河南省猪、羊毕氏微孢子虫病分子流行病学调查及遗传特征初步研究

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河南农业大学硕士学位论文题目河南省猪、羊毕氏微孢子虫病分子流行病学调查及遗传特征初步研究学位申请人姓名杜海利导师姓名宁长申教授学科专业预防兽医学研究方向人兽共患原虫生物学中国郑州2013年10月万方数据 分类号密级河南农业大学硕士学位论文论文题目：河南省猪、羊毕氏微孢子虫病分子流行病学调查及遗传特征初步研究英文题目:StudiesonMolecularEpidemiologyandGeneticCharactersofEnterocytozoonbieneusiinpig,sheepandgoatinHenanofProvince学位申请人：杜海利导师：宁长申教授专业：预防兽医学研究方向：人兽共患原虫生物学论文提交学位授予日期：日期：万方数据 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论河南省猪、羊毕氏微孢子虫病分子流行病学查学位硕士文题目及遗传特征初步研究级别学生学科导师杜海利预防兽医学宁长申教授姓名专业姓名学位论文保密如需保密，解密时间2014年7月1日是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。研究生签名：导师签名：日期：年月日学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有,否则，承担相应的法律责任。注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。研究生签名：导师签名：学院领导签名：日期：年月日万方数据 本论文受到下述项目资助：1、“十二五”国家现代农业产业技术体系(nycytx-39)国家现代肉羊产业技术体系寄生虫病防治(CARS-39)，农业部，2011-20152、河南省重大科技专项—生猪健康养殖及猪肉安全保障技术研究与示范：子课题三：猪肉安全保障关键技术研究与示范111100110300-3；专题：猪主要寄生虫病防控技术研究与示范111100110300-3-1，河南省科技术厅，2011-2014万方数据 致谢攻读硕士研究生学位期间经历颇大的挫折，毕业论文的完成凝聚了很多人的心血，在这里对帮助我完成论文的所有人表示衷心的感谢。本论文是在导师宁长申教授的悉心指导下完成的。四年来，恩师给予的关怀、鼓励使我从人生的最低谷走向正轨，我终生感激、难忘；他的为人和对待困难的态度是我的榜样；他渊博的知识及严谨细致、一丝不苟的作风让我受益终生；他高屋建瓴的科学思维及勇于开拓的敬业精神给我以学术上的指引；他将成为我学习、工作的终身动力和目标。谨值此文完成之际，向恩师表示最诚挚的感谢和最崇高的敬意！衷心感谢课题组的张龙现教授、菅复春副教授、张素梅副教授、王荣军副教授、赵青玉老师和刘红英实验师四年来在学习、试验和生活上给予我的关怀与帮助。感谢导师组崔保安教授、王川庆教授、张改平研究员、夏平安教授、许兰菊教授、李文刚教授、陈陆教授、陈红英副教授、王亚宾副教授、陈丽颖副教授、张红英副教授、杨霞副教授、贺秀媛副教授、李新生副教授和王新卫副教授等老师在完成课程学习和学位论文试验中对我的指导和帮助，在此致以诚挚的谢意！感谢美国疾病控制和预防中心(亚特兰大)寄生虫病分子流行病学实验室主任资深科学家肖立华博士给予的热情指导和大力帮助。感谢牧医工程学院程功鹏书记等各位领导及团委老师对我学习、生活的关心、帮助。感谢我的同学朱丹、宋丹、李梦婕、张云、史亚东、赵子方、袁林、刘学涵、张祥、吕文强、周永辉；师兄齐萌、黄磊、席建伟、吴国泉；师姐徐利纳、杨楠、乔亚辉；师弟卫九健、彭永帅、王金鸿、李俊强、曹树轩、崔朝辉、；师妹张菲菲、吕亚丽、孙芳芳、刘仙霞、等全体寄生虫学的全体成员在生活、试验中提供的无私帮助。最后，要深深地感谢我的父母、妹妹、弟弟以及其他亲人对我的大力支持，正是在他们无私的关心和鼓励下，才使我顺利的完成硕士研究生的学业，感谢他们为我的求学之路作出的巨大牺牲和奉献！万方数据 目录摘要···············································································································1第一部分文献综述第一章微孢子虫病及其防控·················································································2第二章毕氏微孢子虫病的流行与传播····································································12第二部分研究内容第一章河南省猪肠道寄生虫感染情况调查1引言···········································································································162材料与方法··································································································163结果与分析··································································································174结论与讨论··································································································23第二章河南省猪毕氏微孢子虫感染情况调查及系统进化分析1引言···········································································································252材料与方法··································································································253结果与分析··································································································284结论与讨论··································································································31第三章河南省羊毕氏微孢子虫感染情况调查及系统进化分析1引言···········································································································352材料与方法··································································································353结果与分析··································································································364结论与讨论··································································································38结论和创新点········································································································42参考文献··············································································································43英文摘要··············································································································52万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文摘要微孢子虫是一类广泛分布于自然界专性细胞内寄生的真核原生动物，能感染多种宿主，包括无脊椎动物和脊椎动物，是一类人兽共患性疾病病原。它包括1400多种，分别被划入150多个属，其中至少8个属14种微孢子虫能感染人。20世纪80年代以来，随着AIDS广泛流行，微孢子虫被认为是一种重要的条件性致病菌。微孢子虫可以感染免疫功能缺陷者和免疫功能正常者，免疫力正常的人和动物感染微孢子虫后表现为一过性症状，或呈隐性感染；免疫力低下的病人、免疫功能抑制者、免疫缺陷患者尤其是AIDS患者感染后会引起致死性腹泻，是艾滋病患者的主要致死因素之一。此外，微孢子虫还可引起角膜炎，脑炎，心肌炎、泌尿系统、呼吸系统等疾病。微孢子虫病作为一种新发传染病已引起世界范围的公共卫生问题，被美国国立过敏和传染性疾病研究院列入第二类具有潜在危险的微生物名单。为了解我省部分地区猪、羊毕氏微孢子虫病的流行情况，为微孢子虫病的防治及今后的研究提供参考依据，对我省部分地区的猪、羊群进行了毕氏微孢子虫感染情况调查及分子特征的初步研究。1、为了解我省部分地区猪肠道寄生虫病的感染及危害情况，科学地制定防治计划，合理指导动物肠道寄生虫病的防治工作，于2013年5月—2013年9月对河南省7个地区(郑州金水区、辉县、原阳、漯河召陵区、西华、信阳罗山县、中牟)及四川北川等地采集462份样品，应用卢戈氏碘液染色法、饱和蔗糖溶液漂浮法和麦克马斯计数法等方法对所有样品进行检查，结果285份样品查到不同种寄生虫感染，总感染率为61.93%；共查到球虫、隐孢子虫、贾第虫、鞭虫、圆线虫、蛔虫、结肠小袋纤毛虫、阿米巴等8种(类)肠道寄生虫，其中阿米巴感染率最高，为44.81%；且球虫感染强度在<200-4600,圆线虫的感染强度在<200-600。2、为了解河南省部分地区猪毕氏微孢子虫的感染情况及分子特征，用巢氏PCR技术对462份粪便样品进行检测。结果检出120份阳性样品，感染率为25.97%，基因片段长392bp。不同年龄的猪及不同饲养方式饲喂的猪，微孢子虫感染率都存在差异，不同年龄阶段的感染率顺序为：育肥猪(24.07%)、母猪(21.13%)、保育猪(18.52%)、乳猪(12.90%)、公猪(8.33%)；小专业户感染率(42.15%)高于散养(16.08%)高于规模化(3.13%)。河南省中牟毕氏微孢子虫的感染率最高56.41%。将阳性样品测序、BLAST比对后，得到6个序列，在Genbank下载得到的6个序列，应用ClustalX1.81、Phyloip3.64、DNAstar4.0等生物信息学软件对12个序列进行比对、同源性分析及构建分子发育进化树，最后显示结果，猪感染五个基因型的毕氏微孢子虫，分别为：F(26.47%)、PigEBITS5(2.94%)、EbpD(2.94%)、TypeIV(2.94%)、EbpC(E、Peru4、WL13)(61.76%)，其中、EbpC、TypeIV基因型也在人类中发现，有人畜共患的潜在风险，还有一个新的基因型，它与人源性基因型Typeⅳ关系最近，有一个碱基的差异，同源性为99.7%。3、为了解河南省部分地区羊毕氏微孢子虫的感染情况及分子特征，用巢氏PCR技术对802份粪便样品进行检测。结果检出74份阳性样品，感染率为9.23%，基因片段长392bp。不同饲养方式、不同品种、年龄的羊及不同季节的羊，微孢子虫感染率存在差异，绵羊感染率(6.93%)低于山羊(12.35%)；幼龄羊感染率(10.34%)高于成年羊(7.62%)；7-9月羊感染率(12.84%)高于10-12月第1页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文羊(4.92%)；放牧羊感染率(13.99%)高于舍饲羊(6.59%)。将阳性样品测序、BLAST比对后，得到6个序列，在Genbank下载得到的6个序列，应用ClustalX1.81、Phyloip3.64、DNAstar4.0等生物信息学软件对12个序列进行比对、同源性分析及构建分子发育进化树，最后显示结果，羊感染五个基因型的毕氏微孢子虫分别为：BEB6(83.8%)、EbpC/E/Peru4/WL13(9.46%)、D(2.70%)、其中EbpC、D基因型也在人类中发现，有人畜共患的潜在风险，此外，发现2种新基因型，一种与基因型BEB6较接近，同源性为94.4%，一种在独立的分支上。本研究首次对河南省部分地区猪、羊的毕氏微孢子虫病流行情况进行了调查，并初步研究了其分子特征，发现感染猪、羊的毕氏微孢子虫与分离人类的3种基因型的毕氏肠微孢子虫同源性高达100%，表明猪源、羊源毕氏肠微孢子虫具有人兽共患风险和重要的公共卫生学意义，同时为今后的相关研究提供了参考依据。关键词：猪；羊；毕氏微孢子虫；感染；流行病学；ITS基因；巢氏PCR；种系发育第2页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文第一部分文献综述第一章微孢子虫病及其防控1引言微孢子虫是一类广泛分布于自然界专性细胞内寄生的真核原生生物，能感染多种宿主，包括无脊椎动物和脊椎动物，是一类人兽共患性疾病病原。它包括1400多种，分别被划入150多个属中，其中至少8个属13种微孢子虫能感染人，分别为：E脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon.Cuniculi)，肠上皮细胞微孢子虫属(Enterocytozoon.hellem，E.intestinalis，E.bieneusi)，匹里属微孢子虫属(Pleistophoraronneafiei)，微粒子虫属(Nosemaocularum)，微孢子虫属(Microsporidiumafricanus，M.ceylonensis)，Trachipleistophorahominis，T.Aanthropothera，Brachiolavesicularum，[1]Brachiola.(Nosema)algerae，B.(Nosema)connori，Vittaforma(Nosema)cornea。[2]早在1857年，微孢子虫作为病原体首次被发现在蚕中，并且很长时间一直被认为是经济昆[3][4][5]虫重要疾病的病原体，例如蚕、蜜蜂、鱼类和哺乳动物(兔，毛皮动物，啮齿类实验动物)等。[6]Matsubayashi等(1959)在日本报道了首例人类微孢子虫病病例，20世纪80年代以来，随着AIDS[7]广泛流行，微孢子虫被认为是一种重要的条件性致病菌。微孢子虫可以感染免疫功能缺陷者和免疫功能正常者，免疫力正常的人和动物感染微孢子虫后表现为一过性症状，或呈隐性感染；免疫力低下的病人、免疫功能抑制者、免疫缺陷患者尤其是AIDS患者感染后会引起致死性腹泻，是艾滋病患者的主要致死因素之一。