我国牦牛和藏羊主要病毒病血清学调查及微孢子虫巢式PCR检测

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分类号：Q959.8单位代码：10193密级：公开学号：20140613硕士学位论文我国牦牛和藏羊主要病毒病血清学调查及微孢子虫巢式PCR检测Serologicalinvestigationofviralinfectiousdiseasesandnested-PCRdetectionofEnterocytozoonbieneusiinyaksandTibetansheepinChina作者姓名：马剑钢学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物病毒学指导教师：胡桂学教授所在学院：动物科学技术学院2017年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要牦牛和藏羊作为青藏高原的原始畜种，我国是养殖数量最多的国家，对其资源具有垄断优势。牦牛和藏羊的皮毛、肉制品及奶制品都是青藏高原农牧民重要的经济收入来源，是地区经济发展的支柱产业。牛病毒性腹泻、蓝舌病、牛白血病和边界病是牛羊中重要的病毒性疾病，同样可以感染牦牛和藏羊，造成严重的经济损失；毕氏微孢子虫是重要的人畜共患病病原，严重危害着家畜及人的健康。牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）属于黄病毒科、瘟病毒属，主要侵害牛、羊等反刍动物以及猪的一种重要传染病，根据引起不同的临床症状分为牛病毒性腹泻（BVD）和黏膜病（MD）。常引起呼吸综合征、免疫抑制及繁殖障碍等症状，给畜牧业带来了严重的危害。蓝舌病是由蓝舌病病毒（BluetongueVirus,BTV）引起的一种以昆虫为传播媒介的反刍动物的非接触性传染病，主要引起病畜发热、消瘦、鼻涕、流涎、口鼻和胃黏膜溃疡性炎症，造成较大的经济损失。地方流行性牛白血病是由牛白血病病毒（BovineLeukemiaVirus,BLV）引起的牛的一种以淋巴细胞持续性增生为特征的慢性肿瘤性疾病，病畜感染后表现分为白细胞增多型、持续型淋巴细胞增多型和肿瘤型，并伴有高死亡率，是牛的重要传染病之一。羊边界病是由边界病病毒（BordsriseaesVirus,BDV）引起的羊的一种先天性慢性传染病，主要引起病畜繁殖障碍、羔羊畸形、生长缓慢，给养羊业造成较大的经济损失。常见的微孢子虫病主要是由毕氏微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）引起的一类能感染几乎所有动物的专性胞内寄生的寄生虫病。微孢子虫能机会感染免疫低下者，加重其病症，甚至会引起致死性腹泻，是重要的人畜共患寄生虫病。本研究的第一部分采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对西北地区的牦牛、藏羊的病毒性腹泻病、蓝舌病，牦牛的牛白血病以及藏羊的边界病进行了血清学调查，并进行了风险因素分析。结果显示：牦牛血清中病毒性腹泻病毒抗体阳性率为37.56%（595/1584），藏羊的抗体阳性率为36.76%（804/2187）。经过风险因素分析显示品种和地区考虑为风险因素；牦牛血清中蓝舌病病毒抗体阳性率为13.32%（211/1584），藏羊的抗体阳性率为20.26%（443/2187），经过风险因素分析显示品种为风险因素；牦牛血清中牛白血病病毒抗体阳性率为21.09%（334/1584）。经过风险因素分析显示品种和地区为风险因素。品种差异是上述病毒性传染病的重要的风险因素。藏羊血清中边界病病毒抗体阳性率为18.29%（400/2187）。在风险因素分析中未确定风险因素。本研究的第二部分采用巢式PCR方法对西北地区牦牛、藏羊的粪便DNA进行了微孢子虫检测。结果显示：牦牛粪便中微孢子虫的阳性率为1.91%（9/471），藏羊粪便中未检到阳性0%（0/496）。经过比对共有4个型,分别为D型（n=2），I型（n=1），BEB4（n=5），I 及一个新型命名为WCY1（n=1）。本项研究对西北地区牦牛、藏羊的病毒性腹泻病、蓝舌病、牛白血病、边界病以及微孢子虫病的感染状况进行了调查，为疾病的防控提供了重要的基础资料，具有重要的公共卫生学意义。关键词：牦牛；藏羊；牛病毒性腹泻；蓝舌病；牛白血病；边界病；微孢子虫病；血清学调查II AbstractYaks(Bosgrunniens)andTibetansheep(Ovisaries)areimportantoriginalanimalsinChina,andtheymainlyliveinTibetanPlateau.YaksandTibetansheepareimportanteconomicsourceforthelocalsbecauseofthehighqualitymeatandthemilk.Bovineviraldiarrhoea(BVD),Bluetongue(BT),Enzooticbovineleukosis(EBL)andBorderdisease(BD)areimportantdiseasesofanimalsandcancausehugeeconomiclosstotheanimalindustry.Enterocytozoonbieneusi,theimportantzoonoticpathogen,hasbeenreportedinvariousanimalsandhumans.Bovineviraldiarrhoeavirus(BVDV)isanimportantpathogenofcattleandsheepworldwide,amemberofPestivirusgenus,withintheFlaviviridaefamily.Itcouldbedividedintobovineviraldiarrhoea(BVD)andmucosaldisease(MD)accordingtoclinicalsymptoms.BVDVhasassociatedwithpathologyinseveralbodysystemsincludingtherespiratory,immunodepressionandreproductivesystems.BT,aninfectiousbutnon-contagiousarthropod-borneviraldiseaseindomesticruminants,iscausedbyBluetonguevirus(BTV).BTVinfectioninanimalsusuallypresentassymptomsoffever,marasmus,nasaldischarge,droolingofsaliva,orallesion,oralandgastricmucosaulcers.Itcouldcausesignificanteconomiclosses.Enzooticbovineleukosis(EBL)isachroniclymphosarcomadiseaseofcattlecausedbybovineleukemiavirus(BLV).BLVinfectionsmaypresentasaleukemic(asymptomaticanimals),persistentlymphocytosis(withhematologicalabnormalities)andlymphosarcoma(tumors),andusuallyaccompanieshighermortality.Borderdisease(BD)iscongenitaldisordersinsheepcausedbyborderdiseasevirus(BDV).BDVinfectioninanimalsusuallypresentassymptomsofreproductivedisorder,lambabnormalityandgrowthretarded.Itcouldcausesignificanteconomiclosses.Enterocytozoonbieneusi,themostcommonzoonoticpathogenofmicrosporidiosis,hasbeenfoundinvariousanimalsandhumans.Enterocytozoonbieneusiistheimportantpathogenofopportunisticinfectioninanimalsandhumansoflowimmunitystatus,andmayleadtodeath.Inthefirstpartofthisstudy,theseroprevalenceofantibodiestoBVDV,BTV,BLVandBDVinfectioninyaksandTibetansheepinnorthwestChinawereexaminedbytheenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Itwasdemonstratedthat595(37.56%)outof1584serumsamplesinyakswereBVDVseropositive,804(36.76%)outof2187serumIII samplesinTibetansheepwereBVDVseropositive.Accordingtoconditionalforwardstepwiselogisticregression,asignificantdifferencehasbeenfoundbetweenTibetansheepandyakgroups(P<0.05).211(13.32%)outof1584serumsamplesinyakswereBTVseropositive,443(20.26%)outof2187serumsamplesinTibetansheepwereBTVseropositive,andthespecieswereconsideredasriskfactorsanalyzedbylogisticregressionmodel.334(21.09%)outof1584serumsamplesinyakswereBLVseropositive,thespeciesandregionswereconsideredasriskfactors.400(18.29%)outof2187serumsamplesinTibetansheepwereBDVseropositive,andnoriskfactorshasbeenidentified.Second,westudiedE.bieneusiprevalenceinyaksandTibetansheepinnorthwestChinabynestedPCR.Ofthe471yakfaecalsamples,9(1.91%)wereE.bieneusi-positive,and0(0%)outof496TibetansheepfaecalsampleswereE.bieneusi-positive.Atotalof4genotypes,including3knowngenotypes(genotypesI,DandBEB4)andonenovelgenotype(namedWCY1),wereidentifiedinthepresentstudy.Inconclusion,thisstudyinvestigatedtheseroepidemiologyofBVDV，BTV，BLVandBDVandmolecularepidemiologyofE.bieneusiinyaksandTibetansheepinnorthwestChina.Thesedataprovidebase-lineinformationforthepreventionandcontroloftheseinfectiousdiseases,andthesehaveimportantpublichealthsignificance.Keywords:Yak,Tibetansheep,BVDV,BTV,BLV,BDV,E.bieneusi,SeroprevalenceIV 目录摘要........................................