摇床上洗涤，洗涤15min左右，换液，重复3次。（8）显色——增强化学发光法（ECL）1）将两种显色底物A液1ml，B液1ml混合。2）将混合物均匀滴加覆盖在膜表面1-2分钟，使用Carestream显影仪进行曝光显影，可见发光的条带（避光）。3）曝光完成，将图片保存以待分析。（9）数据图片整理及分析24 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制利用quantityone光密度分析软件对图片进行灰度值分析，多因素重复性方差分析逃避潜伏期并进行组间t检验；利用Graphpad软件进行数据整理作图分析，p<0.05具有显著性的统计学意义。25 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制第3章实验结果3.1硒酸钠降低Aβ产生的分子机制硒酸钠作为PP2A的激活剂能够显著降低tau蛋白的过度磷酸化，但是关于其对Aβ的影响，目前仍没有研究，本研究选用2月龄的AD模型小鼠给药10个月，到12月龄时检测Aβ的表达，并探究硒酸钠降低Aβ产生的分子机制。3.1.1硒酸钠提高阿尔茨海默病模型鼠海马区突触的表达突触素（synaptophysin）是一种突触囊泡蛋白，它存在于大脑和脊髓中的神经元突触，主要参与突触传递，常被用来突触定量[46]。A沉积具有神经毒性，严重影响突触的生长和传递，且AD患者脑中，有出现突触丢失的现象[47]。3.1.1.1硒酸钠提高原代神经元突触素的表达为了检测AD模型鼠突触的数量，我们原代培养的新生鼠海马区神经元细胞水平上检测突触素的表达。发现，相对于野生型原代神经元，AD神经元的突触素蛋白表达降低，硒酸钠处理后可以逆转这些病理变化，提高突触素的表达（图3.1）。图3.1硒酸钠促进原代神经元突触的生长免疫荧光染色观察各组海马神经元细胞骨架（MAP2，红色）及突触素（Syna，绿色）表达及分布情况，使用DAPI（蓝色）进行核复染，标尺=100μm。26 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制3.1.1.2硒酸钠提高AD模型鼠海马区突触素的表达为了进一步证明，我们通过组织的免疫荧光染色，发现相比野生型小鼠，AD模型鼠海马区的突触素表达降低，硒酸钠饲养组AD模型鼠突触素的表达升高（图3.2）。图3.2硒酸钠提高海马区突触素的表达免疫荧光染色观察各组海马区组织突触素（Syna，绿色）表达及分布情况，使用DAPI（蓝色）进行神经元细胞核复染，标尺=100μm。3.1.2硒酸钠对阿尔茨海默病模型鼠海马区Aβ通路的影响3.1.2.1硒酸钠对阿尔茨海默病模型鼠海马区Aβ相关蛋白的影响在之前的研究中，我们已经报道了硒酸钠减少AD模型鼠海马区内NFTs和APs的产生[48]。为了进一步证明硒酸钠可以减少Aβ的产生，我们检测了Aβ通路的相关蛋白。APP被BACE1剪切形成sAPP及C99，后者进一步被γ分泌酶剪切形成A。在本研究中我们发现，相比同月龄的野生型鼠，AD模型鼠海马区内APP，BACE1，sAPP和CTF的表达显著升高。给药硒酸钠组同月龄AD鼠海马区内总的APP表达水平没有改变，但是BACE1，sAPP和CTF显著降低，同时硒酸钠提高sAPP的表达水平，表明硒酸钠能够通过提高sAPP的表达保护AD模型鼠（图3.3）。27 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.3硒酸钠降低Aβ级联通路相关蛋白的表达水平A：Westernblot检测A级联通路相关蛋白；B：各蛋白表达水平相对定量；*p<0.0５，**p<0.01，***p<0.001；n=4。3.1.2.2硒酸钠对阿尔茨海默病模型鼠海马区APP-pT668及Aβ相关蛋白的影响更进一步研究发现，相比同月龄的野生型鼠，AD模型鼠海马区内APP-pT668水平显著高于AD模型鼠，给药组APP-pT668显著降低。同时，A42的水平也明显降低（图3.4）。APP在苏氨酸668位点出现磷酸化，有利于BACE1剪切APP增加A的产生。图3.4硒酸钠降低A和APP-pT668的表达水平Westernblot检测两种蛋白的表达水平，**p<0.01，***p<0.001；n=4。3.1.3硒酸钠提高PP2A的活性降低GSK3的活性PP2A的活性由Tyr307(Y307)位点的磷酸化调节。在本研究中海马区PP2A催化亚基PP2Ac的表达水平并没有显著变化。PP2A在Y307位点的磷酸化在AD模型鼠海马区内显著升高，给药组出现显著下降。GSK3b的活性受Tyr216(Y216)和Ser9(S9)位点的磷酸化调控，有研究报道Tyr216的磷酸化是GSK3b活性所必需的。在本研究中，硒酸钠显著抑制AD模型鼠海马区GSK3β-pY216的表达水平（图3.5）。28 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.5硒酸钠提高PP2A的活性降低GSK3β的活性A：Westernblot检测PP2A、GSK3β及它们的磷酸化蛋白；B：各蛋白表达水平相对定量；**p<0.01，***p<0.001；n=4。3.1.4硒酸钠提高-catenin的活性3.1.4.1硒酸钠对海马组织-catenin免疫荧光的影响在细胞中，PP2A、GSK3与-catenin等蛋白质形成蛋白复合体，GSK3调控支配着-catenin在Ser33/Ser37/Thr41(S33/S37/T41)位点的磷酸化，磷酸化的-catenin泛素化，被蛋白酶体降解。在本研究中AD组海马组织中发现，-catenin的表达水平低于野生型组，给药组明显改善这一现象（图3.6）。图3.6硒酸钠提高AD模型鼠海马组织β-catenin的表达免疫荧光染色观察各组海马区组织活性的β-catenin（绿色）表达及分布情况，使用DAPI（蓝色）进29 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制行神经元细胞核复染，标尺=100μm。