此外，微孢子虫还可引起角膜炎，脑炎，心肌炎、泌尿系统、呼吸系统等疾病。微孢子虫病作为一种新发传染病已引起世界范围的公共卫生问题，被美国国立过敏和传染性疾病研究院列入第二类具有潜在危险的微生物名单。本文就微孢子虫的病原特征(结构、生活史、流行病学和传播方式)、分子生物学、种系发育、诊断治疗方面进行全面的论述。2病原体2.1结构和生活史2.1.1结构所有的微孢子虫是专性细胞内寄生的单细胞真核生物，生命周期包括增殖的卵片发育阶段和孢子生殖阶段。微孢子虫的孢子在1~3μm×1.5~4μm之间。感染哺乳动物的种通常较小，直径大[8]约1~3μm。孢子壁较其他虫要厚，有三层构成：第一层是有蛋白质构成的高密度外壁，抵抗外界环境；第二层是有几丁质构成的低密度内壁；第三层是包裹孢子质的质膜。微孢子虫的孢子质包括靠近顶端的附着盘、板层状的极胞体、螺旋状的极管、核糖体、孢子核(单核或者二倍核)、[9-10]后置空泡(见图1-1)。螺旋极管和附着盘是所有微孢子虫特有的结构，螺旋极管的数量和排列在不同的种属之间有很大的差异。在宿主体内，只要条件合适，极管从薄的孢子壁前端穿透，刺破一个新的宿主细胞，将孢子内容物接种到宿主细胞的细胞内，所以说，极管具有促使微孢子虫[11]感染宿主细胞的能力。2.1.2卵块发育第3页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文在适当的宿主细胞内，从孢子中释放出来的孢子质变成裂殖体，裂殖体是圆形、不规则形、或者是稍微分化细胞质形成的细长简单胞体，外表覆盖胞浆膜。裂殖体可能有单独的核，或者是二倍体的核。在宿主细胞里，裂殖体通过二元或多元裂变重复分裂增殖的阶段叫做卵块发育。核裂变也有可能发生在细胞没有分裂时，这也最终导致多核的合胞体现象。2.1.3孢子增殖裂殖体发育成有高电子密度外衣的孢子，外衣最终发育成孢子壁的外壁。孢子体通过二元或多元裂变增殖，分化成母孢子，最后发育成成熟的孢子。孢子可以是单核也可以是双核。一些孢子通过二元分裂直接发育成母孢子，而另一些进入多核的合胞体阶段。母孢子是卵圆形的，通过合成孢子的细胞器发育成熟。卵片发育和孢子增殖是经典微孢子虫经典的生活史，不同的种属之间会有改变。2.2分类和种系发育1587年，Nagëli命名了第一个微孢子虫种—家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)，并把它归类为[12]裂殖菌纲。1882年，Balbiani定义了微孢子虫目，并且把Microspora改为Microsporidia。1976年，Sprague定义了微孢子虫门，微孢子虫目和微孢子虫门被划入Levine于1980年创立的原生动物亚界。早期分类这些病原微生物主要基于生活史、在发育中和发育成熟时所呈现的超微结构、[13]核排列、极丝圈的数目及排列、发育时的细胞内定位及核与细胞的侵入模式。基于对微孢子虫病的重视，微孢子虫的分子生物学技术和方法得到很大的发展，人们对它的种系发育和分类进行深入的研究。1998年，Sprague改变了1882年Balbiani对微孢子虫的命名，Cavalier-Smith根据微孢子虫多个蛋白质基因序列的分析比较结果和微孢子虫孢子与真菌分生孢子的相似结构，提出了新的六界分类系统(包括Protoza，Animalia,Bacteria,Plantae,Fungi,Chromista)，将微孢子虫归为真菌后生动物类群(Fungi/Metazoagroup)真菌界微孢子虫门(Microsporidia)，而将微孢子虫门和微孢子虫均统称为Microsporidia，而将未分类的微孢子虫统一归为Microsporidium。这一分类方[14]法已被GenBank所接受和采用。在对微孢子虫基本生物学调查中，已经发现极其特殊的特性，它具有一个典型的真核生物的核结构、内膜系统和细胞骨架，也具有原核生物的分子和细胞学特征，包括翻译机制的功能、基因组的大小(这是在细菌的范围内)，通过有丝分裂纺锤体进行染色体分离，但是它们缺乏可识别[15]的线粒体、过氧化物酶体，高尔基体。由于它们的原核生物特征，微孢子虫初步归类为原真核[16]生物，连同其他无线粒体生物包括贾第虫，毛滴虫，阿米巴，被认为是最原始的真核生物。然而，E.cuniculi的基因组序列显示，它包含一些关于线粒体功能的基因，表明微孢子虫保留了线粒[17]体派生的细胞器。事实上，通过抗线粒体HSP70蛋白的抗体结合实验都能表明在感染人的微[18]孢子虫种T.hominis中有着双膜结构的小细胞器。此外，复杂的系统发育分析也表明，微孢子虫也可认为是具好良好宿主适应性，高度进化的[19]类似真菌的专性寄生虫，同时也可以说它属于真菌。与微孢子虫进化关系最密切的子囊菌纲和[20]担子菌类。微孢子虫拥有许多真菌的特性，如甲壳素的存在(虽然甲壳素也被发现在其他门类，第4页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图1-18微孢子虫孢子和典型的生活史（不同的种属之间有差异）FIG1-1.Diagramofamicrosporidiansporeandrepresentativelifecycle(merogonicandsporogonicstagesvaryamongdifferentgenera).[21][22]如动物，软体动物)和海藻糖、孢子周期之间的相似性、某些基因的组成等。因此，微孢子虫是当今被认为是高度衍生的真菌，它遭遇了遗传和功能上的损失，所以成为迄今为止所已知的[23-24]具有最小基因组的真核生物。微孢子虫和真菌之间的关系可能对新的治疗策略有影响。虽然微孢子虫一般可以用苯达唑和[25-26]烟曲霉素成功治疗。但是最普遍的毕氏微孢子虫(E.bieneusi)，治疗效果却不佳。事实上，一[27-28]些研究表明，因为合成微孢子内壁所需要几丁质合成酶，针对此酶的抑制剂是有效果的。2.3生物多样性第5页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文2.3.1物种多样性物种多样性即生命有机体(动物、植物、微生物)物种的多样化。据报道，家蚕中已经分离同属不同种或同属同种异型的微孢子虫数十种，并且仅Nosema属中则已分出一百种多种不同的微[29]孢子虫；人和动物感染微孢子虫的病例在世界各地都有报道。随着检测技术的提高，发现的新型微孢子虫也越来越多，迄今为止，已经被检测到1400多种。由于微孢子虫可寄生在大多数的脊椎动物和无脊椎动物中，甚至在少数原生动物如软体动物和纤毛虫中也有发现，特别是微孢子虫是嗜昆虫原生动物中最重要的一种，几乎整个昆虫纲各个目的昆虫都是其的寄生者，所以说微孢子虫种或许与动物种的数量相当，也就是说微孢子虫可能和动物种类一样多。2.3.2遗传多样性遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，它指的是地球上所有生物所携带的遗传信息的总和，片面的说就是种内不同群体之间或一个群体内不同个体遗传变异的总和，或者也可称之为遗传变异。随着生化技术和生物技术的发展，人们对微孢子虫的染色体数、保守的rRNA序列分析、蛋白质编码基因、核型有了较多的了解，发现即使同属(如Nosema属)的微孢子虫的染色体大小、基因组的结构都不相同，哺乳动物微孢子虫的基因组结构比细菌更小，并且随着基因序列研究的不断深入，人们获得分子信息量大大增加，这将为微孢子虫的生物多样性提供更多的依据。2.3.3生态系统多样性生物圈内生存环境、生物群落和生态系统的多样性以及生态系统内生存环境差异、生态过程[30]变化的多样性就是生态系统多样性。微孢子虫寄生在自然界的脊椎动物和无脊椎动物，几乎整个昆虫纲的昆虫都有被寄生者，大多数都至少受到一种及一种以上的微孢子虫寄生，而且，从卵到成虫的任何一个发育阶段都可能感染微孢子虫。微孢子虫的传染源也表现多样性和复杂性。例如家蚕微孢子虫，它不仅存在于病蚕、蛾及其尸体、排泄物(蚕粪、胃液、蛾尿)，脱离物(病卵壳、蜕皮壳、蛹壳、鳞毛)、蚕茧等；同样存在于患病昆虫的尸体、排泄物、脱离物，而且在被微孢子虫污染的桑叶、蚕场、蚕室、蚕具、蚕座、甚至水等环境中均有可能存在。此外微孢子虫还表现出生物地理学的多样性。法国1845年首次报道家蚕微粒子病，随后传遍西班牙、意大利、叙利亚及罗马尼亚等蚕区，后来日本、印度和中国也有报道。近年来，家蚕微孢子虫病在我国各养蚕区连续暴发，其范围之广已危及到江、浙、川、皖、粤等大部分养蚕区。3分子生物学3.1生化特性[31]人们对微孢子虫的酶和脂类研究较少，Dolgikh等检测到Nosemagrylli的8种酶的活性，从而确定微孢子虫糖代谢途径是Embden-Meyerhof途径(EMP途径)。迄今为止，微孢子虫蛋白的研究日渐增多，最主要的是极丝蛋白(PTPs,PolarTubeProteins)、热休克蛋白(HSP70s,HeatShockProteins)，但是极丝蛋白的研究仅限于Encephalitozoon和glugea2个属的微孢子虫，Encephalitozooncuniculi已经有2种极丝蛋白的全氨基酸序列被报道，其中一个的分子量为[32][33][34]51ku，E.hellem也有一种极丝蛋白的全序列，由431个氨基酸组成，Xiao等对微孢子虫第6页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文E.hellem的极丝蛋白基因进行序列分析，将E.hellem分成1A、1B、1C和2B等4种基因型。E.cuniculi、E.intistinalis、E.hellem及Glugeamericanus(鱼微孢子虫)这四种微孢子虫的极丝蛋白已经通过差速离心和高效液相色谱被提取，它们的分子量分别为45ku、45ku.55ku、43ku，经研究它们为一个蛋白簇，溶解度、亲水性、氨基酸含量和抗原决定簇等特性具有保守性，并且具有相近分子量[35]的极丝蛋白具有相似的抗原性。另外，HSP(70kuHeatShockProtein)也有较多的研究，它是一种伴侣蛋白，是线粒体功能必需的蛋白，不同虫属的HSP结构都是不一样的。3.2基因组微孢子虫独有其他真核生物所不具有的特征，它们缺少线粒体，基因组比其他真核生物的基因组小，脑炎微孢子虫的基因组为真核生物最小的(<2.9Mb)，其中兔脑炎微孢子虫有十一条染色[36]体，基因组为2.9Mb，肠脑炎微孢子虫的基因组最小为2.3Mb。3.2.1rRNA基因微孢子虫是古老的真核生物之一，含有真核生物特有的70S核糖体，具有小亚基16SrRNA和大亚基23SrRAN基因,中间间隔非转录序列，缺少5.8SrRAN，与原核生物核糖体一致，属于[37]原核生物型，这个结论早已经被诸多研究者证实。原核生物的70S核糖体和真核生物的80S核糖体都包含了5SrRAN，微孢子虫的4个属的Nosemabombycis(121nt)、Nosemasp、Vairimorphasp、Pleistophorasp和Encephalitozoon[38][39]species(120nt)等七种微孢子虫的5SrRAN基因长度被报道，大约120nt。Kawakami等构建了N.bombycis5SrRNA的二级结构，它与Wolters等报道的真核生物5SrRNA二级结构的最小模型完全一致，并且Encephalitozoon属3种微孢子虫的5SrRNA的二级结构也与真核生物一致，由此也可以得出微孢子虫的5SrRNA为典型的真核生物型的结论。微孢子虫的SSUrRNA(16SrRNA)研究较多，在Genebank中录入的就多达70多个以上，大约均在1100bp，分别属于20多个属。1987年，Vairimorphanecatrix的SSUrRNA全序列被测定，它比真核生物和原核生物的SSUrRNA基因序列都要短，并且缺乏分子水平上“真核性状”的许多区域，比如原核和真核无相似性的180～225bp和590～650bp的部分，从而证明16SrRNA为原[40]核生物型。SSUrDNA的序列也可以用来鉴别微孢子虫的中间宿主，Vossbrinck等测定了来自[41]2种宿主的微孢子虫Amblyosporaconnecticus的SSUrDNA,发现它们完全相同。SSUrDNA也可用在微孢子虫的分类及种系发育，Nosematrichoplusiae和N.bombycis的SSUrDNA序列完全一[42]致，被认为是同种异名；Baker等对5种感染人体的微孢子虫的SSUrDNA作系统发育分析后认为，Septataintestinlis应归为Encephalitozoonintestinalis，Nosemacornewn相对于Nosema的[43]其它种来说与Endorecticulatusschubergi关系更近，这个结论也被其生活史所证实。微孢子虫23SrDNA全序列的首次测定是在1997年，Biderre等公布了微孢子虫Enc[44]ephalitozooncuniculi23SrDNA的全序列(2487bp)及其拷贝数。Peyretaillade等进一步比较发现E.cuniculi的LSUrRNA相较其它真核生物的对应序列要短,在LSUrRNA二级结构中缺乏许多可变区和保守区的可变环，只保留了所有现存生物LSUrRNA二级结构共有特征，由此推断第7页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文E.cuniculi的LSUrRNA在翻译过程中行使最基本的功能。他构建的包括E.cuniculi在内的19种[45]真核生物的LSUrRNA系统树表明微孢子虫有着较近的起源。3.2.2极丝蛋白(PTP)基因见3.1生化特性3.2.3转录间隔序列(ITS)转录间隔序列(ITS)区内存在不均一性，这种ITS区的不均一性对确定该种微孢子虫的流[46]行病学及微孢子虫与宿主间共同进化具有参考价值。Xiao等对E.cuniculi的ITS进行测序，发现5′-GTTT-3′这个短的重复序列在鼠中重复2次，兔重复3次，犬重复4次，因此根据GTTT的重复次数差异，将E.cuniculi分为Ⅰ型(兔型)、Ⅱ型(鼠型)、Ⅲ型(犬型)。从HIV病人中分离出来的E.cuniculi与犬中分离出来的相同，有4个重复的间隔序列，因此犬可能是人的感染源。另外，不同来源的E.hellem和E.bieneusi的ITS序列也不尽相同。微孢子虫的rRNA在进化中具有高度的保守性，随着分子生物学技术的发展，更多的rRNA基因序列被测定，可对微孢子虫进行分类、鉴定，这比传统的根据生化特征、形态学特征等的分类方法更加的可靠和精确，并且还可以提供遗传进化的信息。4流行病学感染人类的三个微孢子虫种属均是感染昆虫的微孢子虫，由此推测昆虫是微孢子虫的传染源。[47]相反的，感染节肢动物的微孢子虫Brachiolaalgerae(原名Nosema)被证明是人类感染的病原体。脑炎微孢子虫的两个新种E.intestinalis和E.hellem的关系密切，是广泛在哺乳动物寄生最普遍的微孢子虫，E.bieneusi和一种鱼的病原体关系密切。对于所有感染人类和动物的四大微孢子虫(E.bieneusi和三种Encephalitozoonspp)，是具有人畜共患性质的。分子方面的研究已经确定这些物种的表型和遗传变异，证明它们是不统一的。对于E.hellem和E.intestinalis，这种变异的意义仍然在很大程度上是未知的，但是对于E.bieneusi和E.cuniculi这种变异为他们在生物学、起源和分布、人畜共患潜力等提供了新的见解。