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................................III绪论.......................................................................................................................................1第一篇文献综述..........................................................................................................................2第一章牦牛和藏羊的四种病毒性传染病及诊断...........................................................................21.1牦牛和藏羊四种病毒病的病原学....................................................................................21.2四种病毒病的国内外流行情况.........................................................................................31.3四种病毒病的诊断..........................................................................................................41.4防控.................................................................................................................................4第二章牦牛和藏羊的微孢子虫病及诊断......................................................................................52.1微孢子虫病病原学..........................................................................................................52.2微孢子虫流行病学...........................................................................................................52.3微孢子虫病的诊断...........................................................................................................52.4防控.................................................................................................................................5第二篇研究内容..........................................................................................................................7第一章牦牛和藏羊主要病毒性传染病血清学调查........................................................................71.1材料................................................................................................................................71.2方法................................................................................................................................8 1.3结果................................................................................................................................91.4讨论..............................................................................................................................141.5小结..............................................................................................................................17第二章牦牛和藏羊微孢子虫病的巢式PCR检测.......................................................................192.1材料..............................................................................................................................192.2方法..............................................................................................................................192.3结果..............................................................................................................................222.4讨论..............................................................................................................................242.5小结..............................................................................................................................24结论.....................................................................................................................................25参考文献.....................................................................................................................................26作者简介.....................................................................................................................................31致谢.......................................................................................................................................33 绪论牦牛(Bosgrunniens)，是青藏高原特有的牛种，由于其耐寒、耐低压，善于行走陡坡、雪山，又能游渡江河，故又被誉为“高原之舟”。藏羊(Ovisaries)即西藏羊，又称藏系羊，是青藏高原特有的一个绵羊品种。牦牛和藏羊作为青藏高原的原始畜种，我国是其养殖数量最多的国家，对其资源具有垄断优势。牦牛和藏羊的皮毛、肉制品及奶制品都是青藏高原农牧民重要的经济收入来源，是地区经济发展的支柱产业。做好疫病的防治工作对牦牛和藏羊养殖业的发展具有重要意义。牛病毒性腹泻、蓝舌病、牛白血病、边界病是牛羊中重要的病毒性疾病，广泛分布于我国各地区的牛羊中。牛病毒性腹泻、蓝舌病、边界病都会引起病畜的呼吸综合征和繁殖障碍，严重危害动物健康，尤其是母畜和幼畜，给养殖业造成直接和间接的经济损失。而牛白血病属于慢性疾病，会持续感染畜群，虽然常不表现出明显的临床症状，但会造成病畜消瘦，生长缓慢，间接的造成经济损失。所以有必要对这些疾病展开调查，了解各地区的感染情况以制定配套的防治方案。毕氏微孢子虫是最为常见的微孢子虫病的病原，在各种动物的粪便以及水源中均有发现，也常有关于人感染的报道，尤其在免疫抑制的人群中会造成严重的后果。故对其进行调查具有重要公共卫生学意义。本研究通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对西北地区的牦牛、藏羊的病毒性腹泻病、蓝舌病，牦牛的牛白血病以及藏羊的边界病进行了血清学调查，并进行了风险因素分析。此外，采用巢式PCR法对牦牛和藏羊的粪便中毕氏微孢子虫的感染情况进行调查。本研究结果将为西北地区牦牛和藏羊病毒性腹泻、蓝舌病、牛白血病、边界病及微孢子虫病的感染情况提供基础数据，对于这些疾病的防治具有重要参考价值。1 第一篇文献综述第一章牦牛和藏羊的四种病毒性传染病及诊断1.1牦牛和藏羊四种病毒病的病原学牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）属于黄病毒科（Flaviviridae）[1,2]瘟病毒属（Pestivirus），于1946年在纽约被首次报道。感染后可引起动物的牛病毒性[3,4]腹泻病（Bovineviraldiarrhea，BVD）或黏膜病（Mucosaldisease，MD）。该病呈世界性分布，世界上大多数养牛国家均存在此病。