3.1.4.2硒酸钠对海马区原代培养神经元-catenin免疫荧光的影响相比野生型，本研究发现AD组原代培养神经元内的active--catenin降低，硒酸钠处理后明显改善这一现象（图3.7）。图3.7硒酸钠提高AD模型鼠海马组织-catenin的表达免疫荧光染色观察各组海马神经元细胞骨架（MAP2，红色）及active-β-catenin（绿色）表达及分布情况，使用DAPI（蓝色）进行神经元细胞核复染，标尺=100μm。3.1.4.3硒酸钠对海马组织-catenin蛋白表达的影响相比野生型组小鼠，AD模型鼠的海马组织-catenin的含量降低，给药组活性-catenin（在S33/S37/T41位点非磷酸化）的表达显著升高，非活性-catenin（在S33/S37/T41位点磷酸化）则相反（图3.8）。图3.8硒酸钠降低-catenin的磷酸化Westernblot检测-catenin的磷酸化及非磷酸化表达水平，**p<0.01，***p<0.001；n=4。30 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制3.1.5硒酸钠抑制AD模型鼠海马区组织细胞凋亡凋亡细胞可以使用TUNEL法进行检测，通过标记断裂的DNA链末端游离的3’-OH与荧光素-dUTP原位杂交。通过荧光显微镜直接检测凋亡的DNA片段，根据荧光密度的柱形图分析，发现硒酸钠显著降低AD模型鼠海马区内神经细胞的凋亡（图3.9）。图3.9硒酸钠降低AD模型鼠海马区细胞凋亡TUNEL法检测神经细胞的凋亡（红色），使用DAPI（蓝色）进行核复染，***p<0.001；每组4只小鼠。3.1.6硒酸钠激活AD模型鼠脑内失活的Wnt通路3.1.6.1硒酸钠对Wnt通路下游survivin和c-myc蛋白表达的影响Survivin和c-Myc是Wnt通路影响最直接目的基因，-catenin进入细胞核后可上调其转录。在本研究中发现AD组海马区Survivin和c-Myc表达降低，给药组其表达量升高（图3.10）。图3.10硒酸钠促进Wnt通路下游相关蛋白的表达Westernblot检测Survivin和c-Myc表达水平，**p<0.01，***p<0.001；n=4。31 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制3.1.6.2硒酸钠对Wnt通路下游蛋白Bcl-2，Bax和cleavedCaspase3表达的影响Bcl-2，Bax和cleavedCaspase3是细胞凋亡的是三个关键蛋白，在AD组Bcl-2的水平显著低于野生型鼠，而Bax和cleavedCaspase3则相反，给药组这些现象均出现逆转（图3.11）。图3.11硒酸钠影响凋亡相关蛋白的表达Westernblot检测wnt通路相关蛋白表达水平，**p<0.01，***p<0.001；n=4。3.1.7硒酸钠激活Wnt通路的靶点是PP2A3.1.7.1LB-100抑制PP2A的活性当PP2A降低-catenin在Ser33/Ser37/Thr41(S33/S37/T41)位点的磷酸化时，-catenin结构稳定，进入细胞核后与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）蛋白家族结合，激活survivin和c-myc基因等，而硒酸钠是PP2A的激活剂，为了证明硒酸钠通过PP2A激活Wnt/-catenin信号通路，培养原代新生鼠海马区神经元细胞，对AD组分别给予硒酸钠及硒酸钠和PP2A抑制剂（LB-100）处理，发现LB-100抑制了PP2A的表达，对GSK3活性没有显著影响（图3.12）。32 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.12硒酸钠提高神经元内PP2A的活性降低GSK3β的活性A：Westernblot检测加入PP2A抑制剂LB-100后神经元内PP2A、GSK3β及它们的磷酸化蛋白；B-G：各蛋白表达水平相对定量；*p<0.0５，**p<0.01，***p<0.001；n=3独立重复实验。3.1.7.2硒酸钠通过激活PP2A的活性影响-catenin的表达硒酸钠提高AD组神经元内-catenin的表达，但同时加入LB-100与硒酸钠时，-catenin的表达降低（图3.13）。图3.13抑制PP2A的活性降低-catenin的表达Westernblot检测加入PP2A抑制剂LB-100后神经元内-catenin的相对含量。**p<0.01，***p<0.001；n=3独立重复实验。3.1.7.3硒酸钠通过激活PP2A的活性影响-catenin的表达进而影响Aβ级联通路加入LB-100后Ab通路的关键蛋白BACE1，sAPPb，APP-pT668和Aβ1-42等表达升高（图3.14）。33 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.14硒酸钠提高神经元内PP2A的活性降低Aβ的产生A-C：Westernblot检测加入PP2A抑制剂LB-100后神经元内BACE1，sAPP蛋白相对表达；D-F：Westernblot检测加入PP2A抑制剂LB-100后神经元内APP-pT668和Aβ蛋白相对表达，*p<0.0５，**p<0.01，***p<0.001；n=3独立重复实验。3.1.7.4硒酸钠通过激活PP2A的活性影响Wnt通路下游相关蛋白的表达通过检测原代培养的神经元内凋亡相关蛋白的表达发现，相比AD组，给药组Bax和cleavedcaspase-3的表达显著下降，加入LB-100后，这些蛋白的表达上升。同时，AD组神经元内Bcl-2的表达显著降低，加入硒酸钠其表达量上升，同时加入LB-100后表达量再次降低（图3.15）。图3.15硒酸钠提高PP2A的活性影响凋亡相关蛋白的表达Westernblot检测加入PP2A抑制剂LB-100后神经元内wnt通路相关蛋白的表达，*p<0.0５，**p<0.01***p<0.001；n=3次独立重复实验。