4.1分布和感染率微孢子虫是一种新发现的机会性病原体，不论是感染人或者动物都呈世界性分布，在欧洲、北美洲等地的发达国家和亚洲、非洲的发展中国家均有报道，包括美国、英国、德国、新西兰、澳大利亚、加拿大、法国、荷兰、瑞典、瑞士、西班牙、意大利、阿根廷、巴西、捷克共和国、斯里兰卡、泰国、乌干达、赞比亚、尼日利亚、印度、日本、中国等。4.1.1人微孢子虫病的分布和感染率[48]人微孢子虫病呈世界性分布，艾滋病的流行来临前，只有8例人类感染微孢子虫的报告。在大多数案例中，病原体的鉴定是没有定论。在1983年，人类鉴定免疫缺陷病毒(HIV)作为艾滋病的病原体时，同时也在腹泻的HIV病人体内检测到微孢子虫属的Enterocytozoonbieneusi。继后，微孢子虫的几个种和属被确认是人类重要的条件性致病菌，几乎感染每一个身体器官和侵染[49]多种类型的细胞。第8页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文人类感染的大多数微孢子虫是E.bieneusi和E.intestinalis。这两个种感染人类的报道在世界[50]各地均有，主要在久泻不止的HIV病人和急性自身限制腹泻的免疫缺陷病人中。HIV血清阳性[51]人群大部分感染的是毕氏肠微孢子虫，地理位置和诊断技术的不同，感染率5-50%不等。除了极少数的病例外，在免疫功能低下的患者中也报道了感染Encephalitozooncuniculi和Encephalitozoonhellem，呈局部(例如，眼)或播散性感染。另外还有极少数的微孢子虫属感染免疫缺陷病人，包括Vittaformacorneae(原名Nosema)、Pleistophoraronneafiei、Trachipleistophoraspp和Brachiolaspp。此外，在极个别的案例中，V.corneae、Trachipleistophorahominis、Brachiolaalgerae、Nosemaocularum、Microsporidiumceylonensis和Microsporidiumafricanum作为感染具有免疫能力人类眼部的病原体也有报道。在发达的国家，由于恢复艾滋病毒感染者免疫力的抗逆转录病毒药物治疗，临床上表现微孢子虫感染的数量有明显的减少。然而，据估计，三分之二的艾滋病病毒感染者生活在撒哈拉以南的非洲地区，由于成本，抗逆转录病毒疗法是没有得到广泛的应用，所以，条件性并发症继续造成严重的发病率和死亡率。一篇研究显示在马里13%的阳性HIV腹泻成年病人是感染了E.bieneusi，E.bieneusi是在非洲国家最流行的肠内寄生虫。另外有报道，瑞典同[52]性恋和混合其他寄生虫感染的人群血清阳性率在0~42%不等。最近，科学家应用综合血清学技术检测HIV血清阴性人群(如屠宰场工人、献血者、林业工人、犬饲养员、和孕妇等)的微孢子虫特[53-54]异性抗体，结果显示血清阳性率在1.3~8.0%不等，这表明没有感染HIV的人群体内也存在微孢子虫。目前已有大量在HIV血清阴性人群中发现微孢子虫的报道，但是缺乏病原检测(血清学检测)的流行学数据。HIV血清阴性人群眼部感染微孢子虫的报道要早于或同步于AIDS大流行的报[55][56]道，HIV血清阴性的其他人群也感染微孢子虫，如旅行者、营养不良的儿童、隐形眼镜佩戴[57]者和老年人。此外，在发达国家进行器官移植的免疫抑制患者也越来越多的确诊感染微孢子虫[58]。4.1.2动物微孢子虫病的分布和感染率动物感染微孢子虫病是1857年首次在家蚕中发现的，被命名为N.bombyciss，暴发于法国，[59]当时给养蚕业带来极大的打击。微孢子虫很早以前主要被认为是引起昆虫(蚕和蜜蜂)，鱼类和哺乳动物(家兔，毛皮动物和实验鼠)等经济类动物重要疾病的原因。微孢子虫几乎能感染所有的动物，包括鸟类、鱼类、昆虫、两栖类、哺乳类(狗、猫、猪、兔子、羊等)。1922年，Wright等首次报道了E.cuniculi感染哺乳动物—兔，在英国和瑞士E.cuniculi在健康兔子的感染率是7.5%和23%，在有神经症状或者和有症状动物接触的兔子中(主要是宠物兔)感染率为85%和71%，法[60-61]国和澳大利亚野生兔子E.cuniculi的感染率为3.9%和25%。此外，啮齿动物也有感染E.cuniculi，虽然少见野生鼠感染微孢子虫的报道，但是有学者认为野生鼠是狐狸和貂感染微孢子[62][63]虫的传染源。1991年，Black等首次在鸟类(鹦鹉)中发现海伦脑炎微孢子虫，1999年，Snowden[64][65]等首次在鸵鸟中发现海伦脑炎微孢子虫。2003年，IrshadM.Sulaiman等对美国东海岸马里兰州的465只野生动物(包括：河狸、狐狸、麝鼠、水獭和浣熊等)进行调查，应用PCR共检出59份阳性样品，经鉴定均为E.Bieneusi，这是E.Bieneusi感染野生动物的首次报道。第9页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文4.2传播方式微孢子虫是一种新发现的机会性病原体，传染源和传播方式的研究还很少。4.2.1垂直和水平传播肉食动物中已经报道了E.cuniculi的胎盘传播，特别蓝狐和家犬，偶尔也见与非人灵长类动[66-67]物、马、兔子和啮齿动物，但在人类尚未见报道。哺乳动物经消化道摄入或呼吸道吸入微孢[68]子虫孢子之后感染微孢子虫病，在微孢子虫病的传播也有可能是外伤或直接接触传染给人类。这表明微孢子虫可通过口-口传播，粪-口传播，食被污染的食物、水源和吸入被污染的颗粒等方式进行水平传播。此外，据报道，微孢子虫病也通过同性恋、静脉注射药物、接触公共游泳池等方式进行传播，由此，表明微孢子虫病可以通过水平传播。实验室动物经过腹膜、静脉、直肠、[69]气管或大脑接种等方式感染了微孢子虫病，也间接表明微孢子虫的水平传播。4.2.2人畜间的传播[70]Friedberg等报道了3位病人通过接触宠物而感染微孢子虫角膜病由此可直接证明微孢子虫在人畜之间传播。感染动物的微孢子虫在人类体内被发现，也可以证明微孢子虫在人畜之间传播。4.2.3水源、食物传播微孢子虫对外界抵抗力较强，可以在水中长期存活，且体积小难以通过过滤去除，因此利于水源传播。现已在地下、河湖，壕沟等水中发现许多可感染人的微孢子虫。美国环境保护机构已将肠脑炎微孢子虫和毕氏肠微孢子虫列为两个最常见的感染人的微孢子虫，并将其列入安全饮用水条例中的微生物候选污染物目录。另外，国家健康研究所和疾病控制中心将微孢子虫作为水源传播的B类优先病原体。随着食品的全球化、转运加速、消费者旅游次数增加和消费模式转变，微孢子虫已经被确认[71]可以通过食物传染。经过流行病学调查，Buckholt在美国曼彻斯特屠宰场的一头牛体内发现了毕氏肠微孢子虫，而患微孢子虫病的HIV病人每月至少生吃一次牛肉。在农作物灌溉用水中检测[72]到肠脑炎微孢子虫的案例也证明了了微孢子虫病可经食物传播。4.2.4媒介传播[73]据Weidner报道，蚊子(四斑按蚊和库蚊属)感染T.hominis后，在蚊子的前胃和盲肠中检测到T.hominis孢子，蚊子吸血时能将孢子传播给哺乳动物，这证明了微孢子虫病可通过媒介传播。蜜蜂、黄蜂或大黄蜂叮咬也导致HIV患者感染微孢子虫病，这再次验证了微孢子虫病经媒传播。5诊断、预防及治疗5.1诊断微孢子虫的检测技术现已取得相当大的进展。此前，因为病原体个体小，诊断主要是根据电子显微镜、染色技术、光显微镜检测微孢子虫的孢子，这几种方法至少鉴定在属的水平。在种的水平的鉴定是通过使用抗体(多克隆或单克隆)，和依据PCR通过分子生物学的方法。后者的敏感性和特异性较高，此外，还可以经进一步分析PCR产物可通过各种方法(限制性片段可以实现长度多态性，SSCP，测序)鉴定到株或基因型的亚种水平。第10页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文血清学试验已经应用在检测几种动物的E.cuniculi的抗体，但对脑炎属检测抗体的价值在人[74]类中是有争议的，因为孢子壁作为抗原使用的测试可能是非特异性的。近来，重组E.cuniculi[75]的极管抗原被证明是具有很高特异性的，适当的发展血清学诊断工具的是可行的。目前没有用于E.bieneusi的血清学诊断。[76]多数感染人类的微孢子可以连续地在各种细胞系中体外培养。这有利于他们的基本生物[77][78]学调查，也可以方便地评估药物效果或检测消毒计划，因为人类的致病性微孢子虫已发现的[79-80]地表水中，所以快速、准确的检测方法已经成为一个问题。5.2预防和治疗由于微孢子虫病经水和食物传播，因此加强水源和食物的管理是必要的，特别是艾滋病人和接受器官移植感染微孢子虫的人群，建议喝开水、勤洗手；使用煮熟的海鲜、肉类和海产品；尽量避免生吃的瓜果蔬菜，远离传染源，例如动物等。对于环境消毒可使用甲醛(0.3或1%)、70%乙醇、酚的衍生物、氯胺、1%过氧化氢、氢氧化钠、季铵盐、两性表面活性剂等，通过沉淀、凝集和混合介质过滤等方法可降低微孢子虫在水中的存活率和感染力。紫外线照射、臭氧处理、加氯消毒和γ射线照射等方法也可有效的降低脑炎[81][82]微孢子虫属的活力和感染力。目前，治疗微孢子虫病尚无特效药物，阿苯达唑常被用来治疗微孢子虫病，它主要作用于发育阶段的虫体，抑制其传播，但此药对毕氏微孢子虫引起的疾病治疗效果不佳，目前上没有对毕氏微孢子虫特效的药物。烟曲霉素盐类对E.intestinalis和E.hellem有显著抑制作用，但对人体有较强的毒副作用，是全身出现中毒症状，其衍生物TNP2470毒副作用较小，对E.intestinalis和V.corneae也有一定作用,是有前景的抗微孢子虫病药物。目前，应用抗逆转录病毒疗法治疗艾滋病可增加CD4+T细胞水平，从而降低微孢子虫等机会性感染。最近一个研究表明抑制HIV病[83]毒的天冬氨酰蛋白酶抑制物也能抑制组织培养的肠脑炎微孢子虫的生长。6小结自艾滋病爆发以来，微孢子虫作为机会性病原，危害社会的公共卫生及人类的生命安全，因此，需要对微孢子虫病的病原特性及其传染源，传播机制、流行特点做出研究，以提高和改善微孢子虫病的检测方法，为期建立有效的预防措施和研究开发更为特效的药物。第11页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文第二章毕氏微孢子虫病的流行与传播在Enterocytozoonidae家族中有两个种属：(1)Nucleospora，寄生于鲑科鱼类细胞核内的微孢[84]子虫属（N.salmonis）和寄生于非洲温暖性海洋鱼的寄生虫（N.secunda）。(2)Enterocytozoon，寄生在人类和哺乳动物的肠细胞和其他上皮细胞的细胞质。E.bieneusi，众所周知能引起人类疾病最常见的微孢子虫，是第一次被描述的关于HIV病毒相关机会性肠道病原体，在1985年用电子显微镜观察到其形态特征。在1996年，相同形态的孢子被[85]检测在猪粪便样品中，接着他们也被检测出在其他哺乳动物的粪便样品中。1对人类的感染来自世界各地的报道指出，将几百个感染HIV病人长期腹泻的原因归咎于这种病原体。E.bieneusi在感染HIV的病人中的感染率达到50%。在所有有人居住的大陆，人类的感染是有据可查[86-87]的。在大多数的研究中，慢性腹泻患者患病率显著较高。在以前的流行病学调查中，因为患者类型、患者特征(年龄、性别、社会人口统计数据、免疫力的程度、临床特征)和调查样本(活组织、粪便样品)的选择有相当大的差异，所以不允许进行比较分析的。此外，也必须考虑检测所应用的方法。[88]来自发达国家的一些研究表明，E.bieneusi在感染艾滋病毒患者的患病率逐渐减少。最近一些研究显示使用抗逆转录病毒联合疗法可以缓解艾滋病毒相关的肠道微孢子虫。在瑞士50％E.bieneusi案例的减少也可解释为与抗逆转录病毒治疗有关。尽管大部分微孢子虫病发生在的感染HIV患上免疫缺陷病的成年人中，但是，E.bieneusi感染也被报道在免疫功能低下或者因接受器官移植时的免疫抑制治疗的HIV阴性病人中。此外，也有少数几个E.bieneusi感染免疫功能正常的HIV阴性人和健康人造成自限性腹泻的相关报道，这[89-90][91]大多在欧洲腹泻旅行者中，而且在非洲也有个例。通过PCR检测来自返回德国腹泻旅行[97]者的粪便样品，在148份中有7份检测到E.bieneusi。在西班牙进行的一项的研究显示，47例[96](17％)中8例老年腹泻患者感染E.bieneusi，有人推测，年龄相对大、免疫能力降低的老年人易[92]感染微孢子虫。另一方面，到目前为止没有数据表明，孩子可能更容易受到E.bieneusi的感染。在后来，证据证明E.bieneusi也可以以无临床症状的形式存留在具有免疫活性的人中。来自非洲没有感染HIV孩子的990粪便份样品中有8份检测到E.bieneusi，这就表明在热带国家E.bieneusi存在于具有免疫活性的人群中。在来自非洲和亚洲的一些研究中，也有报道儿童的无症状感染，其中感染的不仅仅有健康的孤儿(5.9％)还有儿童保健工作者(1.9％)。在这些研究中，确诊阳性病例的方法是光学显微镜、部分结合透射电子显微镜，但是这些没有足够的敏感性，很有可能存在漏检情况。因此，更多的检测手段例如PCR是必须的，同时阐明微孢子虫是否是一种常见的人体肠道寄生虫，对只有免疫缺陷病人才导致严重的疾病，或者是否具有人畜共患性是相当重要的。2对动物的感染作为人类微孢子虫病的病原体，E.bieneusi是也在动物中检测到。从位于瑞士不同地区的22第12页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文个农场中随机选择109头的猪，在随后的调查中通过PCR检测，患病率为35％，在断奶仔猪中E.bieneusi的感染率较高(P<0.05)。通过每周一次的PCR检测，三个没有临床症状的猪的粪便样品被检测为阳性，揭示67％被调查的猪排泄E.bieneusi的孢子。因此，E.bieneusi似乎是无临床症状的猪中的一种常见寄生虫。感染人类或猕猴的E.bieneusi被分别接种到具有免疫抑制和免疫活性的定菌小猪，而这些小猪缺乏肠道病变，因此，E.bieneusi对于猪的低致病力是更进一步被证实。然而，在这个研究中也有免疫抑制的小猪对E.bieneusi孢子的排泄增加。随后的研究已经[93-94]证实了E.bieneusi在猪中有很高的感染率(32%)，在犊牛中也为(9.5至11.5％)。在猫、狗、山羊、骆马、各种野生的哺乳动物(海狸，狐狸，麝鼠，水獭和浣熊)、刺猬、非哺乳动物宿主(鸡和鸽子)也检测到E.bieneusi。猕猴也有E.bieneusi自然感染的记录，在正常无症状的猴子中感染率是16.7％，持续感染262[95]天，其中在人工感染猴免疫缺陷病毒的猴子中感染率是33.8％。通过镜检和PCR筛选来自中[96]非的42只野生猴子没有产生一个单一的E.bieneusi的阳性结果。3动物模型为了研究E.bieneusi的诊断方法、药物筛选、疾病的发展机理等，需要其大量的繁殖，因此需要建立一个微孢子虫的动物模型。感染人类的E.bieneusi被接种在免疫功能不全的恒河猴、免疫抑制的无菌小猪、斯普拉-道来氏大鼠、新西兰兔子中，在所有实验动物中，仅仅慢性无症状感染，具有免疫抑制的猪是和自然感染相似的。在免疫活性和免疫缺陷的鼠体内培养E.bieneusi是不成功的。因此，至今建立的实验动物模型中并没有足以模拟感染艾滋病毒患者的肠道病理情况。4分子流行病学分析单个的rRNA内部转录间隔区(ITS)显示从人类和动物中分离的E.bieneusi分离株有相当多的基因变异，迄今为止有多于50个基因型被描述基于在243bp序列的细微差别。