BVDV可感染多种动物，包括黄牛、奶[5-8]牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊以及猪等。感染该病后会引起大量直接和间接的经济损失，主要引起动物腹泻、急性或慢性黏膜病、呼吸综合征、母畜流产、死胎或畸形胎、免[9-12]疫抑制等，直接影响了家畜生产繁殖性能，还间接增加防治成本。该病传播途径很多，[13-15]主要通过呼吸道、消化道传播，也可通过胎盘、交配等方式传播，其预防措施包括严格控制感染动物与健康动物的接触，定期检测畜群的感染情况，以及及时注射疫苗等。定期检测、隔离病畜只能相对降低患病率，而无法根除该病。给养殖业造成了巨大的损失，严重威胁着养殖业的发展，许多国家已将其作为重要疫病，世界动物卫生组织（OIE）将[6]其定为B类传染病，在我国进出口检疫中列为二类动物疫病。蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的通过媒[16,17]介昆虫（如库蠓等）传播的非接触性急性病毒性传染病。BTV是双股RNA病毒，无[18,19]囊膜，且有多个血清型，是呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的成员。蓝舌病病毒具有多个血清型，不能交叉免疫。主要通过吸血昆虫（如库蠓、伊蚊等）的叮[20]咬进行传播，也可通过垂直传播感染胎儿，但不会通过与病畜的直接接触进行传播。BTV可在昆虫体内长期存活并进行增值，故该病的流行与吸血昆虫的生活习性密切相关。[20,21]一般多发于热带、亚热带、温带的潮湿、低洼地区，夏季和秋季早期为高发期。由于全球的气候变化，改变了昆虫的活动范围，导致BTV爆发的区域也有所扩大。该病毒主[22,23]要感染羊，也可感染牛及其他反刍动物。当BTV感染绵羊时常引起病畜发热、消瘦、口腔黏膜和胃肠道黏膜溃疡、出血等，还可引起孕畜流产、死胎，严重时还可引起病畜死[24-28]亡。发病率可达30~40%，死亡率达20~30%。在感染牛及其他动物后常为隐性带毒状态，一般没有明显临床症状，但可成为该病的重要传染源。BTV对牛羊养殖业危害极[16,17]大，一旦爆发将造成极大的经济损失，OIE已将其列为A类动物传染病，我国也将[28]其列为一类动物传染病。地方流行性牛白血病（EnzooticBovineLeukosis，EBL）又称牛淋巴肉瘤、牛病毒性2 造血细胞组织增生症、牛恶性淋巴瘤等，是由牛白血病病毒（Bovineleukemiavirus，BLV）[29,30]引起的主要发生于成年牛的一种慢性肿瘤性疾病。BLV属于C型致瘤病毒属，反转[31,32]录科（Retroviridae）。其通过出芽增殖方式进行增殖，从细胞表面出芽并释放到新的细胞。该病毒可通过水平或垂直方式传播，并以水平传播为主，且途径众多，包括接触性传播（多为媒介传播）、分泌性传播（口鼻分泌物、尿液、粪便以及精液等）、血源性传播[33-35]（被病毒污染的器械、注射、采血等）等。当牛感染BLV后，根据临诊表现可分为亚临床学和临床型，亚临床型主要表现为淋巴细胞增生，但无瘤的形成，对牛的健康影响不大，但亚临床型也可发展为临床型；临床型主要表现为生长缓慢，消瘦，会引起淋巴细[37-41]胞恶性增生，进行性恶病质，且发病后死亡率高。目前该病已几乎遍及全世界所有养[36]牛国家，世界动物卫生组织（OIE）已将其列为B类动物传染病，我国也将其列为二类[38]传染病。羊边界病（Borderdisease，BD）是由边界病病毒（Borderdiseasevirus，BDV）引起的羊的一种先天性疾病。边界病病毒、牛病毒性腹泻病毒及猪瘟病毒都同属于黄病毒科[42-44]（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），BDV是具有囊膜的单股正链RNA病毒。BDV主要感染绵羊和山羊并引起一系列病症，也可感染牛及其他一些反刍动物。BDV可通过水平和垂直方式传播，主要引起病羊流产、死胎、畸形胎，产下的羔羊多毛、震颤、生长迟缓及畸形发育，还会引发持续性感染（Persistentlyinfected，PI）等，严重时可引起羔[45-47]羊死亡。该病已呈世界性分布，我国直到2013年才首次分离到该病毒，证明其在我国的存在，对我国养羊业的发展存在一定的威胁。1.2四种病毒病的国内外流行情况[7]牛病毒性腹泻于1946年Olafson等在美国纽约州首次被发现报道，1971年美国兽[8]医协会将其命名为“牛病毒性腹泻-黏膜病”。随后该病的血清学调查陆续在各国展开，世[8-11]界上多数国家均有报道，如加拿大的阳性率约为80%，美国约为50%，法国约为76%，英国58.6%，波兰6.4%等等。目前，许多欧洲国家已通过一系列防控措施消灭或控制了BVDV。该病在我国各地区普遍存在，四川、甘肃、宁夏、新疆、青海、内蒙古、山东、[12-15]河南等20多个省市均有报道，但是缺乏系统的研究报道，对该病流行趋势很难预测。[12]目前该病尚无特效治疗药物，但我们可以积极采取防治措施对其进行控制。蓝舌病广泛分布于南纬40°至50°之间的多数国家，最早于1876年在南非绵羊中发现，[17,18]于1905年确定命名为蓝舌病，随后在埃及、肯尼亚、西非、以色列、美国、西班牙[19-21]等各国也相继发现并报道。该病我国自1979年首次在云南绵羊中分离发现该病毒，随后湖北、安徽、四川、山西等地也陆续分离到该病毒，甚至在新疆、辽宁、吉林等地也从家畜中检测到蓝舌病血清学阳性，蓝舌病的流行范围在不断扩大，但仍以长江以南地区[24-28]较为多发。3 1878年德国首先发现了牛白血病，直到1969年在美国由Miller从病牛中分离到病毒[29]。随后，该病各国都被陆续发现并报道，美国发病率在0.01%左右，德国发病率在0.05%[30-35]左右，丹麦为0.06%，日本为0.12%，部分地区则高达12%等。由于欧洲国家对其防[38]控措施的实施，已取得较好效果，感染率多在1.5%以内。我国于1974年在上海首次发现报道了此病，随后在合肥、江苏、陕西、北京等其他省市也被报道，有的牛群血清学阳[39-41]性率可达30%~50%，以成年牛的易感性更高，是我国重要传染病之一。[42,43]1959年BDV首次发现于英格兰和威尔士的边界，随后其他养羊业发达的国家也报道了该病，如美国、英格兰、苏格兰、日本、澳大利亚等，血清学阳性率多在5%~50%[44,45]之间。我国于2013年首次从江苏腹泻羊中分离到该病毒，相关报道还非常有限，仅[45]对江苏地区羊做过相关报道，血清学阳性率约为50%。1.3四种病毒病的诊断目前对这四种病毒的诊断检测方法主要有病原的分离鉴定、动物接种实验、电镜检查、酶联免疫吸附试验、RT-PCR和荧光定量PCR等。病原分离鉴定方法需要在细胞中盲传，不仅费时费力，有些毒株还不会引起细胞病变；动物接种费用较高，实践中很难应用；电镜检查虽然快捷、直观，但检测时病毒液需要一定浓度，而且检测仪器昂贵；RT-PCR虽然可以得到病原的核酸序列，但是其敏感性低、特异性差，易漏检；荧光定量PCR特异性好、敏感性高、重复性好，但其检测成本相对较高，在大批量检测时较少应用。由于ELISA检测特异性较好，敏感性高，条件简单易操作，且成本较低等优点，成为这些病毒病在大规模流行病学调查中最常用的初步诊断方法。1.4防控这些病毒病正严重危害着全球畜牧养殖业的发展，且尚无特效治疗药物，一旦爆发流行就会造成大量直接和间接的经济损失。目前，免疫接种是最有效的防治措施，但由于多种血清型的存在以及其他一些原因，有时免疫接种也不能起到很好的保护作用。需要在平时做好防疫工作，包括严格控制畜群的流动，尤其要限制从疫病流行地区进口；定期检测感染情况，及时隔离、淘汰病牛；做好环境消毒以及传播媒介的清除等。只有足够重视，做好疾病的防治工作，畜牧养殖业才能得到健康长久的发展。4 第二章牦牛和藏羊的微孢子虫病及诊断2.1微孢子虫病病原学微孢子虫（Microsporidia）是细胞内专性寄生的一类真核生物，广泛分布于动物及人[48,49][50]类之中。目前发现的微孢子虫已超过1300多个种，190个属，其中有8个属14种虫可引起人畜共患，常见的有毕氏微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）、兔脑炎微孢子[51-53]虫（Enterocytozooncuniculi）及肠脑炎微孢子虫（Enterocytozoonintestinalis）等。其中毕氏微孢子虫是最常见的人畜共患病病原，世界各地都有报道。其生活史包括四个阶段：呈卵块发育的原形体阶段、呈孢子生殖的原形体阶段、孢子母细胞阶段以及孢子阶段，孢[52]子可随宿主的粪便排出体外。感染后主要引起正常人或动物的自限性腹泻，而且它和[54-57]免疫抑制密切相关，严重时会导致免疫低下者出现致死性腹泻。微孢子虫及其孢子常[57]在家畜、野生动物的排泄物甚至水源中被发现，严重威胁着动物及人类健康，美国国立卫生研究院（NH）将其列为B类生物防范病原体，并被美国环境保护协会（EPA）列[56]为能引起水源性爆发的微生物类污染物。广大学者也纷纷加入了对其深入研究的行列。2.2微孢子虫流行病学[50]从1959年人类首次发现微孢子虫以来，一直很少引起人类关注，直到学者们发现其在艾滋病人中更易感后，才逐渐关注并研究微孢子虫。目前，微孢子虫的宿主越来越广泛，在人、家畜（牛、羊、猪、狗等）及野生动物（鹿、狐狸、貉子等）中均有发现，并[49-55]已有大量相关报道。宿主主要通过食入被微孢子虫孢子污染的食物或者水而感染，进而引起腹泻。2.3微孢子虫病的诊断目前，微孢子虫的诊断主要包括显微镜检测和分子生物学检测,其中分子生物学检测技术较为常用且更加准确，包括聚合酶链式反应（PCR），巢式PCR及实时定量PCR。实时荧光定量PCR较常规PCR及巢式PCR检测结果更准确，但其应用成本较高，在大批量检测中应用较少。巢式PCR技术通过检测微孢子虫ITS基因，具有方法简单、成本较[48]低、准确率高等优点，是目前公认的，也是最常用的检测方法。2.4防控预防性药物驱虫是目前最主要的寄生虫防治措施，高密度驱虫可有效的控制带虫动物散毒，但是长期使用会引起耐药性以及药物残留等多种问题，因此需要做好其他辅助防治5 [52]手段（如环境驱虫、加强饲养管理、减少畜群流动以及加强牧民对寄生虫的防治意识）。定期对牧区进行病原检测也是至关重要的，不仅可以了解畜群的感染情况，还能根据具体情况制定相应的驱虫措施，尽可能减少驱虫药的使用，又确保达到最好的驱虫效果。6 第二篇研究内容第一章牦牛和藏羊主要病毒性传染病血清学调查牛病毒性腹泻病、蓝舌病、牛白血病、边界病是牛羊中重要的病毒性疾病，广泛分布于我国的各地区的牛羊中。牛病毒性腹泻、蓝舌病和边界病都会引起病畜的呼吸综合征和[3,16,42]繁殖障碍，不仅影响生产，还会导致死亡，给养殖业造成大量的经济损失。牛白血[31]病多虽然多数属于慢性疾病，会持续感染畜群，常不表现出明显的临床症状，但也会引起恶性肿瘤，引起病畜消瘦，生长缓慢，并常以死亡为转归，直接和间接的造成经济损失。这些病毒病尚无特效治疗药物，免疫接种是最有效、最常用的预防措施，但由于多种血清型的存在或者其他原因，有时不能起到很好的保护作用。目前，这些疾病在中国西北地区的研究数据较少，我们通过竞争ELISA方法对牦牛和藏羊血清进行抗体检测，为该地区畜群的感染情况提供基础数据，及时隔离、淘汰病牛，并做出相应的防治措施。1.1材料1.1.1牦牛和藏羊的血清（1）牦牛血清：试验所用的高原牦牛血清分别采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲县（464份）和碌曲县（146份），白牦牛血清均采自甘肃省武威市天祝藏族自治县（974份）。