34 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制3.1.7.5硒酸钠通过激活PP2A的活性降低神经元凋亡采用TUNEL法检测原代培养的海马神经元的凋亡，通过荧光共聚焦显微镜观察，发现相比野生型原代神经细胞，AD模型原代神经元凋亡率明显升高，硒酸钠处理组神经元凋亡率降低，同时给予硒酸钠和PP2A抑制剂LB-100处理发现神经元的凋亡率增加（图3.16）。图3.16硒酸钠通过激活PP2A减少神经元凋亡TUNEL法检测神经元的凋亡（红色），使用DAPI（蓝色）进行核复染，***p<0.001。3.1.8敲低β-catenin对Aβ级联通路相关蛋白的影响3.1.8.1敲低β-catenin对N2aSW细胞内Aβ1-42表达的免疫荧光影响N2aSW是一种稳转APP695swedish突变基因的AD模型细胞系，可产生Aβ。在本研究中，N2aSW感染含有重组的β-catenin腺病毒(Ad-sh-β-catenin-GFP，forwardprimer：TCCCAGTCCTTCACGCAAGAG;reverseprimer:GTGGCAAGTTCCGCGTCATC)，对照组感染含有短的发夹RNA的干扰序列的重组腺病毒（Ad-scramble-GFP），干扰效率通过含有的GFP荧光强度检测，β-catenin敲低后，免疫荧光检测N2aSW细胞系内Aβ1-42的表达，发现β-catenin敲低组的Aβ1-42的荧光强度明显降低（图3.17）。35 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.17敲低β-catenin的表达增加Aβ产生免疫荧光染色观察各组腺病毒感染（GFP标记，绿色）细胞内Aβ（红色）的表达情况，使用DAPI（蓝色）进行核复染，标尺=10μm。3.1.8.2敲低β-catenin对N2aSW细胞内Aβ通路相关蛋白影响Western-blot检测两组N2aSW细胞内BACE1，sAPPβ和Aβ1-42，发现β-catenin敲低组，这些蛋白的表达显著升高（图3.18）。图3.18敲低β-catenin的影响Aβ级联通路相关蛋白的表达A-F：Westernblot检测β-catenin敲低后N2a细胞内Aβ级联通路相关蛋白的表达，*p<0.0５，**p<0.01；n=3独立重复实验。3.1.9敲低β-catenin对神经元内相关硒酶的影响培养新生小鼠海马区神经元内GPXs和TXNRDs的mRNA表达水平，发现硒酸钠显著提高AD组新生小鼠海马区内GPX1，GPX4，TXNRD1和TXNRD2的表达。培养野36 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制生型初生小鼠海马区神经元，实验组感染重组的β-catenin腺病毒(Ad-sh-β-catenin-GFP)，对照组感染含有短的发夹RNA的干扰序列的重组腺病毒（Ad-scramble-GFP），干扰效率通过含有的GFP荧光强度检测，发现β-catenin敲低后，神经元内GPX1，GPX4，TXNRD1和TXNRD2的表达显著降低（图3.19）。图3.19敲低β-catenin的影响神经元内硒酶mRNA的表达A-B：Q-PCR检测硒酸钠处理后原代神经元内硒酶mRNA的表达；C-D：敲低β-catenin的原代神经元内mRNA的表达；*p<0.0５，**p<0.01；n=5次独立重复实验。3.2硒酸钠对AD模型鼠脑部嗅球的作用及转录组研究大量研究表明，嗅球病理变化可作为AD症状早期检测的一个指标，本研究主要探究硒酸钠对AD嗅球的病理干预及对其转录组的影响。3.2.1硒酸钠对AD模型鼠嗅球早期病理发生的干预3.2.1.1硒酸钠作用的行为学结果Morris水迷宫检测野生型组，3×TgAD组和加药组小鼠行为学的变化。在定位航行试验中，三组小鼠游泳速度相对一样的情况下，3×TgAD小鼠从第一天至第五天逃避潜伏期均比野生型小鼠高；给3×TgAD小鼠喂硒酸钠治疗组，其在不同检测时间点逃37 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制避潜伏期表现出下降趋势，与野生型小鼠接近（图3.16A-B）。在空间探索实验中，通过小鼠跨越平台次数及在目的象限停留时间检测小鼠的空间记忆能力，发现硒酸钠能够提高小鼠的空间记忆能力（图3.20C-D）。图3.20Morris水迷宫实验A：小鼠定位航行实验中小鼠逃避潜伏期；B：小鼠定位航行实验中小鼠平均游泳速度；C：小鼠72h内跨越原平台次数；D：小鼠72h内原平台象限所停留时间；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n=6。3.2.1.2硒酸钠降低嗅球内Aβ的表达通过Westernblot检测三组小鼠嗅球内Aβ的表达，发现相比野生型，AD模型鼠嗅球内的Aβ显著增加，硒酸钠给药组显著降低（图3.21）。图3.21硒酸钠显著降低Aβ的产生（**p<0.01，***p<0.001；n=4）3.2.1.3硒酸钠降低嗅球内磷酸化tau通过Westernblot检测三组小鼠嗅球内磷酸化tau的表达，发现相比野生型，AD模型鼠嗅球内的磷酸化tau显著增加，硒酸钠给药组显著降低（图3.22）。38 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.22硒酸钠显著降低tau蛋白的过度磷酸化（***p<0.001；n=4）3.2.1.4降低嗅球内神经纤维缠结HE染色对小鼠嗅球结构进行染色，小鼠嗅球结构主要有颗粒细胞层（GCL）、僧帽细胞层（MCL）、嗅小球细胞层（GL）（图3.23A）。Gallays染色观察嗅球内神经纤维缠结，发现硒酸钠显著降低嗅球内神经纤维缠结（图3.23B）。