与此相反的情况，脑炎微孢子虫属没有可用的遗传标记。然而，E.cuniculi和E.hellem分离株基于ITS序列分类大部分是由其他的遗传基因座数据确定的。不过，为了阐明寄生虫群体的遗传结构，E.bieneusi的额外独立标记是非常值得的。感染人类E.bieneusi不同的ITS基因型被确定在独立的研究中，另外的12份被发现在个体[97]的研究中，其中有一份研究对8个新基因型做了阐述说明。这些信息对E.bieneusi人源性基因型的地理分布是有用的。在一个南美洲研究中确定的8个基因型其余所有的基因型在欧洲被发现，那里针对这种寄生虫基因分型的研究已经进行了。另外，基因型A、B、D、Ⅳ曾近被检测到在南美洲和美国的HIV病人中。在来自亚洲和非洲的单个研究中基因型A被发现在泰国无症状的孩子中，基因型Ⅳ在乌干达腹泻的孩子中被发现。到目前为止，所有经鉴定感染人类的E.bieneusi的17个基因型，有四个是人畜共患的，因为他们被发现在脊椎动物中。从人类分离株中检测到基因型A、B、C，且没有动物感染这三种基因型，人们有一个推测，它们宿主的确定可能是一个简单的时间问题。另外一方面，一些证据表明，至少对某些E.bieneusi基因型是有一定程度宿主特异性的，首先，一个系统树图依靠人类感第13页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文染E.bieneusi基因型的ITS序列，根据宿主种类选定动物宿主的基因型揭示基因型聚类，尽管这个分组不是绝对的。有趣的是，在最近一个单一的艾滋病患者研究中发现的8个新E.bieneusi基[105]因型集群内的分支，其中包含所有其他人源性基因型。进一步的证据证明一定程度的宿主专一性来源于使用免疫缺陷或免疫抑制的实验动物模型中。人源性的E.bieneus，仅仅是没有适当的模仿感染艾滋病毒患者肠道病理情况，慢性无症状的感染被观察在猕猴、鼠、小猪、兔子中，来源于人的E.bieneusi感染免疫缺陷小鼠的许多尝试是[98]不成功的。总之，E.bieneus人畜共患性是令人联想起另外一些肠道寄生虫，例如贾第虫，它也包括人畜共患及不人畜共患的基因型。5传染源和传播途径广泛的肠道和几个呼吸道症状的患者传播E.bieneusi的报道表明，不同的传播模式是可能的，包括粪-口或口-口途径、吸入气溶胶或摄入粪便污染的食物。另外，通过因男性同性恋或于[99--100]感染艾滋病毒的人同居等风险因素感染肠道微孢子虫的研究中，证实了直接人-人传播。人-人传播也被提出在一个研究中，这个研究中显示13分之9的HIV阴性孤儿，被限制在两套房子，[107]而艾滋病毒呈阳性的儿童居住在另一栋房子没有被感染。在免疫活性的人检测到E.bieneusi表明，这种寄生虫或者至少他们的一些基因型，是自然持续存在于自然种群的。器官移植接受者、免疫功能低下的HIV阴性患者和具有免疫功能的人感染可能跟直接接触艾滋病患者无关。在巴西，对人感染E.bieneusi的流行病学调查中明显是没有季节波动性，并且发现隐孢子虫的感染。尽管不同的气候和社会人口等因素，相似的结果出现在一篇调查了4年的加利福尼亚南部感染HIV病人的研究中。在这两篇的研究中认为污染的饮用水不大可能是微孢子虫感染的主要传染源。然而，另外一些研究者认为对于微孢子虫，水的接触是独立的风险因素。在一个包括30例感染肠道微孢子虫的HIV病人(28例E.Bieneusi感染和2例E.Intestinalis感染)和56例HIV感染患者的前瞻性病例对照研究中，在过去12个月内“游泳池游泳”被认定为感染微孢子虫的三个危险因素之一，其他因素，例如食用不同种类的饮料或未煮熟的食物，接触动物(猫、狗、鸟、蜜蜂、鱼)，或者其他活动(在淡水河里或海里游泳、在过去36个月在国外远行，参观乡下)被发现和感染风险没有关联。在美国进行的一项研究是12个感染肠道微孢子艾滋病毒患者和54CD4匹配的对照。感染微孢子虫的风险因素是和不同种类水的接触(在河里或者湖里游泳、喝未过滤的自来水或[107]者用加湿器)和近距离接触HIV感染的病人。最后，一篇调查一个城市的HIV感染病人显示微孢子虫的感染和职业、水有关、用一个热水浴缸或者SPA都是感染肠道微孢子虫的危险因素，然而，接触宠物是没有感染风险的。在一篇艾滋病毒患者和未感染艾滋病毒的旅客感染E.bieneusi的研究中阐述了旅行和感染风险的关系。对于来自巴黎的腹泻HIV病人比较研究中，包括26个感染肠道微孢子虫的病人(没有定种)和28个隐孢子虫病人，显示前往热带国家与微孢子虫感染密切相关。在HIV阴性的成人和第14页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文孩子被发现感染E.bieneusi的热带国家，特定因素是否和微孢子虫的传播有关联还是不明确的。通过PCR技术和部分ssrRNA基因的序列分析在地表水中检测到E.Bieneusi和确认亚基因型，最近，通过特异性PCR，也在来自河流有斑纹的贻贝中检测到E.Bieneusi。地表的水污染也可能来自排泄的生活废水或者来自动物。由于在这些研究中没有进行基因分型的研究，这些传染源对人类的潜在感染风险需要进一步澄清。5展望根据E.Bieneusi不同分离株间ITS基因序列的差别，将近100个基因型已报道和描述。人和动物都感染有相同的基因型，因此推测一部分毕氏肠微孢子虫具有人兽共患风险。然而，动物在人微孢子虫病传播中所起的作用还需进一步研究。毕氏肠微孢子虫基因型与疾病之间的关系、免疫学特性、生化特性和生理学特性知之甚少，没有有效的治疗方法和疫苗。它们的生物学及其与宿主间的关系仍处初步研究阶段，因此，需要更多的研究来了解毕氏微孢子虫，从而更好的预防，治疗此病。第15页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文第二部分研究内容第一章河南省猪肠道寄生虫感染情况调查1引言河南省是畜牧大省，养猪业尤为发达，现在生猪饲养量达9930.2万头，居全国第二位。近年来，畜牧业产值及生产各项指标均居国内前列，全省新建万头以上生猪养殖场151个，总数超过600个。猪寄生虫病是危害养猪业的主要疾病之一，严重影响猪繁殖性能和生长发育，延后出栏时间，降低肉料比，据报道猪寄生虫病可造成饲料转化率降低5%左右，每头育肥猪多耗料17.1～17.8kg，育肥猪推迟出栏5～10d。此外,寄生虫病还影响猪肉的品质，甚至导致猪发病、死亡，[101]造成重大经济损失，危害人类健康，严重制约养猪业的发展，为了解我省猪的肠道寄生虫感染情况(寄生虫种类、感染率、感染强度等)，有效的为防治寄生虫病提供科学依据，作者于2013年5月～2013年月9月对郑州金水区、辉县、中牟、信阳罗山、原阳、西华、漯河召陵区、四川北川等地的猪进行寄生虫感染情况的调查。2材料与方法2.1样品采集2013年5月～2013年月9月对郑州金水区、辉县、中牟、信阳罗山、原阳、西华、漯河召陵区、四川北川等地不同饲养方式不同年龄段的猪群以5%的比例进行随机抽检462份，同时记录猪龄、体况、粪便情况及猪场名称、地理位置、zhikuquan20150807饲养条件、免疫程序等，每头猪20～30g粪便，置于干净塑料袋中，编号，带回实验室4℃冰箱保存待检。2.2主要仪器与耗材TDL-5-A低速自动平衡离心机、CX21-Olympus光学显微镜、数码相机、电子称、冰箱、天平、50mL/100mL离心管、试管架、玻璃漏斗、铁架台、玻璃棒、载玻片、60目铜筛、烧杯、盖玻片、改良McMaster's计数板、计数器、吸管、纱布等。2.3主要试剂及制备2.3.1饱和食盐水的制备：蒸馏水1000mL食用盐360g加热溶解后，冷却装瓶待用。2.3.2卢戈氏碘液的制备：蒸馏水100mL碘2g碘化钾4g2.3.3饱和蔗糖溶液的制备：蒸馏水320mL蔗糖500g比重约为1.28，加热溶解后，冷却装瓶待用。2.3.42.5%重铬酸钾溶液的制备：蒸馏水100mL第16页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文重铬酸钾2.5g2.2主要方法2.3.1离心沉淀法：操作步骤：(1)取10g新鲜粪便加入50mL自来水，浸泡10min后充分搅拌；(2)将混合粪液用60目铜筛过滤到50mL离心管中；-1(3)3000r·min离心5min，弃去上清液；(4)用玻璃棒蘸取少许沉淀，均匀涂抹于载玻片上；盖上盖玻片，于400倍光镜下检查。2.3.2卢戈氏碘液染色法：操作步骤：滴1-2滴卢戈氏碘液于载玻片上，用玻璃棒蘸取经离心沉淀后的样品少许，涂抹于载玻片上，使其与碘液混合均匀，盖上盖玻片，于400倍光镜下检查。2.3.3饱和蔗糖溶液漂浮法：操作步骤：(1)经离心沉淀法得到的取10g新鲜粪便加入50mL自来水，浸泡5min后充分搅拌；(2)将混合粪液用60目铜筛过滤到50mL离心管中；-1(3)3000r·min离心5min，弃去上清液；-1(4)向沉淀中加入30mL饱和蔗糖溶液，充分搅匀，3000r·min离心8min；(5)用自制铁丝圈蘸取漂浮液表层置于载玻zhikuquan片上；盖上盖玻片，于20150807400倍光镜下检查。2.3.4麦克马斯计数法：操作步骤：称取新鲜粪便2g放于烧杯中，加入饱和食盐水58mL，用玻璃棒捣碎，充分振荡混合后用60目铜筛过滤，将滤液边摇晃边用吸管吸出少许，滴入虫卵计数板的计数室内，置于显微镜载物台上，静置几分钟后，用低倍镜将2个计数室内观察到的虫卵计数，计算两计数室内虫卵数的平均值，再乘以200，即为每克粪便中的虫卵数。2.4形态鉴定[102]光学显微镜下检查，依据虫体的形态结构特征，参考有关文献进行鉴定。3结果与分析3.1猪肠道寄生虫总体感染情况本次调查共检测了来自河南的郑州金水区、辉县、中牟、信阳罗山、原阳、西华、漯河召陵区、四川北川等8个地方的462份样品，检测出阳性样品数285份，总感染率达到61.69%。共查到8种肠道寄生虫，为：隐孢子虫、贾第虫、鞭虫、球虫、纤毛虫、蛔虫、圆线虫、阿米巴(见图1-1至图1-7)。其中，阿米巴、球虫感染率为最高分别达到44.81%和25.54%，其余6种感染率较低，均不超过过10%，对球虫感染强度的测定最大为4600，最小为<200、圆线虫感染强度最大为600，最小为<200(各种寄生虫感染情况见表1-1)。第17页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图1-1球虫卵囊(400×)图1-2隐孢子虫卵囊(400×)Fig1-1Coccidiumoocysts(400×)Fig1-2Cryptosporidiumoocysts(400×)zhikuquan20150807图1-3贾第虫包囊(400×)图1-4阿米巴原虫包囊(400×)Fig1-3Giardiacyst(400×)Fig1-4Entamoebacyst(400×)图1-5蛔虫虫卵(400×)图1-6圆线虫卵(400×)Fig1-5Roundwormsegg(400×)Fig1-6Strongyloidesegg(400×)第18页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图1-7鞭虫卵(400×)Fig1-7Trichocephalusegg(400×)表1-1猪肠道各种寄生虫感染情况表Table1-1Theinfectionsituationofintestinalparastitesinpig粪便样品不同种寄生虫检查结果及感染率(%)统计项总计隐孢子目贾第虫球虫鞭虫圆线虫纤毛虫蛔虫阿米巴虫阳性数/285/4628/4624/462118/46233/46230/4629/4624/462207/462样品数感染61.691.730.8725.547.146.491.950.8744.81率%感染强——未计数未计数<200-4600未计数<200-600未计数未计数未计数度3.2不同地区猪肠道寄生虫感染情况本次调查主要针对河南省的县级地区，中牟78份、信阳罗山62份、新乡辉县97份、原阳34份、周口西华106、郑州金水区48份、漯河召陵区16份等7个地方的441份样品及四川北川21份，共计462份样品，因漯河样本量较少不参与此次比较，7个地方寄生虫感染率最高的周口西华(92.45%)，其次为新乡辉县(74.23%)、四川北川(66.67%)、中牟(50.00%)，其余信阳罗山、郑州金水区、原阳的感染率均不超过50.00%；隐孢子虫和贾第虫在中牟、信阳罗山、辉县有感染，感染率均不高，小于10%；仅西华见蛔虫的感染，感染率为3.77%；纤毛虫在北川(38.10%)和西华有感染，且西华仅发现一例；西华的鞭虫感染率最高，达到16.98%，其余均低于10%，圆线虫感染率在1.61%到19.59%不等。球虫和阿米巴的感染率在各地的感染率较高，漯河召陵区16份样品感染鞭虫、圆线虫、阿米巴(不同地区猪肠道寄生虫感染情况见表1-2)。在各地球虫、圆线虫的强度测定中，圆线虫的感染强度大多小于200，最高600；西华球虫的感染强度最大为4600(不第19页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文同年龄猪肠道寄生虫感染强度情况见表1-3)。表1-2不同地区猪肠道寄生虫感染情况Table1-2Theinfectionratesofintestinalparastitesinpigofdifferentareas样阳感粪便样品不同种寄生虫检查结果及感染率(%)地域本性染隐孢子分布贾第虫球虫鞭虫圆线虫纤毛虫蛔虫阿米巴数数率%虫中牟783950.005(6.41)2(2.56)10(12.82)3(3.85.)2(2.56)0(0)0(0)29(37.18)罗山622438.712(3.23)1(1.61)9(14.52)3(4.84)1(1.61)0(0)0(0)16(25.81)北川211466.670(0)0(0)13(61.90)0(0)0(0)8(38.10)0(0)11(52.38)辉县977274.231(1.03)1(1.03)6(6.19)0(0)19(19.59)0(0)0(0)62(63.92)金水区48816.670(0)0(0)2(4.17)4(8.33)2(4.17)0(0)0(0)3(6.25)原阳341647.060(0)0(0)3(8.82)0(0)0(0)0(0)0(0)15(44.12)西华1069892.450(0)0(0)75(70.75)18(16.98)4(3.771)1(0.94)4(3.77)59(55.66)召陵区1614——0(0)0(0)0(0)5(31.25)2(12.5)0(0)0(0)12(75)总计46228584118333094207感染率61.691.730.8725.547.146.491.950.8744.81表1-3不同地区猪肠道寄生虫感染强度情况Table1-3Theinfectionintensityofintestinalparastitesinpigofdifferentareas不同地区及感染强度(EPG)虫种中牟罗山北川辉县金水区原阳西华漯河球虫<200-1000<200-2400<200-2000<200-600无<200-1000<200-4600无圆线虫<200<200无<200-200无无<200-200<200-6003.3不同年龄猪肠道寄生虫感染情况因中牟样品的年龄不详，没参与比较，其余共384份样品，分5个年龄阶段，乳猪(断奶前仔猪)、保育猪(1~2月龄)、育肥猪(3~6月龄)、母猪、种公猪，乳猪在所有年龄阶段中感染的虫种最少、感染率最低为29.03%，母猪感染率最高为69.01%，其次为保育猪(67.90%)、种公猪(66.67)、育肥猪(64.81)；隐孢子虫只感染了保育猪和母猪，切感染率较低；贾第虫只有保育猪感染2例；球虫在保育猪中感染率略高达到37.65%，依次是育肥猪、母猪、种公猪；鞭虫在保育猪中的感染率为10.49%，乳猪无感染，其余感染率均不超过10%；圆线虫在母猪中感染率略高11.27%；其余年龄阶段均不超过10%；纤毛虫只在育肥猪阶段零星感染，母猪感染率较高；蛔虫在保育猪中第20页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文感染4例；阿米巴对母猪感染率最高为59.16%，乳猪最低，其余从43.21%~50.00%不等(不同年龄猪肠道寄生虫感染情况见表1-4)。