所有样品的详细信息（如：性别、年龄、地区）由农场主提供，并编号记录统计于表。（2）藏羊血清：试验所用的藏羊血清分别采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲县（588份）和碌曲县（182份），甘肃省武威市天祝藏族自治县（962份），以及西藏自治区林芝市（455份）。所有样品的详细信息（如：性别、年龄、地区）由农场主提供，并编号记录统计于表。1.1.2主要仪器高速台式离心机：H1650，购自湘仪离心机仪器有限公司小型离心机：1-14，购自SIGMA中国有限公司烘干箱：BGZ-140，购自中国HANCE冷冻离心机：5804R，购自德国Eppendorf卧式冰箱：BCD-256KT，购自青岛海尔股份有限公司八道移液器：购自德国Eppendorf微量取液器（2µL/10µL/200µL/1000µL）：购自德国Eppendorf7 立式蒸汽灭菌器LS-C35L型：购自北京博峰天成科技有限公司酶标仪：购自美国BIO-RAD公司酶标板洗涤机：购自美国BIO-RAD公司1.1.3试剂盒BVDV检测试剂盒(SVANOVABiotechAB,Uppsala,Sweden)BTV检测试剂盒(VeterinaryMedicalResearchandDevelopment(VMRD)Inc.,Pullman,Washington,USA)BLV检测试剂盒(Pourquier,Montpellier,France)BDV检测试剂盒（SVANOVABiotechAB,Uppsala,Sweden）1.2方法1.2.1血清的采集与处理通过倒牛法将牦牛或藏羊保定后，在颈静脉沟上1/3与中1/3交界处用酒精棉球擦拭消毒（羊需剪毛后消毒），用拇指按住采血部位下方颈静脉沟血管，待颈静脉怒张后，将5mL注射器与皮肤成45度角由下向上刺入，抽取适量血液后，拔下注射器，用消毒棉球按压止血，并将注射器血液分装至1.5mL离心管，静置。采集一定数量样品后，将其置于37℃温箱中静置2-4h，再转入4℃冰箱静置1-2h，取出后置于离心机3000rpm，离心5min，将血清吸出转至新的灭菌离心管中，置于-20℃保存备用。1.2.2样品检测使用商业化成品试剂盒对采集样品进行检测，具体步骤如下：（1）试验准备a.试剂预热：将待检血清和酶标包被板提前置于室温（23±2℃）预热；b.准备对照和样品：阳性和阴性对照在试剂盒内提供。无论检测多少样品都需要做重复。当使用整个酶标包被板时，最好将对照放在多个不同的区域，并且每一个酶标板都需要加对照。检测样品使用未稀释的血清；c.准备酶标包被板：将酶标板从箔袋(A)中取出，把多余的孔取下放回试剂盒内提供的多余的自封袋中密封好以备下次使用。在使用时应整条取用，否则在洗涤过程中可能导致不完整的酶标板掉落；d.准备酶标二抗：试剂盒内提供了过氧化酶标记的抗体(D)，且无需稀释；e.准备洗涤液：将试剂盒内的50ⅹ浓缩洗涤液（E）与去离子水或蒸馏水以1:49的比例配成1ⅹ洗涤液。每孔大约需要1mL；（2）试验步骤：8 a.对照和样品血清：用移液枪吸取25µL对照和样品血清加至抗原包被板（A）。在加样时应尽快加完。当需要使用两条以上加样孔时，建议先将样品和对照加到一个转移板内，再用多通道移液器将其转移到加样孔内。将样品加到转移板时需要加25µL以上，以保证转移至加样孔时足够25µL。将加完样的抗原包被板置于室温（23±2℃）孵育15min。b.过氧化酶标记的抗体：孵育15min后，加入25µL过氧化酶标记的抗体（D）。用封板膜封板后室温（23±2℃）孵育15min。c.洗涤：经过两次15min孵育，反复洗涤酶标包被板3次d.显色剂：每孔加50µL显色剂（F），轻轻震荡混匀，室温（23±2℃）避光孵育10min。e.加入终止液：每孔加入50µL终止液（G），轻轻震荡混匀。f.测定和记录：加完终止液后应尽快将酶标板放入分光光度计，用空白孔作为对照，以620、630或650nm的波长测量各孔的吸光度（OD值）。g.多余的试剂置于2-7℃保存，并尽快使用。（3）试验的有效性：阴性对照的平均OD值必须＞0.300且＜2.000，阳性对照的平均OD值必须＜50%阴性对照的平均OD值。（4）结果判定：若测试样品的OD值<50%阴性对照的平均OD值则判定为阳性，若测试样品的OD值≥50%阴性对照的平均OD值则判定为阴性。1.2.3数据分析应用“统计产品与服务解决方案”软件（SPSS19.0）对数据进行统计分析。1.3结果1.3.1牦牛和藏羊病毒性腹泻病的血清学检测结果1.3.1.1牦牛血清抗体本次试验中，采用商品化ELISA试剂盒，共检测1584份牦牛血清（974份白牦牛和610份黑牦牛），共有595份血清病毒性腹泻抗体呈阳性，阳性率为37.56%。白牦牛血清974份，检出病毒性腹泻抗体320份，阳性率为32.85%；黑牦牛血清610份，检出病毒性腹泻抗体275份，阳性率为45.08%（见表1-1）。黑牦牛病毒性腹泻阳性率明显高于白牦牛和藏羊，差异极显著（P＜0.001）（见表1-2），不同地区的牦牛阳性率差异极显著（P＜0.001）（见表1-1），而不同年龄和性别的牦牛的血清抗体阳性率差异不显著。1.3.1.2藏羊血清抗体本次试验采用商品化ELISA试剂盒，共检测2187份藏羊血清，其中804份血清病毒性腹泻抗体呈阳性，阳性率为36.76%（见表1-1）。在藏羊中，不同的年龄、性别以及9 地区的血清抗体阳性率差异不显著。表1-1牦牛和藏羊血清中BVDV的抗体阳性率(n=3771)Table.1-1SeroprevalenceofBVDVinfectioninyaksandTibetanSheep(n=3771)藏羊牦牛变量样品数阳性数阳性率%P-value样品数阳性数阳性率%P-value年龄（年）≤144715534.680.242228611841.260.07221-241314134.142929733.222-4111643338.8052121040.31>42117535.5548517035.05性别公63822334.950.260047118238.640.5644母154958137.51111341337.11地区天祝96235837.210.845797432032.85<0.0001碌曲1827139.011465537.67玛曲58821336.2246422047.41林芝45516235.60品种白牦牛----97432032.85<0.0001黑牦牛----61027545.08总数218780436.76-158459537.56-表1-2BVDV血清学阳性率在不同分组中品种显示为风险因素Table.1-2OddsratiosforspecieasriskfactorforBVDVseroprevalenceinyaksandTibetanSheep变量样品数阳性数阳性率%OR（95%CI）P-value品种黑牦牛61027545.08参照<0.0001白牦牛97432032.851.68（1.36-2.07）藏羊218780436.761.24（0.86-1.77）1.3.2牦牛和藏羊蓝舌病的血清学检测结果1.3.2.1牦牛血清抗体本试验应用ELISA试剂盒共检测1584份牦牛血清（974份白牦牛和610份黑牦牛），其中有211份血清蓝舌病抗体呈阳性，阳性率为13.32%。白牦牛血清974份，检出蓝舌病抗体123份，阳性率为12.63%；黑牦牛血清610份，检出蓝舌病抗体88份，阳性率为10 14.43%（见表1-3）。在牦牛中，经风险因素分析不同的年龄、性别以及地区的血清抗体阳性率差异不显著。1.3.2.2藏羊血清抗体本次试验中，应用ELISA试剂盒共检测2187份藏羊血清，其中443份血清蓝舌病抗体呈阳性，阳性率为20.26%（见表1-3）。藏羊的蓝舌病血清学阳性率明显高于牦牛，差异极显著（P＜0.001）（见表1-4）。在藏羊中，不同的年龄、性别以及地区的血清抗体阳性率差异不显著。表1-3牦牛和藏羊血清中BTV的抗体阳性率(n=3771)Table.1-3SeroprevalenceofBTVinfectioninyaksandTibetanSheep(n=3771).藏羊牦牛变量样品数阳性数阳性率%P-value样品数阳性数阳性率%P-value年龄（年）≤14478218.340.64182863813.290.11481-24139021.792923813.012-4111622920.525218315.93>42114219.914855210.72性别公63814021.940.20764717014.860.2402母154930319.56111314112.67地区天祝96219720.480.923097412312.630.2178碌曲1823720.331461610.96玛曲58812220.754647215.52林芝4558719.12品种白牦牛----97412312.630.3055黑牦牛----6108814.43总数218744320.26-158421113.32-表1-4BTV血清学阳性率不同分组中品种显示为风险因素Table.1-4OddsratiosforspecieasriskfactorforBTVseroprevalenceinyaksandTibetanSheep变量样品数阳性数阳性率%OR（95%CI）P-value品种黑牦牛6108814.43参照<0.0001白牦牛97412312.631.17（0.85-1.60）藏羊218744320.260.67（0.51-0.97）11 1.3.3牦牛牛白血病的血清学检测本试验应用ELISA试剂盒共检测1584份牦牛血清（974份白牦牛和610份黑牦牛），其中有334份血清牛白血病抗体呈阳性，阳性率为21.09%。白牦牛血清974份，检出牛白血病抗体186份，阳性率为19.10%；黑牦牛血清610份，检出牛白血病抗体148份，阳性率为24.26%（见表1-5）。黑牦牛牛白血病阳性率高于白牦牛，差异显著（P＜0.05）（见表1-6），且不同地区的牦牛阳性率差异显著（P＜0.05）（见表1-6）。不同年龄和性别的牦牛的血清抗体阳性率差异不显著。表1-5牦牛血清中BLV的抗体阳性率(n=1584)Table1-5SeroprevalenceofBLVinfectioninyaks(n=1584).变量样品数阳性数阳性率(%)P-value性别公47111223.780.0874母111322219.95年龄≤12865719.930.17641-359412320.713-53558925.07>53496518.63品种白牦牛97418619.100.0142黑牦牛61014824.26地区天祝97418619.100.0422碌曲1463322.60玛曲46411524.78总数158433421.09表1-6BLV的血清学阳性率不同分组中品种显示为风险因素Table1-6OddsratiosforspecieasriskfactorforBLVseroprevalenceinyak.变量样品数阳性数阳性率%OR（95%CI）P-value品种黑牦牛61014819.101.36（1.06-1.73）0.0142白牦牛97418624.26参照12 1.3.4藏羊边界病的血清学检测本次试验中，应用ELISA试剂盒共检测2187份藏羊血清，其中400份血清边界病抗体呈阳性，阳性率为18.29%（见表1-7）。经风险因素分析，不同的年龄、性别以及地区的血清抗体阳性率差异不显著。表1-7藏羊血清中BDV的抗体阳性率(n=2187)Table1-7SeroprevalenceofBDVinfectioninTibetanSheep(n=2187).