图3.23硒酸钠显著降低嗅球内神经纤维缠结A：嗅球结构的HE染色结果，嗅球（mainolfactorybulb,MOB）；B：颗粒细胞层（granulecelllayer，GCL），僧帽细胞层（mitralcelllayer，MCL），嗅小球细胞层（Glomerularlayer，GL）。3.2.2硒酸钠对AD模型鼠嗅球作用的转录组研究3.2.1.1硒酸钠对嗅球转录组的作用结果取野生型、AD和给药三组小鼠嗅球组织内的mRNA送去广州锐博公司测序分析，每组3只小鼠，用STAR(v020201)进行参考基因组(mm9)比对，用HTSeq(v0.6.0)得到各基因的read数，用DESeq2(v1.10.1)进行差异表达分析。结果发现，硒酸钠显著提高嗅球组织内与炎症和嗅球相关基因的变化（表3-1）。39 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制表3-1AD模型鼠加药组_VS_AD模型鼠对照组差异表达基因SymbolEntrezGeneIDbaseMeanlog2FoldChangeAD_vs_WTUp-regulatedGrin2a14811714.080.880DownGrin2b148121432.331.070DownChrm2243764540.271.045DownCreb1129121499.050.4332NosignificantdifferenceGng1364337271.391.098NosignificantdifferenceDown-regulatedGfap145809913.21-1.059Nosignificantdifference3.2.1.2Q-PCR方法验证嗅球中硒酸钠调控的主要基因的表达通过Q-PCR对转录组结果进一步验证，发现Grin2a、Grin2b及Gfap这3个基因与转录组结果一致，加药组Chrm2基因表达降低，与转录组结果相反（图3.24）。图3.24嗅球转录组结果Q-PCR验证（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n=5次独立实验）3.2.1.3Westernblot法验证硒酸钠调控的嗅球神经突触相关蛋白的表达为了进一步探究硒酸钠对嗅球突触的影响，本研究选用与突触相关的若干蛋白进行Westernblotting验证，发现硒酸钠显著提高Grin2a和Grin2b蛋白水平。40 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制图3.25嗅球转录组结果Westernblotting验证（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n=4）3.2.1.4免疫荧光染色法验证硒酸钠调控的嗅球神经元突触蛋白的表达培养原代嗅球神经元，检测突触素蛋白的表达水平，发现相比野生型，AD组嗅球神经元突触素蛋白表达显著降低，硒酸钠处理组突触素蛋白的表达及神经元状态明显改善（图3.26）。图3.26硒酸钠提高嗅球神经元突触素的表达免疫荧光染色观察各组嗅球神经元细胞骨架（MAP2，红色）及突触素（Syna，绿色）表达及分布情况，使用DAPI（蓝色）进行核复染，标尺=100μm。41 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制第4章讨论硒酸钠作为一种抗氧化和低毒的硒化合物，据报道可以减少AD模型鼠脑内过度磷[35，36，44，49]酸化的tau及NFT。然而关于硒酸钠如何激活AD患者海马区Wnt/β-catenin通路以及是否能够通过激活Wnt/β-catenin通路治疗AD并没有文献报道。为了探究这些问题，本研究使用三转模型AD模型鼠，原代培养的神经元以及稳转APP695swedish突变基因的AD模型细胞系N2aSW细胞等进行研究。本课题组研究发现硒酸钠可以促进葡糖糖的吸收及突触的生长，显著提高三转基因AD模型鼠的活力。有文献报道[50]，突触的丢失可以使小鼠认知能力损坏，空间学习能力下降等行为学方面发生改变。本研究[35，49]发现硒酸钠有可能通过促进突触的生长提高AD模型鼠的行为能力。本研究证明硒酸钠可以抑制三转基因AD模型鼠脑内tau蛋白的病理变化，前有研究报道硒酸钠对两种脑内出现tau病理AD模型鼠的治疗(在P301L突变的pR5小鼠与在K369I突变的K3小鼠)[45]。本研究所用三转基因AD模型鼠不仅tau蛋白在P301L位点突变，而且在APPSwe和PSEN1均出现基因突变，它同时具有AD脑中tau和Aβ病理变化的症状。因此，本研究检测硒酸钠对Aβ级联通路相关蛋白进行检测，发现硒酸钠可以降低三转基因AD模型鼠海马区Aβ的产生：总的APP表达不变，A1-42，sAPP，CTF和BACE1的水平显著降低，而sAPP的水平升高。而之前的研究中亚硒酸钠并[34，51-53]不能降低A沉积及过氧化和ROS介导的神经毒性。硒酸钠减少A的产生以及A与Wnt/-catenin通路之间的关系并没有文献报道。中枢神经系统的发育及突触可塑性与海马正常功能运行密切相关，而Wnt/β-catenin通路在中枢神经系统的发育及突触可塑性方面具有重要作用[54]。越来越多的研究表明Wnt/β-catenin通路失调，如β-catenin表达水平下降，GSK3β过度激活及Wnt/β-catenin通路抑制因子过度表达等，均与AD病理产生相关[55-61]。在AD病例中发现A沉积造[59，62-64]成Wnt/β-catenin通路的失活，且伴随着与神经元发育受阻及突触功能失调。DKK-1和DDK-3，Dickkopf(DKK)蛋白家族的两个成员，均是Wnt/β-catenin通路的抑制剂。在AD病人的血浆及脑脊液中均发现Dkk3含量增加，而在AD脑死亡的病例及[61，65，66]AD模型鼠脑内均出现Dkk1的含量增加。本研究结果表明在三转基因AD模型鼠海马组织中活化的β-catenin水平显著降低，非活化的β-catenin水平显著升高。