球虫对保育猪、育肥猪、母猪有较高的感染强度；圆线虫对各个年龄的猪感染强度都小(不同年龄猪肠道寄生虫感染强度见表1-5)。表1-4不同年龄猪肠道寄生虫感染情况Table1-4Theinfectionintensityofintestinalparastitesinpigofdifferentages样阳粪便样品不同种寄生虫检查结果及感染率(%)感染年龄本性隐孢子率%贾第虫球虫鞭虫圆线虫纤毛虫蛔虫阿米巴数数虫乳猪31929.030(0)0(0)4(12.90)0(0)1(3.23)0(0)0(0)7(22.58)保育猪16211067.902(1.23)2(1.23)61(37.65)17(10.49)10(6.17)0(0)4(2.47)70(43.21)育肥猪1087064.810(0)0(0)31(28.70)10(9.26)8(7.41)1(0.93)0(0)53(49.07)母猪714969.011(1.41)0(0)11(15.49)2(2.82)8(11.27)8(11.27)0(0)42(59.15)公猪12866.670(0)0(0)1(8.33)1(8.33)1(8.33)0(0)0(0)6(50.00)总计38424632108302894178感染率64.060.780.5228.127.817.292.341.0446.35表1-5不同年龄猪肠道寄生虫感染强度Table1-5Theinfectionintensityofintestinalparastitesinpigofdifferentages年龄阶段及感染强度虫种乳猪保育猪育肥猪母猪种公猪球虫<200-1000<200-2400<200-4600<200-3600<200圆线虫<200<200-600<200-600<200-200<2003.4不同饲养方式猪肠道寄生虫感染情况本次调查中规模化养殖的寄生虫总体感染率最低为41.67%，小专业户和散养户依次升高为53.36%和88.11%；隐孢子虫和贾第虫在规模化和小专业户养殖模式中见到感染率较低不超过3%；纤毛虫和蛔虫仅见于散养户的模式感染率为6.92%和2.8%；球虫、鞭虫、阿米巴均在散养模式中感染率最高，依次为61.54%、16.08%和57.34%。阿米巴在三种饲养模式中感染率都较高(不同饲养方式猪肠道寄生虫感染情况见表1-6)。在散养模式中球虫感染强度最小为<200，最大为4600，在小专业户的感染强度最大的为1000，在规模化的感染强度为2400；圆线虫的感染强度最大的是在散养模式中为600(不同饲养方式猪肠道寄生虫感染强度见表1-7)。4结论与讨论4.1猪肠道寄生虫感染情况第21页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文[103]根据韩战强等于2011对河南省朱肠道寄生虫感染情况的调查显示，猪感染的肠道寄生虫表1-6不同饲养方式猪肠道寄生虫感染情况Table1-6TheinfectionratesofintestinalparastitesinpigofdifferentBreedingways粪便样品不同种寄生虫检查结果及感染率(%)饲养样本阳性感染方式数数率%隐孢子虫贾第虫球虫鞭虫圆线虫纤毛虫蛔虫阿米巴A964041.672(2.08)1(1.04)12(12.50)3(3.23)1(1.04)0(0)0(0)31(32.29)B22311953.366(2.69)3(1.34)18(8.07)7(3.14)23(10.31)0(0)0(0)94(42.15)C14312688.110(0)0(0)88(61.54)23(16.08)6(4.20)9(6.29)4(2.80)82(57.34)总计46228584118333094207感染率%61.691.730.8725.547.146.491.950.8744.81注：A为规模化猪场；B为小专业户；C为散养户。表1-7不同饲养方式猪肠道寄生虫感染强度Table1-7TheinfectionintensityofintestinalparastitesinpigofdifferentBreedingways饲养方式及感染强度虫种规模化小专业户散养球虫<200-2400<200-1000<200-4600圆线虫<200<200-200<200-600为毛首线虫、蛔虫、类圆线虫、小袋纤毛虫、球虫、隐孢子虫，寄生虫的总体感染率为40.08%，球虫感染率最高，为34.79%；相比较，本次调查猪的肠道寄生虫感染率明显较高为61.69%，且感染的寄生虫种类多了贾第虫、鞭虫、阿米巴，本次调查未发现毛首线虫，感染率最高的为阿米巴44.81%，球虫次之为25.54%，其余的虫种感染率均低于10%，本次调查，寄生虫感染率高于以往调查，虫种多于以往调查，但是球虫、隐孢子虫、蛔虫、小袋纤毛虫、类圆线虫的感染率远远低于以往，说明本次调查猪的寄生虫感染情况比较普遍，但是感染强度均不高，可能是猪感染寄生虫却没有呈现临床症状，调查中发现，除了规模化的养殖厂有固定的驱虫程序外，小专业户也有较完善的固定消毒、驱虫程序，且相当注重畜舍的卫生，这也可能是导致本次调查主要致病虫种感染率低的原因。本次调查的8个地区感染率最高的是周口西华为92.75%，其次是辉县、北川、其余几个地方的感染率在50%~16.67%不等，说明西华等地应该加强预防工作。本次调查的猪五个年龄段中保育猪感染率最高，但是隐孢子虫、贾第虫、球虫、鞭虫、阿米巴感染率最高，说明这个年龄段的猪易感染，其次是母猪、公猪、育肥猪，乳猪感染虫种最少、感染率最低，跟这个阶段的猪吃母乳，畜舍环境有关，球虫在猪的各个年龄段都感染较严重，说明球虫仍是猪感染最常见的寄生虫类，这跟韩战强等的调查结果一致。第22页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文本次调查的三种饲养模式散养户的寄生虫感染率最高，其次是小专业户、规模化猪场这跟韩战强等的调查结果一致，规模化猪场感染隐孢子虫、贾第虫、鞭虫、圆线虫、阿米巴，阿米巴感[104]染率最高其次为球虫，其余均较低，比较仇书兴等对规模化猪场调查的结果均低，说明现在的规模化猪场管理、驱虫程序更加的完善；小专业户的感染率略高于规模化猪场，远远低于散养户，从本次调查比较结果看做好卫生、防疫对寄生虫的感染有直接影响，散养的养殖户要加强猪舍卫生等的管理，预防寄生虫的意识。4.2类圆线虫和鞭虫感染较普遍此次调查类圆线虫和鞭虫感染也较普遍，感染率6.49%为和7.14%。对数据进行分析发现感染率的高低与生长阶段相关，类圆线虫感染率较高的是母猪，种公猪和乳猪感染率很低，这于仇书兴等调查的结果不同。鞭虫病引起感染猪持续性腹泻、消瘦、便血、贫血，因此，鞭虫对猪也[105]是一种较为重要的肠道病原。本次调查鞭虫自散养户中感染率较高，说明鞭虫在卫生条件较差的地方易感染和传播。目前治疗鞭虫病的有效药物较少，所以对鞭虫病要采取综合防制措施加以预防。4.3球虫是猪场最常见寄生虫种类感染猪的球虫种类有艾美耳球虫(E.scabra、E.imeriapolita、E.suis、E.debliecki、E.spinosa和E.neodebliecki)、猪等孢球虫(Isosporasuis)。艾美耳球虫可引起乳猪和断奶后仔猪发热、食欲下降、腹泻、体重降低等症状，猪等孢球虫是引起猪球虫病的主要病原,且常为原发性，发生于[106]产房内的哺乳期或新断奶的仔猪。在全世界，其发生率大约占仔猪腹泻性疾病中的15%～20%。[107]据调查表明欧洲国家的猪场83%～100%有I.1suis感染。国内，刘伟等报道湖南省生猪寄生虫感染率以球虫最高，本次调查发现球虫在不同生长阶段均存在不同程度的感染，平均感染率达[108]25.54%，比刘伟报道的29.15%(101/295)略低。球虫感染率较高，具有普遍性的原因主要是球虫生活史简单，不需要中间宿主，卵囊排到外[109]界后很快具有感染性，且极少量残存卵囊即足以导致连续感染。此外，在散养户中卫生条件较差容易引起球虫感染。拥挤、突然改变饲料等因素也是球虫感染的重要诱因。4.4人兽共患的结肠小袋纤毛虫、贾第虫和隐孢子虫的感染本次调查发现有猪结肠小袋纤毛虫，贾第虫、隐孢子虫的感染。据调查近年来随着结肠小袋纤毛虫抗药性增强，结肠小袋纤毛虫病已经有流行的趋势。该病治疗效果不佳，尤其不易净化，[110]应严防猪场被污染。更重要的是结肠小袋纤毛虫是人兽共患性机会性原虫，可引起人的消化道[111]症状，并且已有报道人的盆腔、泌尿系统、和鼻腔感染结肠小袋虫。隐孢子虫可能是导致免疫抑制病人腹泻的重要病原之一，在艾滋病病人和儿童中的感染率可分别高达48%和17%，特别对艾滋病病人或免疫功能低下者，导致严重的水样腹泻甚至危及生命，也能使免疫功能正常者出[112]现急性自限性腹泻。贾第虫主要引起人类长期腹泻。虽然此次调查纤毛虫，贾第虫、隐孢子虫的感染率都不高，但是它们是人畜共患病的病原，危害人类健康不容忽视。第23页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文第二章河南省猪毕氏微孢子虫感染情况及系统进化分析1引言微孢子虫是一类广泛分布于自然界的专性细胞内寄生的真核原生动物，能感染多种宿主，包括无脊椎动物和脊椎动物，是一类人兽共患性疾病病原。它包括1400多种，分别被划入150多个属中，其中至少8个属13种微孢子虫能感染人，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)，脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon)中的兔脑炎微孢子虫(E.cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)和海伦脑炎微孢子虫(E.hellem)4个虫种主要感染人。其中，E.bieneusi是引起人类疾病最常见的微孢子虫，它被认为是分布广泛的具有基因多样性的肠道寄生虫，是第一次被雪人为关于HIV病毒相关的机会性肠道病原体。Desportes等于1985年在电子显微镜下观察到其形态特并命名了正式的属与种，后来将它置于Enterocytozoonidae家族。近来，E.bieneusi开始陆续在人、家畜及野生动物中发现。在1996年E.bieneusi首次被检测在猪粪便样品中，后陆续在瑞士、德国的猪粪便样品中检测到E.bieneusi，并鉴定其基因型。毕氏肠微孢子虫病的流行病学机制和其宿主与传播途径尚未可知，且不同基因型拥有不同的生物学特性。所以，通过比较不同宿主的毕氏肠微孢子虫SSUrRNA基因的内部转录间隔区(ITS)序列，得出人和多种动物微孢子虫病的流行因素。微孢子虫的检测方法最初用油镜，但是微孢子虫孢子较小，平均为1.0~3.0μm×1.5~4.0μm，且样品中常有杂质干扰，因此应用此方法检测易漏检或误检，致使结果不准确，失去意义。而应用免疫学等方法对其诊断不能鉴定到种。因此，如今国内外学者最常应用PCR等方法技术对微孢子虫进行诊断及研究，随着研究的深入，PCR对微孢子虫进行诊断取得了重大的发展。本次研究采用巢氏PCR对毕氏微孢子虫进行特异性扩增。目前，我国极少见到猪微孢子虫病的流行病学资料报道(未发表)。为了解河南省猪的毕氏微孢子虫感染情况，本研究采用李巍等应用的巢式PCR技术、引物对猪毕氏微孢子虫ITS基因进行特异性扩增、测序，随后利用ClustalX1.81、Phylip3.64、Treeview3.0等软件对测序结果进行序列比对、同源性分析，并构建系统发育树。本章将对河南省猪毕氏微孢子虫病感染率等流行病学数据、感染的基因型及其人兽共患传播的潜在风险等方面进行调查。2材料与方法2.1样品来源见研究内容第一章2.1样品来源2.2粪便样品的处理取10g新鲜粪便，加50mL自来水，浸泡10min，用玻璃棒将其捣碎混匀后用60目铜筛过滤，-1将滤液过滤至50mL离心管中，放入离心机内3000r·min离心5min，弃去上清液。置于1.5mL离心管中，-20℃保存，备用。2.3材料主要仪器与耗材第24页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文TM试剂：美国OMEGA生物技术公司生产的粪便DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.StoolDNAKit，型号为：4015-02)、大连宝生物工程Takara公司生产的PCR扩增试剂盒(rTaq酶等)、DNAMarkerDL2000、0.5MEDTA、TAE(Tris-盐酸，EDTA)、DNAgreen、10×LoadingBuffer无水乙醇、琼脂糖、双蒸水。耗材：10mL/100mL/1000mL量筒、1000mL烧杯、250mL锥形瓶、2mLEppendorf管、1.5mLEppendorf管、PCR管、移液枪、枪头、PE手套等。主要仪器：SP-DJ系列水平净化工作台、高压灭菌器、G560E型振荡器(美国进口)、XMTB数显电热恒温水浴锅、SVC-3000VA高精度全自动交流稳压器、TGL-16B高速台式离心机、AB204-N型电子天平、2720ThermalCyclerPCR仪、KD25B-A型微波炉、DYY-5型稳压稳流电泳仪及JY系列电泳槽、凝胶成像分析系统、UV-2000紫外分析仪、电脑、冰箱、等。2.4方法2.4.1DNA提取步骤用4015-02型E.Z.N.A.TMStoolDNAKit提取DNA，具体步骤如下：(1)取样：取粪便样品50-100mg，于1.5ml离心管中，加入200mgGlassbreads；(2)加入300μLBufferSP1，再加入10μLProteinaseK，混匀振荡20min；(3)70℃孵育15min，每5min取出振荡1min；(4)冰上孵育2min，加入100μLBufferSP2，充分混匀振荡30s；-1(5)冰上孵育5min，以>13000r·min离心8min；(6)将上清液移入新的1.5mL离心管中(切忌碰到杂质。上清液约200-300μL)。加200μLHTRReagent，混匀振荡10s(HTR易产生沉淀，用前应混匀)；-1(7)室温孵育2min，以>13000r·min离心2min；(8)将250μL上清液移入新的2mL离心管中，加250μLBufferBL，再加250μL无水乙醇，混匀振荡10s；-1(9)将上述液体(约700μL)吸到HinBindDNA柱中，以>13000r·min离心1min，弃集合管和废液(若DNA柱长期未用，应先用无水乙醇平衡)；-1(10)将DNA柱换到新集合管中，加500μLBufferHB，以>13000r·min离心1min，弃集合管和废液；-1(11)将DNA柱换到新集合管中，加750μLDNAWashBuffer，以>13000r·min离心1min，弃集合管和废液；-1(12)将DNA柱换到新集合管中，>13000r·min离心2min，以干燥DNA柱(同时将ElutionBuffer置入65℃水浴锅中孵育2min)；(13)将DNA柱换到新的标记好的1.5mL离心管中，加200μLElutionBuffer，室温孵育2min，-1以>13000r·min离心1min；(14)将提取的DNA分装，一部分保存于4℃待检，另一部分保存于-20℃备用。