变量样品数阳性数阳性率%P-value年龄（年）≤14477917.670.97301-24137518.162-4111620818.64>42113818.01性别公63810617.410.1933母154929418.63地区天祝96217918.610.9596碌曲1823217.58玛曲58810918.54林芝4558017.58总数218740018.29-1.3.5牦牛中BVDV、BTV和BLV混合感染情况牦牛血清中BVDV、BTV和BLV的阳性率分别为37.56%、13.32%和21.09%，并对混合感染的情况进行了统计（见表1-8）。表1-8牦牛血清中BVDV、BTV和BLV的混合感染阳性率Table1-8SeroprevalenceofBVDV，BTVandBLVofmixedinfectioninyaksBVDVBTVBLVBVDV+BTVBVDV+BLVBTV+BLVBVDV+BTV+BLV样品数1584158415841584158415841584阳性数5952113342111385050阳性率37.5613.3221.0913.328.713.173.171.3.6藏羊中BVDV、BTV和BDV混合感染情况13 藏羊血清中BVDV、BTV和BDV的阳性率分别为36.76%、20.26%和18.29%，并对混合感染的情况进行了统计（见表1-9）。表1-9藏羊血清中BVDV、BTV和BDV的混合感染阳性率Table1-9SeroprevalenceofBVDV，BTVandBDVofmixedinfectioninTibetanSheepBVDVBTVBDVBVDV+BTVBVDV+BDVBTV+BDVBVDV+BTV+BDV样品数2187218721872187218721872187阳性数8044434001639013931阳性率36.7620.2618.297.454.126.361.421.4讨论1.4.1关于牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的牛、羊和猪的急性、热性传染病，其中牛最易感，主要引起动物腹泻、急性或慢性黏膜病、呼吸综合征、母畜流产、[3-5]死胎或畸形胎、免疫抑制等。该病呈世界性分布，世界上大多数国家均存在此病，给养殖业造成了巨大的损失，并仍然威胁着养殖业的发展，许多国家已将其作为重要疫病，[6,7]世界动物卫生组织（OIE）将其定为B类传染病。1946年Olafson等在美国纽约州首次报道了该病，1971年美国兽医协会将其命名为“牛病毒性腹泻-黏膜病”，我国在1983年由刘佑民等于长春从病牛流产胎儿中分离培养[58]出该病毒。自BVDV发现报道以来，已有数篇关于牛感染BVDV的血清学调查报告。杨得胜等在对福建牛场的调查报告显示福建省散养牛血清中BVDV抗体阳性率在20%左[59]右，规模养殖场阳性率在80%以上；石冬梅等对河南奶牛的调查中显示奶牛血清中[60]BVDV抗体的平均阳性率为53.8%；张俊杰等对北京郊区规模化奶牛场的调查中显示[61]该地区奶牛血清中BVDV抗体的平均阳性率高达94.1%；何美琳等在对川西北牦牛的[62]调查中显示牦牛血清中BVDV抗体的平均阳性率为44.3%。本试验调查甘肃地区牦牛血清中的BVDV抗体总阳性率为37.56%，相对低于其他地区阳性率，且与川西北牦牛的阳性率较为接近。牛病毒性腹泻病毒（BVDV）不仅可以感染牛，同样可以感染羊、猪、鹿等多种偶蹄动物，而这些动物在BVDV的流行和传播过程中同样具有重要作用。目前国内对羊感染BVDV的调查研究还比较少，王新平等对内蒙地区绵羊的粪便用BVD-双抗夹心ELISA进行了[63]检测，其阳性率为14.6%；李树博等对辽宁地区羊血清中BVDV抗体进行检测，其阳[64]性率为45.5%；郭芙莉等对新疆北疆地区羊血清中BVDV抗体进行检测，其阳性率为[65]91.8%。本试验调查了甘肃和西藏部分地区藏羊中BVDV的血清学阳性率，平均阳性14 率为36.76%，其结果与本试验中牦牛血清的调查结果较为接近，可能是本次试验采集牦牛和藏羊样品的地区主要采用牛羊混养的养殖方式，牛羊极易交叉感染。故在做好牦牛防治措施的同时，应当注意羊群的防治。本试验还通过SPSS19.0统计分析软件进行风险因素分析发现黑牦牛血清中BVDV抗体阳性率明显高于白牦牛，差异极显著（P＜0.001）(OR=1.68,95%CI=1.36–2.07)。说明黑牦牛可能更易感染BVDV，这种差异可能源于品种不同对BVDV的敏感性也不同，也可能是黑牦牛与白牦牛地处不同的区域，在饲养管理、环境卫生等方面有所差异。不同地区的牦牛的血清抗体阳性率差异显著（P＜0.05），说明BVDV在不同地区的分布有所差异，应对阳性率较高的地区加大防治力度。而性别、年龄经统计分析显示差异均不显著。由于目前没有防治BVDV的特效药，国外以接种疫苗为主要防治手段，而我国目前对该病还没有进行系统的分子流行病学调查，故国内还没有特别理想的疫苗。为有效的控制BVDV的流行，需要建立完善的检测系统，对不同区域使用具有针对性的疫苗。1.4.2关于蓝舌病该病是由蓝舌病病毒（BTV）引起的通过媒介昆虫（如库蠓）传播的非接触性传染病，[19,20]主要感染羊的急性传染病，也可感染牛及其他反刍动物。蓝舌病在感染牛后常为隐性带毒状态，一般没有明显临床症状，而当BTV感染绵羊时常引起病畜发热、消瘦、口腔[21,黏膜和胃肠道黏膜溃疡、出血等，还可引起孕畜流产、死胎，严重时还可引起病畜死亡22]。BTV对牛羊养殖业危害极大，一旦爆发将造成极大的经济损失，OIE已将其列为A类[28]动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。1876年BTV在南非绵羊中首次被发现，并于1905年确定命名为蓝舌病。我国于1979年在云南绵羊中首次发现并报道了BTV的存在，随后湖北、安徽、四川、山西等地也陆续报道了该病。目前国内也有数篇关于牛感染BTV的血清学调查，汪溪念等对浙江省牛[66]羊的BTV感染情况进行血清学调查显示牛的总体血清学阳性率为17.32%；何雪峰等对贵州省毕节市牛羊的BTV感染情况进行血清学调查显示牛的总体血清学阳性率为[67]37.77%；韩晋玫等对西藏部分地区黄牛进行BTV的血清学调查，结果显示阳性率为[68]14.66%；白俊英等对兰州军区部分牧场进行牛蓝舌病的血清学调查，结果显示总阳性[69]率为8.48%，其中牦牛阳性率为13.85%。本试验调查了甘肃地区牦牛蓝舌病的感染情况，其总体阳性率为13.32%（白牦牛为12.63%，黑牦牛为14.43%），该结果与数年前白俊英等对兰州军区部分牧场的调查结果相近，说明该病在甘肃地区并未得到有效的防治。虽然BTV感染牦牛后常呈隐性感染状态，但其将成为传染源持续威胁着其他家畜，做好牦牛蓝舌病的防控也具有重要意义。藏羊属于我国三大原始绵羊之一，当其感染BTV后容易引起一系列病理症状，且死亡率较高，故做好蓝舌病的防控对养羊业具有重要意义。自BTV发现以来，各地区都在不断15 展开调查，为数据库填补空白。段正赢等在湖北省山羊BTV的血清学调查结果显示该地[70]区BTV抗体平均阳性率为25.69%；陈建闪等在对山西省牛羊BTV感染情况进行血清[71]学调查中显示羊的总体阳性率为19.28%；张明国等在对四川攀西地区牛羊BTV感染情[72]况进行血清学调查中显示羊的总阳性率为7.41%；冯杰等对贵州高海拔地区的羊进行[73]BTV抗体检测，其结果为62.28%；而曲久等对西藏那曲地区的羊群调查结果仅为[74]0.88%，说明蓝舌病在我国的感染情况随地区差异变化较大。本试验调查了甘肃和西藏部分地区的藏羊血清中BTV抗体的阳性率，其结果为20.26%，这些地区的BTV感染率还是比较高，应当积极做好疾病的防控，控制库蠓等吸血昆虫的数量也许会有助于控制该病的传播。本试验通过SPSS19.0软件统计分析发现藏羊相对于牦牛更易感染BTV，差异极显著（P＜0.001）(OR=1.65,95%CI=1.38–1.98)。这也进一步证明绵羊比牛更易感染BTV。其余因素（如地区、性别、年龄）经统计分析显示差异均不显著。蓝舌病尚无特效治疗药，一旦确诊需及时采取措施，捕杀感染动物，迅速扑灭疫情，防止扩散。在平时一定要做好疾病的防控，做好吸血昆虫的杀灭工作以及牛羊的免疫预防工作，加强环境卫生也有助于对疾病的防控。1.4.3关于牛白血病[29]该病由牛白血病病毒（BLV）引起的主要发生于成年牛的一种慢性肿瘤性疾病。可通过水平或垂直传播，其中以水平传播为主，且途径众多，包括接触性传播、分泌性传播、[30]血源性传播等。当牛感染BLV后，会引起淋巴细胞恶性增生，进行性恶病质，且发病后死亡率高。目前该病已几乎遍及全世界所有养牛国家，世界动物卫生组织（OIE）已将[36]其列为B类动物传染病，我国也将其列为二类传染病。1878年德国首先发现了该病，直到1969年在美国由Miller从病牛分离到病毒。我国于1974年在上海首次发现报道了此病，随后在其他省市也被报道，成为我国牛的重要传染病之一。李凯航等在对上海市规模化牛场进行牛白血病血清学调查结果中显示从2007[75]年到2009年阳性率从20%增至27%；杨泽林等对重庆部分地区的牛群的血清学调查结[76]果显示不同场阳性率从2.7%-52.50%不等，总阳性率为12.20%；师庆伟等对黑龙江部[77]分牛场的血清学调查结果显示2012年和2013年阳性率分别为9.76%和10.73%。本试验通过ELISA方法调查了甘肃地区牦牛感染BLV的情况，结果显示阳性率为21.09%（白牦牛阳性率为19.10%，黑牦牛阳性率为24.26%）。该地区阳性率相对较高，需要引起足够重视，积极做好防疫工作。通过SPSS19.0软件统计分析发现黑牦牛BLV血清学阳性率高于白牦牛，差异显著（P＜0.05）(OR=1.36,95%CI=1.06–1.73)。这可能与动物的品种、地区差异以及饲养管理方式等有关。不同地区牦牛的BLV血清学阳性率差异显著（P＜0.05），说明BLV的分布16 存在地区差异，应加强严重地区的防治。性别和年龄经统计分析显示差异均不显著。目前尚无特效治疗药物，病畜一般做隔离淘汰处理，对牛群应加强监管，定期进行血清学检查，及时淘汰病牛，隔离疑似牛，防止疫情扩散，尽可能减少损失。1.4.4关于羊边界病该病是由边界病病毒（BDV）引起的羊的一种先天性疾病，也可感染牛、猪及其他动物。BDV主要引起病羊流产、死胎、畸形胎，产下的羔羊多毛、震颤、生长迟缓及畸形发育等，严重时可引起羔羊死亡。该病已呈世界性分布，对我国养羊业的发展存在一定的威胁。1959年BDV首次发现于英格兰和威尔士的边界，随后其他养羊业发达的国家也报道了该病。中国直到2013年才从江苏腹泻羊中分离到该病原，证明其存在。目前国内关于BDV的报道还非常有限，李文良等对江苏地区羊群进行了BDV的分子及血清学调查，多数羊群血清中抗体阳性率在50%左右，采用RT-PCR方法对采集的病料进行检测，其阳性率[45]为27.4%。本实验调查了甘肃和西藏部分地区藏羊血清中BDV抗体情况，结果为18.29%，为边界病在我国的流行情况提供数据基础。且经风险因素分析显示地区、性别、年龄差异均不显著，不视为风险因素。边界病多引起先天性疾病，较少出现暴发流行，但其仍然对养羊业存在威胁，尤其在感染其他病原时其威胁性更大。做好对边界病的防控也尤为重要，不仅可以减少损失，提高羔羊存活率，还有助于减少其他疾病的感染。1.4.5混合感染情况分别对BVDV、BTV、BLV和BDV在牦牛和藏羊中的感染情况进行了统计，其中BVDV在牦牛和藏羊中的抗体阳性率均达到30%以上，是这四种病原中感染率最高的病原，这可能是因为BVDV的传播途径较广，可通过分泌物或排泄物等进行传播。