硒酸钠给药组则可以逆转AD模型鼠脑内的该变化，促进胞内的β-catenin进入细胞核，使靶基因survivin，c-myc，GPX4，TXNRD1和TXNRD2转录激活。与此同时，硒酸钠显著42 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制抑制AD模型鼠海马区细胞凋亡。这些发现证明硒酸钠可以通过激活Wnt/β-catenin通路抑制AD相关的病理变化。GSK3β是一种重要的一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，不仅在AD病理中使tau蛋白过度磷酸后导致NFT的形成，而且作为Wnt/β-catenin通路的负调节因子导致β-catenin[59，67，68]被蛋白酶体降解。大量证据表明Aβ病理出现在过度磷酸化tau病理之前，然而Aβ诱导tau蛋白病理仍不清楚。最近体内体外相关研究均表明Wnt/β-catenin通路有可能成为这两种AD病理之间的连接。因为GSK3β在AD病理产物的形成中发挥重要作[55，57，61，69，70]用，而且GSK3β促进β-catenin在S33/S37/T41位点磷酸化，导致其被泛素化并被蛋白酶体降解，所以是Wnt/β-catenin通路的负调节因子，在三转基因AD模型鼠内我们发现GSK3β被过度激活，导致Wnt/β-catenin通路失活。硒酸钠显著抑制GSK3β的活性，使活性的β-catenin水平升高，激活Wnt/β-catenin通路并降低tau蛋白的过度磷酸化。硒酸钠作为PP2Ac公认的激活剂，在很多tau病理的模型鼠中发现可显著降低tau[35，49，71，72]蛋白的磷酸化减少NFT的形成。本研究结果同样支持这一结论。而且，本研究发现PP2A的活性与Wnt/β-catenin通路和AD病理变化密切相关。使用原代培养初生AD模型鼠海马区神经元，发现硒酸钠处理后Wnt/β-catenin通路恢复，而同时加入PP2A的抑制剂LB-100，Wnt/β-catenin通路出现下调而凋亡现象明显。因此我们推测硒酸钠可通过激活PP2A的活性降低β-catenin在S33/S37/T41位点的磷酸化及GSK3β在Y216位点的磷酸化上调AD模型鼠脑内Wnt/β-catenin通路。同时PP2A抑制GSK3β的活性阻止tau蛋白在S396/S404/T231位点的磷酸化，防止NFT的形成。在AD中APs的沉积也受PP2A的调节。PP2A可通过调节APP的磷酸化及BACE1的活性从而影响Aβ的水平。APP被分泌酶剪切产生Aβ的过程受Thr668位点的磷酸化影响，该位点的磷酸化有利于BACE1剪切APP[73]。GSK3β作为一种激酶对APP在该位点的磷酸化也有影响[74]。PP2A可抑制APP的磷酸化水平[75]。在AD患者大脑中APP的磷酸化可产生大量的气泡结构造成海马区椎体神经元受损。Thr668位点磷酸化的APP在AD海马溶解物中出现很多COOH-片段，而正常大脑中却没有此现象。在大鼠原代培养的皮层神经元中APP-pT668更有利于与BACE1结合。此外磷酸化的APP相比-secretase更容易被BACE1剪切产生COOH-片段，Aβ的产生增加，当APP的T668位点被突变或者被激酶抑制剂抑制时，Aβ的产生显著减少。此外Keun-AChang等人研究发现，APP胞内结构域在苏氨酸668位点的磷酸化是结合蛋白因子Fe65的必要步骤，43 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制[73，该结合复合物有可能通过影响细胞核内GSK3β等的转录调控，从而产生细胞毒性，76]。本研究的结果证明在AD模型鼠原代培养的神经元或者海马组织中APP-pT668，sAPPβ和Aβ1-42显著高于野生型组，硒酸钠处理组的AD鼠APP-pT668的表达显著降低，在原代培养的神经元中同时加入硒酸钠和PP2A的抑制剂LB-100后，发现硒酸钠的效果全部被逆转。这些发现表明，硒酸钠可激活PP2A降低APP-pT668的磷酸化，从而降低APP被BACE1的剪切，减少A的产生。提高N2a细胞内β-catenin的表达或降低GSK3的表达均可以激活Wnt/β-catenin通路，从而减少A的表达水平及降低BACE1表达和活性[77]。核内β-catenin特异与转录因子TCF/LEF结合能够与BACE1启动子结合。TCF/LEF转录因子是经典的Wnt/β-catenin通路中调节靶基因的非常保守的序列。Wnt/β-catenin通路激活后降低BACE1的转录。本研究中，硒酸钠给药组AD模型鼠的海马组织Wnt/β-catenin通路激活，BACE1的表达水平显著降低，减少Aβ的产生。敲低N2aSW细胞内β-catenin发现，BACE1的表达显著降低，A1-42的表达减少。这些发现表明Wnt/β-catenin通路在调节BACE1的表达减少APs的形成中发挥重要作用。大量证据表明激活经典的Wnt/-catenin通路能够增强蛋白质的稳定性及促进-catenin与转录因子结合。然而，-catenin形成异源二聚体与转录因子TCF/LEF促进[78，79][80，81][82]靶基因转录，如c-myc，survivin，TXNRD2和BACE1。在这四个靶基因中，BACE1是Wnt/-catenin通路唯一负调节基因。c-myc和survivin是Wnt/-catenin通路中众所周知的靶基因，与细胞的增殖和凋亡密切相关。GPXs和TXNRDs是两大类硒酶家族，和许多生物功能相关，包括降低细胞内的氧化应激，促进细胞增殖和生长，抑制细胞凋亡。在癌细胞系中TXNRD2是Wnt/β-catenin通路直接的靶基因[82]。TXNRD1也与Wnt/-catenin通路相关，在低分化的RKO细胞系中抑制Wnt/β-catenin通路，TXNRD1的转录，表达及酶活显著降低，细胞的生长明显被抑制[83]。