第25页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文2.4.2ITS基因PCR扩增反应2.4.2.1扩增引物见表2-1表2-1毕氏微孢子虫ITS基因的巢氏PCR引物Table2-1NestedPCRprimersofE.bieneusibasedonITSgene退火温度片段大小轮数引物名称引物序列55℃410bp1EBF15’-GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT-3’EBR15’-TATGCTTAAGTCCAGGGAG-3’55℃392bp2EBF25’-AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG-3’EBR25’-AGTGATCCTGTATTAGGGATATT-3’2.4.2.2PCR扩增体系见表2-2表2-2巢式PCR反应体系Table2-2NestedPCRsystem.试剂第一轮PCR反应体系第二轮PCR反应体系灭菌双蒸水15μL15μLBuffer2.5μL2.5μLdNTPs2.5μL2.5μLMgCl21.5μL1.5μL上游引物0.5μL0.5μL下游引物0.5μL0.5μLKODplas酶0.5μL0.5μLDNA2μL—第一轮PCR产物—2μL总反应体系25μL25μL2.4.2.3PCR扩增过程见图2-12.4.3PCR产物的检测取5μLPCR产物，加入2µL6×LoadingBuffer，混合后在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，100V电压下半小时，取出置于凝胶电泳成像系统仪，观察并拍照保存。2.4.4PCR产物的测序将PCR阳性产物送至诺赛基因科技股份有限公司北京测序部测序。2.4.5种系发育分析2.4.5.1GenBankITS基因参考序列见表2-32.4.5.2种系发育分析第26页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文应用ClustalX1.81软件将本次检查测序得到的PCR阳性产物序列和GenBank上的5个参考图2-1PCR反应过程(比氏肠微孢子虫特异性引物)Fig2-1ThecycleprocessofPCR(specficprimerofE.bieneusi:EBIEF1、EBIER1)表2-3ITSrRNAGenBank参考序列Table2-3ReferencesequenceofITSrRNAfromGenBankNumberGenbankSpeices1AF348470EbpD2JF927956EbpC/E/Peru4/WL133AF135833F4AF267144N5KC860943TypeIV序列进行比对，校正比对后序列(删掉过短或过长序列，修改某些明显测错的碱基)。然后用MEGA5软件构建种系发育树，并用TreeView3.0绘制种系发育树。利用DNAStar内置的MegAlign5.0软件进行序列间的同源性分析。3结果与分析3.1猪毕氏微孢子虫感染情况PCR检测结果显示462份样品中有99份呈现为阳性，基因片段大小为392bp，感染率为25.97%。部分样品电泳图见图2-2。3.1.1不同地区猪毕氏微孢子虫感染情况本次调查的462份样品PCR结果显示：不同地区猪毕氏微孢子虫总感染率为25.97%，其中中牟、北川、辉县E.bieneusi感染率较高，均达到50%以上，罗山、金水区、原阳的感染率较低，小于<10%，西华的为11.32%(不同地区猪毕氏微孢子虫的感染情况见表2-4)。3.1.2不同年龄的猪毕氏微孢子虫感染情况第27页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图2-2ITS基因的PCR产物M：DL-200；1-22为样品7、11、17、39、46、109、143、161、161、177、185、199、211、233、251、265、314、320、344、363、406、414号；P为阳性对照；N为阴性对照。Fig2-2ThePCRproductsofCryloporaITSgeneNote:M:DL-2000Marker;1-22:samples7、11、17、39、46、109、143、161、161、177、185、199、211、233、251、265、314、320、344、363、406、414;P:positivecontrol;N:negativecontrol.表2-4PCR检测不同地区猪毕氏微孢子虫的感染情况Table2-4TheinfectionratesofPCRdetecE.bieneusiinpigofdifferentareas地区样本数阳性数感染率%中牟784456.41罗山6211.61北川211150.00辉县974950.52金水区4812.08原阳3425.88西华1061211.32召陵区1600总计46212025.97本次有猪龄记录的384份样品中，育肥猪和母猪感染率较高分别为24.07%和21.13%，保育猪仅次之为18.52%，乳猪和种公猪也有感染(不同年龄的猪毕氏微孢子虫感染情况见表2-5)。3.1.3不同饲养方式的猪毕氏微孢子虫感染情况本此调查的样本分三种饲养模式：规模化猪场、小专业户、散养户。小专业户感染率最高达42.15%，规模化养殖场感染率最低为3.13%(不同饲养模式的猪毕氏微孢子虫感染情况见表2-6)。第28页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文表2-5PCR检测不同年龄的猪毕氏微孢子虫感染情况Table2-5TheinfectionratesofPCRdetectE.bieneusiinpigofdifferentages年龄阶段样本数阳性数感染率%乳猪31412.90保育猪1623018.52育肥猪1082624.07母猪711521.13公猪1218.33总计3847619.79表2-6PCR检测不同饲养模式的猪毕氏微孢子虫感染情况Table2-6TheinfectionratesofPCRdetectE.bieneusiinpigofdifferentBreedingways饲养方式样本数阳性数感染率%规模猪场9633.13专业户2239442.15散养猪1432316.08总计46212025.973.1.4不同时间猪毕氏微孢子虫的感染情况本次样品采集的时间分为三个阶段5-6月份、7月份、8-9月份，其中5-6月份样品161份，7月份样品97份，8-9月份样品204份。感染率最高的为7月份达到50.52%，8-9月份感染率最低为7.35%(不同时间猪毕氏微孢子虫感染情况见表2-7)。表2-7PCR检测不同时间猪毕氏微孢子虫感染情况Table2-7TheinfectionratesofPCRdetectE.bieneusiinpigofdifferenttime时间样本数阳性数感染率%5-6月1615634.787月974950.528-9月204157.35总计46212025.973.2猪感染毕氏微孢子虫的基因型通过对PCR阳性结果进行测序，拼接，判断虫种或基因型。结果显示得到6种分离株：5个报道过的基因型，分别为F、pigITS5、EbpD、EbpC(E、Peru4、WL13)、TypeⅣ，另外一个与TypeⅣ基因型关系最为接近，有碱基差异。其中这6个序列差异只有1-6个SNP。第29页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图2-3.河南省猪毕氏微孢子虫分离株ITS基因序列与毕氏微孢子虫的其他基因型根据邻接法（NJ）建立的系统发育关系。1000个重复采样的Bootstrap(BP)标在相应的节点上。Fig2-3PhylogeneticrelationshipsofEnterocytozoonspp.frompigofHenanProviceandotherEnterocytozoonspp,genotypeinGenankinferredfromtheneighbor-joininganalysisoftheITSregionoftherRNAgene.Numbersonbranchesarepercentbootstrapvaluesfrom1000replications.3.3毕氏微孢子虫ITS基因序列种系发育分析对阳性样品的分离株进行扩增、测序得到34条序列，ClustalX1.81比对、拼接，用序列在NCBI上BLAST，对比的在Genbank发表的基因序列，有9份样品与基因型F有100%或99%的相似，有1份样品与基因型pigITS5有100%的相似，有1份样品于基因型EbpD有100%的相似，有21份样品与基因型EbpC(/E、Peru4、WL13)有100%或者99%的相似，有1份样品与基因型TypeⅣ有100%的相似，下载得到6个序列，再用MEGA5.05种系分析软件邻接法(NJ)构建进化树，应用ClustalX1.81、Phyloip3.64、DNAstar4.0等生物信息学软件对13个序列进行比对、同源性分析及构建分子发育进化树，得到如下结果，8代表的9份样品与在牛中发现的毕氏微孢子虫F基因型(AF135833)在同一个分支上(见图2-2)，同源性分析为100%(见图2-3)；35代表的1份样品与日本大阪的野猪中毕氏微孢子虫pigITS5(AB470281)在同一个分支上(见图2-2)，同源性分析为100%(见图2-3)；17代表的1个序列与在美国马塞诸萨州的猪中发现的毕氏微孢子虫基因型EbpD(AF348470)在在同一个分支上(见图2-2)，同源性分析为100%(见图2-3)；9代表的21个序第30页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文列与在秘鲁的猪中发现的毕氏微孢子虫EbpC(E、Peru4、WL13)(JF927956)在同一个分支上(见图2-2)，同源性分析为100%(见图2-3)；16代表的1个序列与在秘鲁库斯科的骆马中发现的毕氏微孢子虫基因型TypeⅣ(KC860943)在同一个分支上(见图2-2)，同源性分析为100%(见图2-3)；37代表的一个序列与基因型TypeⅣ关系最为近，在一个大的分支上(见图2-2)，同源性为99.7%(见图2-3)，有一个碱基的差异；从本次实验中得到的6种序列8、35、17、9、37、16和从牛中分离的基因型为N(AF267114)的序列在两个大支上(见图2-2)，8和35、16和37关系最近，同源性为99.7%(见图2-3)；16和8关系最远，同源性为97.6%(见图2-3)。图2-4河南省猪源微孢子虫分离株与E.bieneusi基因型在ITS基因上的差异性Fig2-4SequencediversityintheITSgenebetweentheE.bieneusigenotypeandMicrosporidiaisolatedfrompigofHenanProvicen4结论与讨论4.1猪毕氏微孢子虫感染率分析据另调查证明E.bieneusi是在猪的样品中最为常见的微孢子虫属，E.bieneusi也是在人类中最常见的微孢子虫。首次发现猪感染毕氏肠微孢子虫的报道源于瑞士，1999年Breitenmoser等从位于瑞士不同地区的22个农场中随机选择109头的猪，在随后的调查中通过PCR检测，患病率为35％，在断奶仔猪中E.bieneusi的感染率较高(P<0.05)，28只感染毕氏肠微孢子虫，其ITS序[113]列与在人中发现的相似但不完全相同。2000年，Rinder等对德国发育不良且严重腹泻的猪中检出4例毕氏肠微孢子虫阳性，包括基因型EbpA(又被称为基因型F)，基因型G和基因型H。2001[114]年，Dengjel等对德国的50头猪进行微孢子虫感染情况调查，其中5头感染了毕氏肠微孢子虫，[115]基因型为EbpA、G、H和O(基因型G和H从同一动物分离)。2002年，Buckholt等对美国马第31页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文萨诸塞州某屠宰场的调查，临床上32%的健康猪感染E.bieneusi，结果发现体重少于10kg的猪感[116]染E.bieneusi的风险远远低于体重大于10kg的猪，分别为16%和37%。在韩国，Jeong等对272头7周龄以内的仔猪进行微孢子虫感染情况调查，发现无腹泻症状的仔猪感染率为12.34%(29/235)，有腹泻症状的仔猪感染率为16.03%(38/237)，感染的主要是1周龄以内和1-2周[117]龄的仔猪，其中一个基因型CAF1可以感染人。2009年，Leelayoova等(2009)对泰国某社区中的四个猪场进行调查，感染率为15.7%，与韩国报道相似，查到的基因型有O、H和Ebpc，这[118]三种基因型可以感染人和多种野生动物。2010年，Abe等对日本的30头猪的粪便样品进行微孢子虫感染情况调查，PCR检测结果发现其中10头猪感染了毕氏肠微孢子虫，基因型包括只感染动物的EbpA、H和PigEBITS5，以及人兽共患基因型D和EbpC。在捷克，79份猪粪便样本有94%检出感染毕氏肠微孢子虫基因型EbpA。另外在其他地区，猪E.bieneusi的感染率在[119-120]30.5%~90%不等。本次的调查显示猪毕氏微孢子虫的总体感染率为25.97%，虽略低于外国，但也呈现较高的感染率；5、6、7月份是猪的感染率较高说明夏季是猪感染微孢子虫的高发季节，并且不同地区猪微孢子虫感染率相差较大，饲养方式不同感染率也相差较大，且PCR检测毕氏微孢子虫呈阳性的猪没有腹泻等临床症状。综合以上分析，E.bieneusi可能是猪中的一种常见寄生虫。4.2猪毕氏微孢子虫基因型及种系发育分析以前微孢子虫的分类都是基于孢子的形状、孢子大小差异、孢子生殖阶段的形态学、每个母孢子产生的孢子数、细胞核的排列、生活周期的多样性或寄主细胞的反应类型等，但是面对一些形态特征极为相似的近缘种，传统的方法分类起来很困难。随着分子生物技术的发展，人们相继对微孢子虫的系统发育和分类进行了较深入的研究。虽然利用一小片段分子特征构建分子系统树可能与作为一个整体的种或种群的系统树不相同，但是通过对有代表性样本的多基因评估，就能推出微孢子虫种群和近缘种间的系统进化关系，并且随着基因序列研究的不断深入，人们获得的分子信息量大大增加，因此在微孢子虫系统进化研究中建立使用遗传信息的最佳方法就愈显重要，这无疑使微孢子虫分子系统学为微孢子虫系统进化研究提供一条重要途径，使人们对微孢子虫的生活史、传播途径、传播机制有更清晰的认识，更好的为微孢子虫病的防治提供新途径。