对同种动物不同病毒性疾病之间的感染情况进行统计分析，结果显示牦牛中211头BTV阳性的牛BVDV检测结果也均为阳性，而BLV与BVDV、BTV的混合感染率较低，BTV与BVDV之间可能存在一定联系，牦牛感染BTV后可能会加大感染BVDV的风险。牧民需要重视对牦牛BVDV和BTV的防治，降低感染率，才能获得更高的收益。藏羊中BVDV、BTV和BDV的混合感染率较低，相互之间的联系较小，但也需要注意对各病原的防治，加强养殖场的管理，做好环境卫生工作，降低各病原的感染率，将损失降到最小，促进养殖业的发展。1.5小结1.5.1采用ELISA试剂盒检测证明，牦牛血清中病毒性腹泻病毒抗体阳性率为37.56%，藏羊的抗体阳性率为36.76%；品种和地区差异显著，考虑为风险因素，性别和年龄差异不显著。17 1.5.2牦牛血清中蓝舌病病毒抗体阳性率为13.32%，藏羊的抗体阳性率为20.26%，藏羊相对于牦牛更易感染BTV，地区、性别及年龄差异不显著。1.5.3牦牛血清中牛白血病病毒抗体阳性率为21.09%，黑牦牛BLV血清学阳性率明显高于白牦牛，不同地区差异显著，考虑为风险因素，性别和年龄差异不显著。1.5.4藏羊血清中边界病病毒抗体阳性率为18.29%，地区、性别及年龄差异均不显著。1.5.5BVDV为牦牛和藏羊中感染率最高的病原。牦牛中BVDV和BTV的混合感染率高，藏羊中几种病原混合感染率相对较低。18 第二章牦牛和藏羊微孢子虫病的巢式PCR检测[33]微孢子虫（Microsporidia）是一类广泛分布于动物及人类之中的真核生物。目前发[34]现的微孢子虫已超过1300多个种，190个属，其中毕氏微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）是最主要的一种人畜共患微孢子虫，其主要引起人或动物的腹泻，并与免疫抑[36]制密切相关，严重时会导致免疫低下者甚至引起死亡。最主要的是微孢子虫可以在水[37]源中存活，容易引起该病的水源性爆发，严重危害着动物及人类健康，故引起了广大学者的关注。目前，毕氏微孢子虫病已在多种动物（如黄牛、水牛、绵羊、猪、鹿、狐狸等）发现并报道，但白牦牛和藏羊尚未报道相关感染信息，所以我们通过巢式PCR方法对西北地区牦牛和藏羊微孢子虫病进行了调查。2.1材料2.1.1检测样品及其来源（1）牦牛粪便：试验所用的黑牦牛（大通牦牛）粪便采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲县（118份），白牦牛粪便采自甘肃省武威市天祝藏族自治县（353份）。所有样品的详细信息（如：性别、年龄、地区）由农场主提供，并编号记录统计于表。（2）藏羊粪便：试验所用的藏羊粪便分别采自西藏自治区的尼木县（206份），当雄县（286份），岗巴县（6份）。所有样品的详细信息（如：性别、年龄、地区）由农场主提供，并编号记录统计于表。2.1.2主要仪器：除第一章1.1.2中所述仪器外还有:PCR仪：购自美国BIO-RAD公司电泳仪：购自美国BIO-RAD公司凝胶成像拍照系统：购自英国UVITEC公司2.1.3试剂盒：粪便DNA提取试剂盒EZNARStoolDNAKit(OMEGA,USA)2.2方法2.2.1粪便样品DNA的提取19 根据EZNARStoolDNAKit试剂盒说明书进行操作：（1）称取处理过的牦牛或藏羊粪便样品0.2g于2mL离心管中，置于冰盒上，加入试剂盒中的SP1buffer300μL、玻璃珠200mg、蛋白酶K10μL，震荡涡旋5min使其混合均匀。（2）将（1）中处理过的含有样品的离心管放入70℃的水浴锅中孵育5min，然后涡旋震荡2min混合均匀，再孵育5min（此步反复操作3-4次）。（3）将离心管取出后冰浴2min，加入SP2buffer200μL，涡旋震荡30s使其混合均匀。（4）冰浴5min，室温条件下，12000r/min，离心5min。（5）将离心后管中的上清液缓慢转移到新的1.5mL离心管中。（6）将HTRReagent200μL加入到加有上清液的离心管中，涡旋震荡10s，室温静置2min，然后12000r/min转速离心2min。（7）吸取上清液250μL到新的2mL离心管中，分别加入250μL的BLbuffer和无水乙醇，涡旋震荡10s充分混匀。（8）将750μL混合溶液转移至HiBindDNA吸附柱中，室温下12000r/min，离心1min。（9）弃去收集管中的液体，向吸附柱中加HBbuffer500μL，室温12000r/min，离心1min。（10）弃去收集管中的液体，向吸附柱中加DNAwashbuffer750μL，室温12000r/min，离心1min。（11）换上新的收集管，室温12000r/min，空离1min，晾干5min。（12）将吸附柱转移至新的灭菌的1.5mL离心管中，将已在65℃预热的Elutionbuffer200μL加到吸附柱中，静置2min。（13）室温下10000r/min，离心1min，弃去吸附柱，离心管内液体即DNA提取液，标记后于-20℃保存。2.2.2引物的设计与合成[49]参照Zhang等人应用的引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成后稀释至50pmol/μL。引物序列根据微孢子虫ITS基因序列设计，见表2-1。20 表2-1巢式PCR扩增微孢子虫ITS基因引物序列Table2-1Primersusedinthenested-PCRoftheITSregionofE.bieneusi引物序列目的片段大小（bp）退火温度（℃）ITS-F1:5′-GGTCATAGGGATGAAGAG-3′-55ITS-R1:5′-TTCGAGTTCTTTCGCGCTC-3′ITS-F2:5′-GCTCTGAATATCTATGGCT-3′39255ITS-R2:5′-ATCGCCGACGGATCCAAGTG-3′2.2.3PCR扩增PCR扩增反应体系见表2-2：表2-2巢式PCR扩增反应体系Table2-2Nested-PCRreactionsystem成分第一轮PCR体积（μL）第二轮PCR体积（μL）上游引物0.250.25下游引物0.250.25EX-Taq酶0.150.15模板DNA2.502.50dNTPs2.002.00MgCl21.501.502+10×buffer（Mgfree）2.502.50ddH2O15.8515.85总计25.0025.00PCR扩增反应程序见表2-3：表2-3巢式PCR扩增程序Table2-3Nested-PCRprocedure反应顺序第一轮反应第二轮反应预变性94℃，5min94℃，5min变性94℃，45s94℃，45s35循环退火55℃，1min55℃，1min延伸72℃，1min72℃，45s延伸72℃，10min72℃，10min21 2.2.4PCR产物鉴定巢式PCR反应结束后，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，结果用电子凝胶成像系统照相记录。将392bp左右的阳性目的条带送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。2.2.5数据分析测序结果与GenBank数据库比对，再用ClustalX2.0软件进行多序列比对，并用PAUP*(4.0b4a)软件构建进化树。2.3结果2.3.1牦牛微孢子虫病的分子检测结果本研究采用巢式PCR方法共检测471份牦牛粪便样品，检测到阳性样品共9份（如图2-1），阳性率为1.91%，其中白牦牛阳性率为1.13%（4/353），黑牦牛阳性率为4.26%（5/118）。经风险因素分析，差异显著（P＜0.05）。这9个样品扩增得到的序列与微孢子虫基因序列一致，分别有四个基因型，其中三个为已知基因型（I，BEB4，D），一个为新型（命名为WCY1）。结果已上传至GenBank数据库，并获得收录号：KU598221-598224。并将序列使用PAUP*4.0b4a软件构建了进化树，如图2-2：2.3.2藏羊微孢子虫病的分子检测本研究共检测496份西藏地区藏羊的粪便样品，未检测到阳性样品。图2-1毕氏微孢子虫巢式PCR检测电泳结果，从左到右依次为：Maker，1-4（白牦牛阳性样品），5-9（黑牦牛阳性样品），10-13（阴性样品），+（阳性对照），-（阴性对照），MakerFig.2-1Thenested-PCRproductsofE.bieneusi,fromlefttoright:Maker,1-4(whiteyaks),5-9(blackyaks),10-13(negative),+(positivecontrol),-(negativecontrol),Maker22 图2-2微孢子虫序列进化树,●标记的为本研究中确定的序列Fig.2-2PhylogeneticanalysesoftheE.bieneusigenotypes,thegenotypesidentifiedinthisstudyareindicatedby●23 2.4讨论微孢子虫是细胞内专性寄生的一类真核生物，广泛分布于动物及人类之中。目前已知并命名了160个属，其中有8个属可以感染人，常见的有毕氏微孢子虫、兔脑炎微孢子虫及肠脑炎微孢子虫等。其主要引起人或动物的腹泻，并与免疫抑制密切相关，严重时会导致免疫低下者出现致死性腹泻。微孢子虫及其孢子常在家畜、野生动物的排泄物甚至水源中被发现，严重危害着动物及人类健康，故引起了广大学者的关注。从1959年人类首次发现微孢子虫以来，一直很少引起人类关注，直到学者们发现其在艾滋病人中更易感后，才逐渐关注并研究微孢子虫。近年来，我国学者也对其展开了多项调查。姜艳雪等对东北地区牛羊进行微孢子虫的分子流行病学调查，结果显示在498份绵羊和537份奶牛粪便中分别检测出68个和32个阳性，其中有9个已知基因型和11[78]个新基因型；娄志龙等对东部地区北极狐粪便进行检测，结果显示302份样品中有37[79]份为阳性，包括4个已知基因型及7个新基因型；Ma等对青海牦牛的检测结果显示327[80]份黑牦牛粪便样品中有23份阳性，包括3个已知型和2个新型。本研究对甘肃部分地区牦牛和西藏部分地区藏羊微孢子虫感染情况进行调查，从471份牦牛粪便样品，检测到阳性样品共9份，包括3个为已知基因型：I（n=1），BEB4（n=5），D（n=2）；1个为新型：WCY1（n=1）。其中D和WCY1型为人畜共患型。其阳性率要低于其他地区的调查结果，这可能与选取的样本品种、数量、地区等因素有关。从496份藏羊粪便中未检到阳性，这可能由多种因素引起，其仍可能在其他羊群中感染流行，其感染情况还需进一步调查。微孢子虫属于新兴的机会致病菌，并已呈世界性分布，在动物粪便及水源中均有发现，虽然其对健康群体没有致死性危害，但其对免疫低下者具有严重威胁。故其同样需要引起我们的注意，对其进行必要的防控，减少不必要的损失。2.5小结在本次试验中，白牦牛粪便中微孢子虫阳性率为1.13%（4/353），基因型分别为I（n=1）、BEB4（n=2）、WCY1（n=1）；黑牦牛粪便中微孢子虫阳性率为4.26%（5/118），基因型分别为BEB4（n=3）和D（n=2）；品种为风险因素；藏羊粪便中未检到阳性样品0%（0/496）。24 结论1.本研究应用酶联免疫吸附试验（ELISA），对我国甘肃及西藏牦牛、藏羊的病毒性腹泻病、蓝舌病，牦牛的牛白血病以及藏羊的边界病进行了血清学调查。结果显示：牦牛血清中病毒性腹泻病毒抗体阳性率为37.56%（595/1584），藏羊的抗体阳性率为36.76%（804/2187）；牦牛血清中蓝舌病病毒抗体阳性率为13.32%（211/1584），藏羊的抗体阳性率为20.26%（443/2187）；牦牛血清中牛白血病病毒抗体阳性率为21.09%（334/1584）。