本研究发现在AD模型鼠海马区及原代培养的神经元中均出现c-myc/survivin和TXNRD2基因表达的蛋白下调，而硒酸钠处理后这些基因出现显著上调。敲低原代培养的海马区神经元内的-catenin发现TXNRDs和GPXs的转录均下调。而且硒酸钠处理组TXNRDs和GPXs的活性显著提高。以上发现均表明硒酸钠能够通过激活Wnt/β-catenin通路调节下游靶基因的转录，最终影响这些基因的表达产物。除此之外，嗅觉作为AD早期发病的检测指标，据报道在AD患者大脑皮层出现相44 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制[22，84]关病变之前首先在内嗅皮层检测到其病理变化。有研究认为嗅觉功能障碍是记忆和认知能力缺失的基础，而内嗅皮层作为嗅觉输入到海马的通道，无缝衔接感官与海马之间的活动。AD早期病理变化包括，嗅觉障碍、内嗅皮层及海马均出现萎缩，且内嗅皮层萎缩比率高于海马组织，这些变化都有可能影响突触传递[85]。在AD模型鼠的嗅球内同样出现过度磷酸化的tau及A的过表达[86]，而二者对神经元突触功能损害严重。硒酸钠作为硒的一种无机化合物，可显著降低炎症水平，在本研究中AD模型鼠嗅球内的GFAP基因上调，给予硒酸钠饮水的AD模型鼠上述基因表达发生逆转，进一步证明硒酸钠具有抗炎作用。GFAP基因在星形胶质细胞中表达胶质纤维酸性蛋白，当大脑出现炎症时，胶质纤维酸性蛋白表达升高[87]。本研究结果中硒酸钠上调Gng13和Chrm2基因。Gng13基因表达G蛋白亚基γ13，参与嗅觉等信号传导[88]，Chrm2基因表达一种胆碱受体M2，即毒蕈碱型胆碱受体，主要分布在心脏和大脑。研究表明毒蕈碱型胆碱受体可以调控嗅觉[89]，表明硒酸钠可能保护AD中受到损害的嗅觉。Creb1基因表达cAMP反应元件结合蛋白，是一种重要的转录调控因子，主要负责维持神经元的[90，91]生成，提高突触的可塑性。Gin2b和Grin2a基因均表达一种离子型谷氨酸受体-NMDA受体，与记忆和学习等长期增强效应有关，可增强海马的可塑性[92]，NMDA受体与神经元突触的可塑性密切相关[93]，发育早期主要由Grin2b参与，去除Grin2b的C端小鼠会致死[94]。本研究所用的三转AD模型小鼠嗅球内Gin2b和Grin2a基因均下调，硒酸钠处理的AD组二者表达上调，原代培养的嗅球组织神经元发现硒酸钠增加嗅球神经元突触素的表达，表明硒酸钠可提高嗅球内神经元突触的可塑性。综上所述，在三转基因AD模型鼠的海马区，A增多，tau蛋白的过度磷酸化及神经元的凋亡均与Wnt/β-catenin通路下调相关，硒酸钠处理后可以显著提高PP2A的活性抑制AD的病理症状。在AD模型鼠中硒酸钠可以提高β-catenin的表达水平，抑制SK3β的活性，从而激活Wnt/β-catenin通路，上调c-myc，survivin和TXNRD2，下调BACE1基因。同时，硒酸钠降低APP在Thr668位点的磷酸化，减少APP的剪切降低Aβ的产生。此外，本研究结果证明硒酸钠对三转AD模型鼠嗅球的病理具有干预作用，可显著减少嗅球内A的产生，减少嗅球内tau蛋白的过度磷酸化，进而减少嗅球内神经纤维缠结。对其转录组结果进行分析发现，硒酸钠可显著逆转AD模型鼠中相关下调的基因，包括与嗅觉相关的基因Gng13和Chrm2和与突触发育相关的基因Grin2a，Grin2b和Creb1，并逆转AD模型鼠中出现上调的与炎症相关基因Gfap。mRNA水平及蛋白质表达水平验证结果发现和突触发育相关的基因与转录组结果保持一致，表明硒酸钠可影响45 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制嗅球内突触的发育。由此我们得出，Wnt/β-catenin信号通路是阻止AD发生的一条潜在机制，硒酸钠可以通过PP2A激活Wnt/β-catenin通路阻止Aβ产生及细胞凋亡。同时硒酸钠改善嗅球的AD相关病理变化，提高嗅球内突触可塑性，有可能成为治疗AD的一种潜在药物。46 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制第5章结论本研究揭示了硒酸钠抑制AD模型小鼠海马区Aβ产生及嗅球病变的分子机制，得到以下结论：1．硒酸钠降低三转基因AD模型鼠海马区APP在第668位苏氨酸残基的磷酸化水平，并降低BACE1的表达水平，从而减少BACE1对APP的剪切、减少Aβ产生。2．硒酸钠提高AD模型小鼠海马区PP2A的活性，抑制GSK3β活性。3．硒酸钠减少AD模型小鼠海马区β-catenin的磷酸化，从而激活AD病变中失活的Wnt/β-catenin信号通路，上调其靶基因c-myc、survivin和TXNRD2表达水平，下调靶基因BACE1表达水平，减少AD鼠脑中细胞凋亡及Aβ产生。4．硒酸钠降低AD模型鼠脑中嗅球内的Aβ产生及tau蛋白的过度磷酸化，减少神经元缠结，干预嗅球中出现的早期AD病变。5．嗅球转录组分析及WB验证结果表明：AD模型鼠嗅球中突触相关基因Grin2a、Grin2b表达水平降低，硒酸钠可以显著逆转上述基因及蛋白在AD病理过程中的改变。6．硒酸钠能增加嗅球神经元中突触素的表达，提高突触的可塑性。综述所述，硒酸钠通过提高PP2A的活性激活AD模型鼠脑内失活的Wnt/β-catenin信号通路，减少Aβ产生，促进神经元存活，且干预AD模型鼠嗅球早期病变，提高嗅球神经元突触可塑性。47 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制参考文献[1]E.D.Roberson，L.Mucke.100yearsandcounting:prospectsfordefeatingAlzheimer'sdisease[J].Science,2006,314(5800):781-4.[2]D.J.Selkoe.Cellbiologyofproteinmisfolding:theexamplesofAlzheimer'sandParkinson'sdiseases[J].NatCellBiol,2004,6(11):1054-61.