到目前为止，基于ITS基因，检测到猪感染的毕氏微孢子虫有17种基因型，本次研究经分析：8代表的9个分离株为F基因型，这个基因型在样本中的比例为26.47%，是仅在动物感染中发现的毕氏微孢子虫基因型，在德国的牛和德国、日本、捷克、美国、瑞士的猪中被检测到；35代表的1个分离株为pigITS5基因型，这个基因型在样本中的比例为2.94%，这个毕氏微孢子虫的基因型仅在美国、日本、韩国的猪中被报道过，目前没有发现感染人类和其他动物；17代表的1个分离株为EbpD基因型，这个基因型在样本中的比例为2.94%，同基因型pigITS5，其只发现在猪中；9代表的21个分离株为EbpC(E、Peru4、WL13)基因型，这个基因型在样本中的比例为61.76%，远远高于其他基因型，说明这个基因型对猪易感，在国外的报道中，猪的E.bieneusi菌株中最经常鉴定到的是基因型O，可能与地理、饲养环境等因素有关，不同地区对猪易感的E.bieneusi基第32页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文因型不同。这个基因型的感染宿主包括人、猪、河狸、水獭、麝鼠、浣熊、狐狸，并且地域很广，德国、瑞士、美国、日本、泰国、越南都有报道，是人畜共患毕氏微孢子虫基因型；16代表的1个分离株的基因型为TypeⅣ，这个基因型在样本中的比例为2.94%，这个基因型也在人、牛、猫、犬发现过，说明这个基因型有潜在的人畜共患性；37代表的一个序列于基因型TypeⅣ关系最为近，在一个大的分支上(见图2-2)，同源性为99.7%(见图2-3)，有一个碱基的差异，可能为一个新的基因型。本研究中发现猪感染的6种毕氏微孢子虫有两种为人畜共患基因型，比例达到64.7%，新发现的基因型和TypeⅣ的关系也最近，虽然人和猪之间是否会相互感染E.bieneusi不是十分清楚，但是猪仍被认为是人畜共患基因型的储存器，是人感染E.bieneusi的潜在感染源。小结本研究获得已报道感染猪的毕氏微孢子虫基因型共有6种，分别为：F(26.47%)、PigEBITS5(2.94%)、EbpD(2.94%)、TypeIV(2.94)、EbpC(E、Peru4、WL13)(61.76%)，EbpC(E、Peru4、WL13)基因型对猪易感，EbpC、TypeIV基因型也在人类中发现，表明该基因型有人畜共患的潜在风险，还有一个新的基因型与人源性基因型Typeⅳ关系最近，有一个碱基的差异。第33页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文第三章河南省羊毕氏微孢子虫的感染情况及系统进化分析1引言羊感染微孢子虫会引起体重减轻、食欲不振、慢性腹泻等症状，严重者甚至导致死亡，对养羊业有很大的潜在危害性。迄今为止，对微孢子虫的传播机理还不清楚，但诸多报道显示有从动物传染给人的可能，因此，对羊进行其微孢子虫病流行病学调查具有重要的公共卫生学意义。目前，我国甚至世界尚未见到关于羊的毕氏微孢子虫病的流行病学资料报道。为了解河南省羊毕氏微孢子虫感染情况，作者应用的巢式PCR技术对实验室保存的羊粪便样品进行扩增、测序、同源性分析，并构建系统发育树，以期对河南省羊感染毕氏微孢子虫进行鉴定、总结其分子特诊及种系发育等。2材料与方法2.1样品来源本实验室保存的羊粪便DNA样品，采集于2011年3月至2011年12月。2.2材料主要仪器与耗材试剂：大连宝生物工程Takara公司生产的PCR扩增试剂盒(rTaq酶等)、DNAMarkerDL2000、0.5MEDTA、TAE(Tris-盐酸，EDTA)、DNAgreen、10×LoadingBuffer无水乙醇、琼脂糖、双蒸水。耗材：10mL/100mL/1000mL量筒、1000mL烧杯、250mL锥形瓶、2mLEppendorf管、1.5mLEppendorf管、PCR管、移液枪、枪头、PE手套等。主要仪器：SP-DJ系列水平净化工作台、高压灭菌器、G560E型振荡器(美国进口)、SVC-3000VA高精度全自动交流稳压器、TGL-16B高速台式离心机、AB204-N型电子天平、2720ThermalCyclerPCR仪、KD25B-A型微波炉、DYY-5型稳压稳流电泳仪及JY系列电泳槽、凝胶成像分析系统、UV-2000紫外分析仪、电脑、冰箱、等。2.3方法2.3.1ITS基因PCR扩增反应见研究内容第二章的2.4.2ITS基因PCR扩增反应2.3.2PCR产物测序及种系发育分析研究内容第二章2.4.42.3.3种系发育分析见研究内容第二章2.4.5.22.3.4GenBankITS基因参考序列根据微孢子ITS基因位点，在GenBank下载基因序列，与分离到的微孢子虫阳性样品进行进化关系比较。参考GenBank的微孢子虫的基因序列资料见表3-1。第34页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文表3-1ITSGenBank参考序列Table3-1ReferencesequenceofITSfromGenBank登录号基因型感染宿主JF927956EbpC/E/Peru4/WL13pigsEU153584BEB6cattleJF776168DHuman、pigs、cattleKC708073IHHomosapiensJX524499Nig6HomosapiensAY237212WL4Muskrat3结果与分析3.1羊毕氏微孢子虫的感染情况PCR检测结果显示：共查出阳性样品74份，基因大小片段为392bp，均为毕氏微孢子虫，总体感染率为9.23%，部分样品电泳图见图3-1。感染率详见表3-2。图3-1ITS基因的PCR产物M：DL-2000；1-22为样品8HH1、8HH3、8HH29、9DF2、9DF3、9DF31、SM3、SM7、SM11、SM19、SC6、SC15、10HH3、10HH9、10HH15、10HH20、10HH23、7ZM1、7ZM16、7ZM25、7ZM43、7ZM54；P为阳性对照；N为阴性对照Fig3-1ThePCRproductsofCryloporaITSgeneNote:M:DL-2000Marker;1-22:8HH1、8HH3、8HH29、9DF2、9DF3、9DF31、SM3、SM7、SM11、SM19、SC6、SC15、10HH3、10HH9、10HH15、10HH20、10HH23、7ZM1、7ZM16、7ZM25、7ZM43、7ZM54;P:P:positivecontrol;N:negativecontrol.3.1.1不同品种羊毕氏微孢子虫的感染情况本次调查的802份样品中，山羊340份，绵阳462份，PCR结果显示：有42份山羊感染毕氏微孢子虫，感染率为12.35%；绵阳32份，感染率为6.93%(不同品种羊的毕氏微孢子虫感染情况见表3-2)。第35页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文3.1.2不同年龄羊毕氏微孢子虫的感染情况本次样本的羊群年龄主要分为两个阶段，1岁以内的幼龄羊474份和1岁以上的成年羊328份，PCR结果显示：感染幼龄羊的49份，感染率为10.34%；感染成年羊等的25份，感染率为7.62%(不同年龄羊的毕氏微孢子虫感染情况见表3-2)。表3-2PCR检测羊的毕氏微孢子虫感染情况Table3-2TheinfectionratesofPCRdetectE.bieneusinGoatsandSheep项目阳性数/样品数感染率(%)TypePositive/SampleInfectionRate(%)品种山羊(Goat)42/34012.35Species绵羊(Sheep)32/4626.93年龄幼龄羊(Juvenile)49/47410.34Age成年羊(Adult)25/3287.62时期7月-9月56/43612.84Time10月-12月18/3664.92饲养方式舍饲(Domestic)34/5166.59BreedingWay放牧(Graze)40/28613.99总计(Total)74/8029.233.1.3不同饲养方式羊毕氏微孢子虫的感染情况本次调查的样本，饲养方式主要有两种：舍饲和放牧。其中调查舍饲的516份，调查放牧的286份。舍饲感染毕氏微孢子虫34份，感染率为6.59%；放牧感染40份，感染率为13.99%(不同饲养方式羊的毕氏微孢子虫感染情况见表3-2)。3.1.4不同时期羊毕氏微孢子虫的感染情况本次调查样本的时期主要分两个阶段：7月-9月，共调查436份，10月-12月，共调查366份。PCR检测结果显示：有56只幼龄羊感染毕氏肠微孢子虫，感染率为12.84%；有18只成年羊感染比氏肠微孢子虫，感染率为4.92%(不同时期羊的毕氏微孢子虫感染情况见表3-2)。3.2羊毕氏微孢子虫PCR检测结果经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析802份PCR产物，扩增出74个阳性样品，基因片段大小为392bp，为毕氏肠微孢子虫。3.3羊毕氏微孢子虫ITS基因序列种系发育及同源性分析对阳性样品的分离株进行扩增、测序得到74条序列，经ClustalX1.81比对、拼接，用所得序列在NCBI上BLAST，与在Genbank发表的基因序列对比，有62份样品与基因型BEB6有100%或99%的相似，有7份样品与基因型EbpC/E/Peru4/WL13有100%或99%的相似，有2份样品于基因型D有100%或99%的相似，另外2份样品与Genbank发表的基因序列最高的94%的相似，第36页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文另外一份只有87%的相似。再用MEGA5.05种系分析软件邻接法(NJ)构建进化树，利用DNAStar内置的MegAlign5.0软件进行序列间的同源性分析。得到如下结果，SC3代表的2份样品与在秘鲁猪中发现的毕氏微孢子虫EbpC/E/Peru4/WL13基因型(JF927956)在同一个分支上(见图3-1)，同源性分析为100%(见图3-2)。SM10代表的2个序列与在艾滋病人中发现的毕氏微孢子虫基因型D在在同一个分支上(见图3-1)，同源性分析为100%(见图3-2)。7ZM21与在美国东部的牛中发现的毕氏微孢子虫BEB6(EU153584)关系最近(见图3-1)，同源性为94.4%。12DF14代表的62个序列与在美国东部的牛中发现的毕氏微孢子虫BEB6(EU153584)在同一个分支上(见图3-1)，同源性分析为100%(见图3-2)。10HH28和SM7为本次调查的分离株，在同一分支上(见图3-1)，同源性分析为100%(见图3-2)，与发现在人类中的基因型Nig6（JX524499）关系最近，同源性为84.5%。4结论与讨论4.1羊毕氏微孢子虫感染率本次对实验室羊DNA样品(登封、郑州惠济区、平顶山鲁山、中牟、信阳、三门峡)进行了微孢子虫病流行情况的调查，共802份羊的毕氏微孢子虫总体感染率为9.23%，绵羊微孢子虫感染图3-2.河南省羊毕氏微孢子虫分离株ITS基因序列与比氏微孢子虫的其他基因型根据邻接法（NJ）建立的系统发育关系。1000个重复采样的Bootstrap(BP)标在相应的节点上。Fig3-2PhylogeneticrelationshipsofEnterocytozoonspp.fromgoatandsheepofHenanProviceandotherEnterocytozoonspp,genotypeinGenankinferredfromtheneighbor-joininganalysisoftheITSregionoftherRNAgene.Numbersonbranchesarepercentbootstrapvaluesfrom1000replications.第37页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文图3-3河南省猪源微孢子虫分离株与E.bieneusi基因型在ITS基因上的差异性Fig3-3SequencediversityintheITSgenebetweentheE.bieneusigenotypeandMicrosporidiaisolatedfrompigofHenanProvice率远远低于山羊(6.93%/、12.35%)，幼龄羊微孢子虫感染率高于成年羊(10.34%/、7.62%)；夏秋季节，羊的微孢子虫感染率较高：放牧羊群微孢子虫感染率高于舍饲羊群(13.99%/、6.59%)。本次调查结果与报道的相比，羊的毕氏微孢子虫感染率偏低，可能是由于不同国家地区、不同饲养方式、不同品种等各方面的差异所致。4.2羊毕氏微孢子虫基因型及种系发育分析经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析802份PCR产物，扩增出74个阳性样品，基因片段大小为392bp，为毕氏肠微孢子虫。对阳性样品的分离株进行扩增、测序得到74条序列，ClustalX1.81比对、拼接，在用序列在NCBI上BLAST于只接近的在Genbank发表的基因序列，有62份样品与基因型BEB6有100%或99%的相似，有7份样品与基因型EbpC/E/Peru4/WL13有100%或99%的相似，有2份样品于基因型D有100%或99%的相似，另外2份样品与Genbank发表的基因序列最高的94%的相似，另外一份只有87%的相似。再用MEGA5.05种系分析软件邻接法(NJ)构建进化树，利用DNAStar内置的MegAlign5.0软件进行序列间的同源性分析。得到如下结果，SC3代表的7个分离株为EbpC/E/Peru4/WL13基因型毕氏微孢子虫。SM10代表的2个分离株为D基因型毕氏微孢子虫。12DF14代表的62个分离株为BEB6基因型毕氏微孢子虫。10HH28和SM7为本次调查新发现的的分离株，且与其他的分离株距离较远，说明这两个分离株于其他的分离株碱基差异较大，可能为一个新的基因型。7ZM21与在美国东部的牛中发现的毕氏微孢子虫BEB6(EU153584)关系最近(见图3-1)，同源性为94.4%，也可能为一个新的基因型。第38页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文在74个阳性样本中BEB6基因型有62份，在阳性样本比例高达83.8%，说明这个基因型对羊易感，此基因型只在美国的牛中被报道过，且对牛易感，可能此种基因型对反刍动物易感；EbpC/E/Peru4/WL13基因型有7份，在阳性样本比例为9.46%，且这个基因型在上章的研究内容中也感染了猪，有详细叙述；基因型D有2份阳性，比例为2.70%，这个基因型也发现在英国、越南、泰国等地的人中，也发现猪、牛、狐狸等动物中，所以说这个基因型为人畜共患毕氏微孢子虫的基因型。本研究中发现的基因型有5种，已报道的基因型3种，分别为：BEB6、EbpC/E/Peru4/WL13、D，BEB6基因型对羊易感，EbpC、D基因型也在人类中发现，表明该基因型有人畜共患的潜在风险，另外，发现两个新的基因型。人畜共患的基因型比例达到12.16%，说明羊也可能是人感染毕氏微孢子虫的潜在感染源，那些免疫力低下，例如艾滋病患者、器官移植病人等易感人群，应该尽量避免与这种动物接触。4展望微孢子虫具有遗传的多样性，根据人、家畜、野生动物和鸟类毕氏肠微孢子虫不同分离株间ITS基因序列的差别，已报道和描述了将近100个毕氏肠微孢子虫基因型。从本研究中可以看出感染人类毕氏微孢子虫基因型也可以感染不同的家畜，据报道感染家畜、野生动物和鸟类的毕氏肠微孢子虫基因型同时在人的感染中发现，因此断定一部分毕氏肠微孢子虫具有人兽共患潜力。然而，毕氏肠微孢子虫病的流行病学机制和其宿主与传播途径尚未可知，所以，动物在人微孢子虫病传播中所起的作用需进一步深入研究。易感人群与动物接触时存在的潜在感染需要引起注意。无症状的毕氏肠微孢子虫携带者(人和动物)可能成为感染其它人与动物的宿主。