BVDV和BLV的风险因素分析显示品种和地区为风险因素，BTV仅显示品种为风险因素；藏羊血清中边界病病毒抗体阳性率为18.29%（400/2187）。牦牛中BVDV和BTV的混合感染率高，藏羊中几种病原混合感染率相对较低，BVDV为牦牛和藏羊中感染率最高的病原。2.本研究采用巢式PCR方法对我国甘肃及西藏牦牛、藏羊的粪便DNA进行了微孢子虫检测。结果显示：白牦牛粪便中微孢子虫阳性率为1.13%（4/353），黑牦牛粪便中微孢子虫阳性率为4.26%（5/118），品种为风险因素；藏羊粪便中未检到阳性0%（0/496）。将9个阳性结果分别进行比对后共确定有4个型,分别为D型（n=2），I型（n=1），BEB4（n=5），及一个新型命名为WCY1（n=1）。25 参考文献[1]殷震，刘景华.动物病毒学（第二版）[M]．北京:科学技术出版社,1997.6452-6465.[2]TalafhaAQ,HircheSM,AbabnehMM,etal.PrevalenceandriskfactorsassociatedwithbovineviraldiarrheavirusinfectionindairyherdsinJordan[J].TropAnimHealthProd,2009,41:499-506.[3]FultonRW,BriggsRE,PaytonME,etal.Maternallyderivedhumoralimmunitytobovineviraldiarrheavirus(BVDV)1a,BVDV1b,BVDV2,bovineherpesvirus-1,parainfluenza-3virusbovinerespiratorysyncytialvirus,MannheimiahaemolyticaandPasteurellamultocidainbeefcalves,antibodydeclinebyhalf-lifestudiesandeffectonresponsetovaccination[J].Vaccine,2004,22:643-649.[4]SarrazinS,VeldhuisA,MérocE,etal.SerologicalandvirologicalBVDVprevalenceandriskfactoranalysisforherdstobeBVDVseropositiveinBelgiancattleherds[J].PrevVetMed,2013,108:28-37.[5]FernandesLG,deCamposNogueiraAH,DeStefanoE,etal.Herd-levelprevalenceandriskfactorsforbovineviraldiarrheavirusinfectionincattleintheStateofParaíba,NortheasternBrazil[J].TropAnimHealthProd,2016,48:157-165.[6]王国超，白鸽，王选,等.牛病毒性腹泻-黏膜病研究概述[J].动物医学进展,2016,37(10):108-111.[7]OlafsonP,MaccallumAD,FoxFH.Anapparentlynewtransmissiblediseaseofcattle[J].CornellVet,1946,36:205-213.[8]朱礼倩，周艳君，于海,等.牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析[J].中国动物传染病学报，2011,19(5):83-86.[9]韩猛立，黄新，钟发刚,等.牛病毒性腹泻病流行现状与防制[J].中国奶牛，2010,3:35-38.[10]WilliamsD,WindenSV.RiskfactorsassociatedwithhighbulkmilkantibodylevelstocommonpathogensinUKdairies[J].VetRec,2014,174:580.[11]WernickiA,Urban-ChmielR,StęgierskaD,etal.Detectionofthebovineviraldiarrhoeavirus(BVDV)inyoungbeefcattleineasternandsouth-easternregionsofPoland[J].PolJVetSci,2015,18:141-146.[12]王慧慧，时坤,于本峰,等.牛病毒性腹泻疫苗的研究进展[J].经济动物学报,2010,14(1):59-62.[13]王建领,付彤,刘杰,等.牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展[J].河南农业科学,2012,(03):7-11.[14]郝宝成,梁剑平,王学红,等.牛病毒性腹泻病研究进展及防控建议[J].中国奶牛,2013,(02):45-48.[15]张淑琴,谭斌,武华.牛病毒性腹泻病毒在野生动物中的感染[J].畜牧与兽医,2012,318(01):100-103.[16]NoamanV,ShirvaniE,HosseiniSM,etal.SerologicalsurveillanceofbluetonguevirusincattleincentralIran[J].VetItal,2013,49(2):141-144.26 [17]GaireTN,KarkiS,DhakalIP,etal.Cross-sectionalserosurveyandassociatedfactorsofbluetonguevirusantibodiespresenceinsmallruminantsofNepal[J].BMCResNotes,2014,7(1):691.[18]KhairHO,AdamIA,BusharaSB,etal.PrevalenceofbluetonguevirusantibodiesandassociatedriskfactorsamongcattleinEastDarfurState,WesternSudan[J].IrVetJ,2014,67(1):4.[19]林汉亮，冉多良，王文.蓝舌病研究进展[J].新疆畜牧业,2008,1:4-6.[20]苗志强，郑明学，古少鹏,等.蓝舌病的流行状况及防控措施[J].黑龙江畜牧兽医，2010，5:28-30.[21]ArunS,JohnK,RavishankarC,etal.SeroprevalenceofbluetongueamongdomesticruminantsinNorthernKerala,India[J].TropBiomed,2014,31(1):26-30.[22]翁善钢.蓝舌病研究综述[J].广东畜牧兽医科技.2012,37(1):10-16.[23]殷丽霞.蓝舌病研究现状[J].吉林畜牧兽医.2009,5(30):8-10.[24]王荣亮,胡骑,信爱国.蓝舌病病原分子生物学及免疫学研究进展[J].中国畜牧兽医,2011,38(8):177-181.[25]刘威,常建华.蓝舌病病毒病的研究进展[J].当代畜禽养殖业,2013,(08):14-18.[26]刘松婷.蓝舌病病毒四种检测技术比较研究[D].扬州大学,2010.[27]何宇乾,吴海燕,徐琼.蓝舌病的流行现状[J].中国兽医科学,2012,(05):537-540.[28]李寿春,杨友椿,肖建忠.牛羊蓝舌病的综合防制[J].畜牧兽医科技信息,2015,(03):74-75.[29]KenyonSJ,PiperCE.Cellularbasisofpersistentlymphocytosisincattleinfectedwithbovineleukemiavirus[J].InfectImmun,1977,16(3):891-897.[30]张宝良，唐大为，姚树国.牛白血病的诊断与防控[J].畜牧与饲料科学，2010,31(3):166-167.[31]SchwartzI,LevyD.Pathobiologyofbovineleukemiavirus[J].VetRes,1994,25(6):521-536.[32]GutiérrezG,AlvarezI,PolitzkiR.NaturalprogressionofbovineleukemiavirusinfectioninArgentineandairycattle[J].VetMicrobiol,2011,151(3-4):255-263.[33]KobayashiS,HidanoA,TsutsuiT.AnalysisofriskfactorsassociatedwithbovineleukemiavirusseropositivitywithindairyandbeefbreedingfarmsinJapan:anationwidesurvey[J].ResVetSci,2014,96(1):47-53.[34]SunWW,LvWF,CongW.MycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisandbovineleukemiavirusseroprevalenceandassociatedriskfactorsincommercialdairyandbeefcattleinNorthernandNortheasternChina[J].BiomedResInt,2015,315173.[35]MousaviS,HaghparastA,MohammadiG,etal.Prevalenceofbovineleukemiavirus(BLV)infectioninthenortheastofIran[J].VetResForum,2014,5(2):135-139.[36]OIE.Enzooticbovineleukosis.Manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals.6thed.Paris,France:OIE,2008,729-738.[37]林立,孔繁德.牛地方流行性白血病诊断技术的研究进展[J].中国畜牧兽医文摘，2012,28(1):23-2427 [38]龙塔,潘耀谦.流行性牛白血病的病原及传播途径研究进展[J].动物医学进展.2004，25(6):65-68.[39]庄雨龙,徐世文,桑学波.奶牛白血病的诊断与防控[J].现代化农业.2016,6:45-46.[40]王永志.牛白血病的诊断及预防[J].中国畜牧兽医文摘,2013，4:120.[41]王作佳,赵祥平,王乃福,等.两种方法检测牛地方流行性白血病的比较[J].中国动物检疫,2013，10：74-76.[42]毛立，刘霞，李文良，等.边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J].江苏农业学报，2015,31(1)：93-99.[43]VegaS,RosellR,OrdenJA,etal.AntigenicandmolecularcharacterizationofborderdiseasevirusassociatedwithhighmortalityinlambsinSpain[J].VetRecOpen,2015,2(1):e000048.[44]PelettoS,CarusoC,CeruttiF,etal.Anewgenotypeofborderdiseaseviruswithimplicationsformoleculardiagnostics[J].ArchVirol,2016,161(2):471-477.[45]李文良，毛立，赵永前，等.