[3]M.O.Grimm，B.Hundsdorfer，S.Grosgen，等.PSdependentAPPcleavageregulatesglucosylceramidesynthaseandisaffectedinAlzheimer'sdisease[J].CellPhysiolBiochem,2014,34(1):92-110.[4]C.L.Masters，G.Simms，N.A.Weinman，等.AmyloidplaquecoreproteininAlzheimerdiseaseandDownsyndrome[J].ProcNatlAcadSciUSA,1985,82(12):4245-9.[5]R.Vassar，B.D.Bennett，S.Babu-Khan，等.Beta-secretasecleavageofAlzheimer'samyloidprecursorproteinbythetransmembraneasparticproteaseBACE[J].Science,1999,286(5440):735-41.[6]Y.Deng，Z.Wang，R.Wang，等.Amyloid-betaprotein(Abeta)Glu11isthemajorbeta-secretasesiteofbeta-siteamyloid-betaprecursorprotein-cleavingenzyme1(BACE1),andshiftingthecleavagesitetoAbetaAsp1contributestoAlzheimerpathogenesis[J].EurJNeurosci,2013,37(12):1962-9.[7]M.S.Lee，S.C.Kao，C.A.Lemere，等.APPprocessingisregulatedbycytoplasmicphosphorylation[J].JCellBiol,2003,163(1):83-95.[8]第22个世界阿尔茨海默病日——关爱健康安度晚年[J].实用心脑肺血管病杂志,2016,(09):4.[9]N.C.Inestrosa，L.Varela-Nallar.WntsignalinginthenervoussystemandinAlzheimer'sdisease[J].JMolCellBiol,2014,6(1):64-74.[10]G.Davidson，W.Wu，J.L.Shen，等.Caseinkinase1gammacouplesWntreceptoractivationtocytoplasmicsignaltransduction[J].Nature,2005,438(7069):867-872.[11]X.Zeng，H.Huang，K.Tamai，等.InitiationofWntsignaling:controlofWntcoreceptorLrp6phosphorylation/activationviafrizzled,dishevelledandaxinfunctions[J].Development,2008,135(2):367-375.[12]X.Zeng，K.Tamai，B.Doble，等.Adual-kinasemechanismforWntco-receptorphosphorylationandactivation[J].Nature,2005,438(7069):873-877.[13]M.vandeWetering，R.Cavallo，D.Dooijes，等.ArmadillocoactivatestranscriptiondrivenbytheproductoftheDrosophilasegmentpolaritygenedTCF[J].Cell,1997,88(6):789-799.[14]J.Behrens，J.P.vonKries，M.Kuhl，等.Functionalinteractionofbeta-cateninwiththetranscriptionfactorLEF-1[J].Nature,1996,382(6592):638-642.[15]C.Parr，N.Mirzaei，M.Christian，等.ActivationoftheWnt/beta-cateninpathwayrepressesthetranscriptionofthebeta-amyloidprecursorproteincleavingenzyme(BACE1)viabindingofT-cellfactor-4toBACE1promoter[J].FASEBJ,2015,29(2):623-35.[16]M.Voronkov，S.P.Braithwaite，J.B.Stock.Phosphoproteinphosphatase2A:anoveldruggabletargetforAlzheimer'sdisease[J].FutureMedChem,2011,3(7):821-33.[17]G.Kjelvik，I.Saltvedt，L.R.White，等.ThebrainstructuralandcognitivebasisofodoridentificationdeficitsinmildcognitiveimpairmentandAlzheimer'sdisease[J].BMCNeurol,2014,14:168.[18]F.deCastro.WiringOlfaction:TheCellularandMolecularMechanismsthatGuidetheDevelopmentofSynapticConnectionsfromtheNosetotheCortex[J].FrontNeurosci,2009,3:52.