且毕氏肠微孢子虫不同基因型拥有不同的生物学特性，它与疾病之间的关系仍不清楚，没有更有效的预防和治疗方法，亦无有效的疫苗，因此，毕氏肠微孢子虫仍需更深层次的研究。第39页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文结论与创新点1.结论1本次调查发现河南省部分地区猪肠道寄生虫的感染率为61.93%，其中以阿米巴感染率最高(44.81%)。2基于ITS基因位点分析，本次调查猪毕氏微孢子虫的感染率为25.97%，发现的5个已报道的基因型及其阳性率分别为F(26.47%)、PigEBITS5(2.94%)、EbpD(2.94)、TypeIV(2.94)、EbpC(E、Peru4、WL13)(61.76%)，其中TypeIV基因型也在人类中发现，具有人畜共患的潜风险。还有一个新的基因型，它与人源性基因型Typeⅳ关系最近，有一个碱基的差异，同源性为99.7%。3基于ITS基因位点分析，本次调查山羊、绵阳的毕氏微孢子虫总体感染率为9.23%，其中山羊12.35%，绵羊6.93%；发现的3个已报道的基因型及其阳性率分别为BEB6(83.8%)、EbpC/E/Peru4/WL13(9.46%)、D(2.70%)、其中D基因型也在人类中发现，有人畜共患的潜在可能性。此外，发现2种新基因型，一种与基因型BEB6较接近，同源性为94.4%，一种在独立的分支，与其他基因型关系较远。2.创新点本研究在河南首次对猪、羊毕氏微孢子虫病流行情况进行了调查，分子生物学分析显示感染猪、羊的毕氏微孢子虫存在感染人的可能，具有重要的公共卫生学意义。第40页共52页万方数据 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河南农业大学2013届硕士毕业论文EnterocytozoonbieneusiinPig,SheepandGoatinHenanProvienceSupervisor:Prof.NINGChangshenMasterCandidate:DUHailiABSTRACT：Microsporidiaisunicellulareukaryotic,obligateintracellularprotozoanparasitethatinfectsabroadrangeofinvertebratesandvertebrates.Itisalsoakindofzoonoticpathogen.Itincludesmorethan1400speciesthatcanbedividedintoabout150generas.Andamongthem,atleast14speciesin8generascaninfecthuman.MicrosporidiahasbeenrecognizedasanimportantopportunisticpathogenwiththeprevalentofAIDSsincethe1980s.TheimmunocompromisedpeopleandthosewithnormalimmunefunctionallcanbeinfectedbyMicrosporidia.Afterthepeopleandanimalswithnormalimmunesystemareinfectedwiththispathogen,theyjustshowtemporarysymptomsorlatentinfection.Whilethepatientswithdefectiveimmunity,lowimmunityandsuppressedimmunity,especiallythepeoplewithAIDS,oncetheyareinfectedwiththispathogen,theywilldevelopfataldiarrhea,whichisoneofthemajorriskfactorsofAIDS.Inaddition,Microsporidiacancausedamagetourinarysystemandrespiratorysystemandmanyotherdiseasessuchaskeratitis,encephalitisandmyocarditis.Asanewinfectiousdisease,Nosemahascausedaworldwidepublichealthproblem.IthasbeenonthelistofthesecondclassofpotentiallydangerousmicrobesbytheU.S.NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases.Inthispaper,acomprehensiveexplorationwasconductedtoinvestigatetheepidemiologyandgeneticcharacteristicsofNosemainpigs,sheepsandgoatsinHenanprovince.Thisresearchwillprovidebasicreferenceforlaterrelatedscholarsandforthecontrolandtreatmentofthisdisease.1.InordertounderstandtheinfectionandimpactofswineintestinalparasitesinsomeareasofHenanprovinceandformulateapreventionprogramscientificallytoguidethepreventionofanimalintestinalparasitesreasonably,462freshfecalsampleswerecollectedfromsevencitiesofHenanprovinceandBeichuancityofSichuanprovinceduringSeptember2012andMay2013,andthenallthesampleswereexaminedbyLugol’siodinestaining,saturatedsugarflotationtechniqueandMikeMaascountingmethod.Theresultsshowedthat8speciesofintestinalparasiteweredetectedin402samplesandtheoverallinfectionratewas61.93%.TheparasitesareCoccidia,Cryptosporidium,Giardia,Whipworm,Roundworm,Nematodes,BalantidiumcoliandEntamoeba.Amongthem,Entamoebahadthehighestinfectionrateof44.81%.TheinfectionintensityofCoccidiaandNematodeswere<200-4600and<200-600respectively.第49页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文2.TolearntheinfectionofMicrosporidiainswinesandtheirmolecularcharacteristics,nestedPCRwasusedtodetectthefecalspecimens.theresultsmanifestedthat120positivesampleswerefoundin462samples,andtheinfectionratewas25.97%,theyareallMicrosporidia.ThereweredifferencesofinfectionratesofMicrosporidiainswineswithdifferentagesanddifferentfeedingmodes.Theinfectionratesofdifferentagesofswineswere24.07%,21.13%,18.52%,12.90%,8.33%forfatteningpigs,sows,weaners,sucklingpigs,boarrespectively.TheinfectionrateofMicrosporidiainthesmallspecialistwas42.15%,whichwashigherthanthebackyardandthescale,theinfectionratesofwhichwere16.08%and3.13%respectively.ZhongmucityofHenanprovincehadthehighestprevalenceofPythagoreanNosema,theinfectionratewas56.41%.Afterthepositivesamplesweresequencedandblasted,6sequenceswereobtained.And6othersequencesweredownloadedfromNCBI.Thehomologyofthese12sequenceswasanalyzedandthemolecularphylogenetictreewasconductedusingClustalX1.81,Phyloip3.64,DNAstar4.0.Theresultsshowedthat5genotypesofPythagoreanNosemawerefoundinpigs.TheywereF,PigEBITS5,EbpD,TypeIVandEbpC/E/Peru4/WL13).Amongthem,genotypeEbpCandTypeIVcanalsobefoundinhuman.Sothereisapotentialriskthatthetwogenotypesmaybezoonotic.Therewasanothernewgenotype,whichhadtheclosestrelationshipwithhumanizedgenotypeTypeIV.Theirhomologywas99.7%andtherewasjustonebasethatwasdifferent.3.NestedPCRwasusedtodetectthefecalspecimenstodetecttheinfectionofMicrosporidiaandmolecularcharacteristicsofthemingoats.Theresultsmanifestedthat74positivesampleswerefoundin802samples,andtheinfectionratewas9.23%.TheinfectionratesofMicrosporidiaingoatsofdifferentagesanddifferentfeedingmodesvaried.Theinfectionrateinsheepswas6.93%,whichwaslowerthanthatinbackyardwhichwas12.35%.Theinfectionrateinyoungsheepswas10.34%whichwashigherthanadultsheepwhichwas7.62%.TheinfectionrateinJulytoSeptemberwas12.84%whichwashigherthanthatofOctobertoDecember.Theinfectionrateinputtingsheepswas13.99%whichwashigherthandomesticsheepsthatwas6.59%.Afterthepositivesamplesweresequencedandblasted,6sequenceswereobtained.And6othersequencesweredownloadedfromNCBI.Thehomologyofthese12sequenceswasanalyzedandthemolecularphylogenetictreewasconductedusingClustalX1.81,Phyloip3.64,DNAstar4.0.Theresultsshowedthat3genotypesofPythagoreanNosemawerefoundinsheepsandgoats.TheywereBEB6,EbpC/E/Peru4/WL13andD.Amongthem,genotypeEbpCandDcanalsobefoundinhuman.Sothereisapotentialriskthatthetwogenotypesmaybezoonotic.第50页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文What’smore,twonewgenotypeswerefound,oneofthemhadcloserelationshipwithgenotypeBEB6withhomologyof94.4%andanotherwasonaseparatebranch.ThiswasthefirstsurveyofepidemiologyandgeneticcharacteristicsofMicrosporidiainswines,sheepsandgoatsinHenanprovince.AndtheresultsindicatedthatthehomologyamongMicrosporidiafoundininfectedswines,goatsand3genotypessepratedfromhumanwasupto100%.ThesestatedthattheMicrosporidiaisolatedfromswinesandgoatsmayhaveahighrisktobezoonotic.SoitisfairlyimportanttoresearchtheMicrosporidiainfurtherforthepublichealth.Keywords:swine,Enterocytozoonbieneusi,infection,epidemiology,ITSgene,nestedPCR;phylogenetic个人简历第51页共52页万方数据 河南农业大学2013届硕士毕业论文杜海利，女，1985年6月生，河南洛阳人。2004.9-2007.6就读于郑州牧业高等专科学校动物医学专业；2007.9-2009.6就读于河南农业大学牧医工程学院动物医学专业，获农学学士学位；2009.9-2013.12在河南农业大学攻读预防兽医学硕士。读硕士期间在导师宁长申教授的悉心指导下，进行猪、羊微孢子虫病的分子生物学研究，并发表学术论文3篇。1、席建伟,杜海利,齐萌,胡霖,张龙现,宁长申.宠物兔肠道寄生虫感染情况调查[J].中国畜牧兽医,2011,38(9):238-240.2、朱丹，卫九健，齐萌，李梦婕，史亚东，杜海利，赵子方，宋丹，张龙现，宁长申.河南郏县大尾寒羊肠道寄生虫感染情况调查，中国草食动物，2012，32(1):69-71.3、李梦婕，朱丹，齐萌，宋丹，史亚东，赵子方，杜海利，张云，张龙现，宁长申.河南省尧山白山羊肠道寄生虫感染情况调查，中国畜牧兽医，2012,39(3):191-194.第52页共52页万方数据