江苏部分地区羊群边界病流行情况调查[J].中国兽医学报，2013,33(12):1808-1812.[46]VannierP,AlbinaE.牛病毒性腹泻与边界病[J].养猪，2011,4:83-85.[47]刘霞，毛立，李文良，等.1株绵羊边界病病毒的分离鉴定与序列分析[J].畜牧兽医学报，2014,45(3):434-442.[48]朱勃，沈中元，曹喜涛.微孢子虫起源和进化研究进展[J].江西农业学报，2007,19(1):154-158.[49]ZhangXX,JiangJ,CaiYN,etal.MolecularcharacterizationofEnterocytozoonbieneusiindomesticrabbits(Oryctolaguscuniculus)inNortheasternChina.Korean[J].JParasitol,2016,54:81-85.[50]YangY,LinY,LiQ,etal.Widespreadpresenceofhuman-pathogenicEnterocytozoonbieneusigenotypeDinfarmedfoxes(Vulpesvulpes)andraccoondogs(Nyctereutesprocyonoides)inChina:firstidentificationandzoonoticconcern[J].ParasitolRes.,2015,114:4341-4348.[51]QiM,WangR,WangH,etal.EnterocytozoonbieneusigenotypesingrazinghorsesinChinaandtheirzoonotictransmissionpotential[J].JEukaryotMicrobiol,2016，[Epubaheadofprint][52]刁瑞南,肖立华,宋铭忻,等.毕氏肠微孢子虫基因分型及公共卫生学重要性[J].中国预防兽医学报，2014,36(12):988-991.[53]朱宏儒,刘璐,杨国静.我国新发人畜共患寄生虫病的流行现状[J].中国血吸虫病防治杂志，2013,25(4):417-421.[54]HuY,FengY,HuangC,etal.Occurrence,source,andhumaninfectionpotentialofCryptosporidiumandEnterocytozoonbieneusiindrinkingsourcewaterinShanghai,China,duringapigcarcassdisposalincident.Environ[J].SciTechnol,2014,48:14219-14227.[55]Jiang,Y,TaoW,WanQ,etal.Zoonoticandpotentiallyhost-adaptedEnterocytozoonbieneusigenotypesinsheepandcattleinNortheastChinaandanincreasingconcernaboutthezoonoticimportanceofpreviouslyconsideredruminant-adaptedgenotypes[J].ApplEnvironMicrobiol,2015,81:3326-35.28 [56]QiM,WangR,WangH,etal.EnterocytozoonbieneusigenotypesingrazinghorsesinChinaandtheirzoonotictransmissionpotential[J].JEukaryotMicrobiol,2016,[Epubaheadofprint].[57]WangL,XiaoL,DuanL,etal.ConcurrentinfectionsofGiardiaduodenalis,Enterocytozoonbieneusi,andClostridiumdifficileinchildrenduringacryptosporidiosisoutbreakinapediatrichospitalinChina[J].PLoSNeglTropDis,2013,7:e2437.[58]李佑民，刘振润.牛病毒性腹泻-粘膜病病毒株（长春184）的分离与鉴定[J].兽医大学学报,1983,2:113-120.[59]杨得胜,林芬,魏良宇,等.福建省牛病毒性腹泻病的血清学调查[J].中国动物检疫，2008,25(12):36-37.[60]石冬梅，张华，邓红雨,等.河南省奶牛病毒性腹泻-黏膜病血清学调查[J].中国农学通报，2011,27(7):335-337.[61]张俊杰，凌宗帅，黄凯，等.北京地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病血清学调查[J].中国奶牛，2010:41-42.[62]何美琳,张焕容,王永,等.川西北牦牛3种病毒性腹泻病血清学调查[J].中国畜牧兽医，2014，41(3):248-250.[63]王新平,朱维正,任文陡,等.牛、羊感染病毒性腹泻-粘膜病的调查[J].中国畜禽传染病，1993,4:41-42.[64]李树博.辽宁省牛、羊BVDV、IBRV血清流行病学调查与IBRV病毒分离鉴定[D].中国农业科学院，2012.[65]郭芙莉，包振中，蔡元庆,等.新疆北疆地区牛、羊病毒性腹泻-黏膜病的血清学调查[J].新疆畜牧业，2014,2:40-41.[66]汪溪念,赵国源.浙江省牛羊蓝舌病血清学调查[J]．动物检疫，1990，4:26-27.[67]何雪峰,刘君,刘江,等.毕节市牛、羊血清的流行病学调查报告[J]．中国畜禽种业，2015，5:8-9.[68]韩晋玫，李坤，易俊，等．西藏部分地区黄牛蓝舌病流行病学调查[J].中国奶牛,2014，22:62-63.[69]白俊英,裴天云,卞启华,等.牛蓝舌病的血清学调查[J].中国兽医科技,1991，5:18-19.[70]段正赢,戴德强,周丹娜,等.2013年湖北省山羊蓝舌病血清学调查[J].畜牧与兽医,2016，2:110-112.[71]陈建闪,申杜娟,于叶平,等.山西省牛羊蓝舌病血清流行病学调查与分析[J].中国动物检疫，2016，9:16-19.[72]张明国,安燕.攀西地区牛羊蓝舌病血清学调查[J].上海畜牧兽医通讯,2016,5:39-40.[73]冯杰,崔燕,余四九,等.贵州高海拔山区羊疫病血清学调查[J].贵州农业科学,2016,6:103-107.[74]曲久,高家登.西藏那曲地区蓝舌病血清流行病学调查[J].中国动物检疫,2016,2:15-16.[75]李凯航,陈秉楠,王建.2007～2009年上海市规模化养牛场牛白血病血清学调查[J].上海畜牧兽医通讯，2011,1:31.29 [76]杨泽林,米自由,熊仲良,等.重庆市部分地区牛传染性鼻气管炎和流行性牛白血病的血清学调查[J].畜牧市场,2010,2:10-12.[77]师庆伟,桑学波,刁彩霞,等.黑龙江省规模化奶牛场牛白血病血清学调查[J].中国畜牧兽医文摘,2014,4:81.[78]姜艳雪.黑龙江省部分地区绵羊三种肠道原虫基因分型及人兽共患可能性评价[D].东北农业大学,2016.[79]娄志龙.我国东部地区养殖北极狐弓形虫、微孢子虫、隐孢子虫流行病学调查和基因型研究[D].吉林农业大学,2016.[80]MaJ,CaiJ,MaJ,etal.Enterocytozoonbieneusigenotypesinyaks(Bosgrunniens)andtheirpublichealthpotential[J].JEukaryotMicrobiol,2015,62,21-25.30 作者简介姓名马剑钢性别男民族汉族籍贯浙江绍兴政治面貌团员入学时间2014.9申请学位农学硕士论文答辩日期2017.5.20授予学位年月2017.6类别就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2010.9—2014.7就读于吉林农业大学动物科学技术学院动物医学专业2014.9—2017.6就读于吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息刊物名称署名发表情况题目署名单位（级别）次序(刊出时间/录用)发表学术论文FirstReportofBovineLeukemiaBioMedResVirus(BLV)InfectioninYaksInt（SCI,1吉林农业大学2016.6IF:2.134）(Bosmutus)inChinaSeroprevalenceandriskfactorsofTropAnimbovineviraldiarrhoeavirusHealthProd兰州兽医12016.8(BVDV)infectioninyaksin（SCI,研究所northwestChinaIF:0.87）31 SeroprevalenceandRiskFactorsBioMedResofBluetongueVirus(BTV)兰州兽医Int（SCI,12017.4InfectioninTibetanSheepand研究所IF:2.134）YaksinTibetanPlateau,ChinaDetectionofEnterocytozoonBioMedRes兰州兽医bieneusiinwhiteyaksinGansuInt（SCI,1录用研究所Province,ChinaIF:2.134）获署名名称成果级别署名单位发表情况奖次序项目及专利32 致谢时光冉冉，岁月如梭，不知不觉三年的硕士研究生生涯即将结束。闭上眼，这三年来的种种回忆都浮现在眼前。在这三年里我经历了许多事、学习了很多知识、认识了很多朋友和老师，在这里我需要感谢太多的人。首先我要感谢我的导师吉林农业大学的胡桂学教授和中国农业科学院兰州兽医研究所的朱兴全研究员。感谢他们将我领入预防兽医学的大门，并对我毕业论文开题、实验设计以及论文的撰写进行悉心指导和认真修改，在我平时的实验过程中，为我指点迷津、开拓思路。在读期间，我能深深的感受到老师们渊博的知识，崇高的师德，严谨的态度以及务实的工作作风，让我能以他们为榜样。在此，谨向两位恩师致以最诚挚的谢意！衷心的感谢本实验室的王开老师，宋慧群老师、周东辉老师、黄思扬老师、李发财老师一直以来对我的尽心的指导和无私的帮助。还要特别感谢在我硕士期间对我悉心指导的丛伟师兄、张晓轩师兄、娄志龙师兄、应瑛师姐以及王一鸣师兄，是他们带我一步一步从懵懂慢慢学会各种技能掌握各种知识，是他们毫不吝啬的将所学的知识都教给了我。感谢中国农业科学院兰州兽医研究所家畜寄生虫病团队的刘国华师兄、陈佳师兄、李中原师兄、王萌师姐、王金磊师兄、周春雪师兄、刘卿师兄、冯胜勇师兄、刘文阁师兄、徐晓佩师姐、高德珍师姐、程田师姐以及宋光耀师兄在论文的完成过程中无私的帮助和指导。感谢郑文斌、岳东梅、吴耀东、张芙凯、朱俊辉、潘娜、伊淑帅、于竞杰、韩亮以及邹扬师弟在实验和生活中相互支持和帮助！在此对上述以及未提及的有关人员表示由衷的感谢！还要感谢我的亲人们，感谢你们这么多年对我的关心和爱护，感谢你们的支持，让我能顺利完成学业！千言万语都无法表达我内心的谢意，唯有更好地学习、工作来报答你们！谢谢你们！本研究是在中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室完成的，得到33 国家公益性行业（农业）科研专项经费项目（201303037）、中国农业科学院基本科研业务费专项项目（编号：1610312016025、Y2016JC05、Y2016JC06）及中国农业科学院科技创新工程项目（编号：CAAS-ASTIP-4012-LVRI-03）的资助，特此致谢！34