[19]C.Rochefort，G.Gheusi，J.D.Vincent，等.Enrichedodorexposureincreasesthenumberofnewbornneuronsintheadultolfactorybulbandimprovesodormemory[J].JNeurosci,2002,22(7):2679-89.[20]D.P.Devanand，K.S.Michaels-Marston，X.Liu，等.Olfactorydeficitsinpatientswithmildcognitive48 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硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制致谢光阴如梭，转眼间三年的研究生学习生活将要结束，时值研究生复试期间，三年前的此时，正遇南方磅礴的雨季，而我初踏原始森林一样的校园，如同没头的苍蝇般，没了方向感，在雨中狼狈不堪…是热情的深大人，可爱的学生们，热心的老师们，帮助我一路走来。回首过去，这三年需要感谢的人实在太多，我的导师、课题组各位老师、师兄师姐和师弟师妹们等等，你们都将是我一生的财富，是你们带着一无所知的我，一步步走上科研的道路，帮助我带领我走向更广阔的领域。写到这里，脑海中浮现第一次进入实验室的场景，满实验室的东西都让我好奇，但我没有实验经历，跑不好电泳，用不好离心机，甚至连移液枪都不会使，尴尬至极，郑友标师兄一遍遍讲解提醒注意事项，谭毅彬同学一遍遍讲解示范，当我怀着忐忑不安的心开始实验操作，结果出现错误时，他们没有责怪反而不停的开导安慰。记得当时趁着十一假期大家有时间，谭毅彬同学带着我们去实验室学习，郑友标师兄分出一点他的实验样品供我们练习westernblotting，我连续做两天却没有得到任何结果，第一次体验实验的失败，觉得非常愧疚。就在对自己失去信心时，实验室的师兄师姐们又一次鼓舞，让我找回自信，并慢慢的感受的实验室大家庭的温暖，感受到实验带来的越来越多的乐趣。首先我要感谢我的导师倪嘉赞院士，倪老先生80多岁高龄，对工作依然兢兢业业，治学严谨，精益求精，待人却朴实无华，平易近人，和蔼和亲。他教会了我实验无轻重之分，每天打扫实验室卫生，离开实验室倒垃圾关门这些实验细节同样是成功实验的保证。虽然年事已高，但倪先生时刻关心学术，时刻关心我们的实验是否进展顺利，关心我们的生活以及今后的发展。为了丰富我们的业余生活，他亲自掏腰包带领全课题组师生去惠州巽寮湾游玩。三年研究生学习生活，导师倾注了太多的心血，在此我向我的导师致以最深切的感谢与祝福！其次我要感谢我的指导老师刘琼教授，刘老师学识渊博，治学严谨，和蔼可亲。她对待工作一丝不苟，对待学生更是呕心沥血。老师尽心尽力培养我，亲自指导我如何设计实验，帮我一起分析实验结果，实验失败时和我一起查找原因。无论我遇到什么问题，老师都会在第一时间回复我。为了我的实验顺利进行，她帮我联系实验设备，找人帮忙指导。此外，老师对我撰写文章和毕业论文时给予我莫大的帮助，一遍遍提出建议帮我修改更正。尽管刘老师工作非常繁多，但是对我的指导依然细致入微，甚至是标点符号错误都帮我指出，那四五十页红色的标注都是老师周末加班加点熬夜工作倾注的心血。她教会了我系统的科研思维能力以及对待工作认真细致的态度。在此我向我的老师表示53 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制深深的感激与谢意！同时我也要感谢化学生物学课题组张焱教授，宋国丽教授，续旭教授，杨缜教授，王勇教授，田静教授，沈立明教授，肖时峰教授，都秀波老师，李楠老师等，感谢他们论文开题、中期汇报及工作汇报中提出的宝贵意见，在平时实验中的指导和帮助，衷心的表示感谢；感谢课题的张中豪师兄，郑友标师兄，朱华章师兄，马佺师兄，陈辉博士，任冰玉博士，姚芳博士等对我实验的帮助与指导；感谢中科院上海营养所的李高鹏博士，给予的关心和帮助；感谢梁宇彬、肖镇龙、谭毅彬、谢永丽、黄燕妹、何志军、程辉、廖利萍、郑林、郑瑞、毕德成、徐金玲等同学在实验中给予无私的帮助；感谢谭秋龙、吴冲、张考苑、赖秋娴、陈瑶、吴利，赵宇西等师弟师妹无私的帮助，衷心的感谢大家。感谢深圳大学生命科学与海洋学院给我提供这样一个良好的科研学习平台，让我在浓厚的学术氛围中成长，从一个门外汉踏进了庄严的学术殿堂，良好的科研平台给我提供了充足的科研资源，让我在这样优越的环境中学习和成长！最后我要特别感谢我的家人，是他们的支持与帮助，让我有机会接触科研，走进更广阔的殿堂。家人无私的付出，我将用我毕生来感激报答！还有很多很多我要感谢的人，他们在我遇到困难和挫折的时候给我安慰和鼓励，真心的感谢你们，正是有了你们的这份帮助，才让我的世界变得更加精彩，衷心的感谢大家也祝福大家。54 硒酸钠抑制阿尔茨海默症模型小鼠海马β-淀粉样蛋白产生及嗅球病变的分子机制攻读硕士学位期间的研究成果发表的论文：[1]金娜，钟文鸣，江穗婷，刘琼.硒酸钠对成年阿尔茨海默病模型小鼠神经再生的影响[J].科研,2017（6）：313.[2]NaJin,等，文章《Wnt/β-cateninsignalingandrepressedamyloid-βformationinatripletransgenicmousemodelofAlzheimer’sdisease》，已投稿二区期刊EXPERMENTALNEOROLOGY，目前在一审修改中。[3]GaopengLi,NaJin等，文章《TranscriptomanalysisoftheeffectofsodiumselenateonolfactorybuldinthetripletransgenicmousemodelofAlzheimer’sdisease》，手稿正在撰写中。参加国际会议：[1]NaJin等，发表会议摘要《SodiumselenatestimulatedtheWnt/β-cateninpathwayviaactivationofPP2AtorepressAlzhermer'spathologies》,2016InternationalAlzheimer'sDisaeseConference。55