《人、牛环孢子虫病流行病学调查及分子生物学研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
万方数据分类号密级河南农业大学硕士学位论文英文题目：坠i鱼星堡iQ!Q蚁!堕Y曼曼!ig堑Q塾垫亟丛Q!星盟!丛旦iQ!QgYQ￡Q堡丝兰臣Q丝距：￡!Q盟H坠堡垒垒垒坠亟￡鱼鱼!星导专论文提交日学位授予日 万方数据 万方数据本论文受到下述项目资助：国家重大科技专项课题(2012ZXl0004-220和2008ZXl0004—011) 万方数据致谢本人是在导师张龙现教授的悉心指导下完成的，课题组宁长申教授，菅复春副教授和王荣军副教授也给予了许多无私的帮助。三年的研究生生活使我得到了锻炼和成长，人际交往能力有了很大的提升，意志力得到了锻炼。同时导师张龙现教授渊博的学识和严谨的治学态度以及对严格要求使我受益终生。在此论文完稿之时，谨向导师表示最崇高的敬意和由衷的感谢。论文从选题、试验设计到课题实施和论文的最终完成，无不渗透着恩师的心血导师张龙现教授的悉心指导和亲切关怀。衷心感谢河南农业大学兽医寄生虫学实验室科研团队、河南省人兽共患病国际联合实验室的张素梅副教授、董海聚老师、赵青玉老师和刘红英老师，三年来在学习和生活上给予的关怀和帮助。感谢答辩组吴志明研究员、崔保安教授、赵军教授、营复春副教授、王学兵副教授、陈红英教授等各位老师在完成学习任务和课题研究中对我的指导和帮助，在此致以诚挚的谢意。感谢河南省农业科学院动物免疫学重点实验室李学伍老师和郅玉宝老师在试验过程中给予的大力帮助和热心的指导。感谢中国农业大学国家动物原虫实验室索勋教授在试验过程中的支持和帮助。感谢王海燕博士、Md．RobiulKarim博士、齐萌博士、张艳博士，感谢史柯、刘振伟、卫九健、彭永帅、张菲菲、王建领、岳耀辉等师兄师姐一直以来对我学习、生活及试验中提供的理论和技术指导。衷心感谢我的同学孙芳芳、刘畅、李廷文、吕亚莉、王金鸿、刘杰、刘鲜霞、张晓东两年来给予的兄弟姐妹般的亲情与关怀；感谢师弟李开放和师妹罗楠楠、周欢、周听薛、韩琼琼、武岳、张文静、刘利敏、黄建营、李丹、翁少亭、余复昌等在学习、生活以及试验过程中给予的无私帮助。感谢我的父母、弟弟，感谢他们在我的求学之路中所给予的关心和支持，他们的关心和支持是我成长的动力和源泉!最后，再次对恩师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢!感谢所有曾经给予我关心和帮助的朋友和亲人。 万方数据目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第二部分非人灵长类动物肠道寄生虫感染情况调查l引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第三部分环孢子虫流式细胞仪检测方法的建立1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第四部分河南省郑汴两市人环孢子虫流行病学及生物学研究1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第五部分河南省奶牛环孢子虫的分子流行病学调查及生物特性研究l引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯结论和创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯附件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一■"博幻巧”拍”引弱钙％铉"舛钞酡∞●一～一 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文}两要环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)是一种新现的肠道原虫，感染主要集中在旅游者、艾滋病人和呈地方性流行地区的居民，寄生于人肠道上皮细胞内，可引起人腹泻、肠痉挛、食欲减退等症状。1995年之前仅有散在环孢子虫感染的报道，1996至1997年间，北美地区有大规模的环孢子虫病暴发，共有2944个环孢子虫感染病例。自2000年以来，在美国、加拿大、英国、土耳其、哥伦比亚、南非等地区相继暴发，特别是2013年7月以来发生在美国的超过25个州的631个环孢子虫确诊病例，至少有49例由于严重腹泻危及生命而住院。我国于1995年首次报道环孢子虫感染病例，随后在云南、安徽、浙江等地均有环孢子虫感染病例报道。环孢子虫病的暴发造成了严重的经济损失，甚至危及生命，无论是发展中国家还是欧美发达国家，其流行越来越受到国内外学者的重视。为了解非人灵长类动物的肠道寄生虫的感染情况，本试验采用卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖漂浮法对收集的3234份粪便样品进行光学显微镜检查。结果有l748份检查到肠道寄生虫，总体感染率为54．05％。共检查到11种肠道寄生虫，其中感染率最高的为阿米巴原虫，其次为鞭虫和圆线虫。单虫的感染率最高为40．41％，两虫的混合感染率为l1．66％，3虫及以上的混合感染率为1．98％，其中混合感染最高的寄生虫为阿米巴原虫和鞭虫。将收集的样品按照饲养方式不同分为野生型、圈养型和动物园型的饲养方式，其感染率分别为70．47％、55．99％矛1142．76％，不同饲养方式之间非人灵长类动物肠道寄生虫的感染情况具有统计学差异(p<0．01)，野生型的猴类感染率最高。为建立流式细胞仪检测卡耶坦环孢子虫卵囊的方法，将环孢子虫卵囊液和阴性对照液按一定比例混合，分别制备不同浓度的卵囊液，同时设阴性对照组和空白对照组。各组分别经流式细胞仪筛选检测，每次分析的常量设定为20000个事件，选定聚集区域Rl且在488nm光谱下能自发蓝色荧光区域R2的事件进行分析。结果显示，环孢子虫卵囊液浓度低于l048．6个／mL时，卵囊事件量与阴性卵囊液中杂质事件量无差异，流式细胞仪对环孢子虫卵囊量的平均检测限在34～90．8个之间，即流式细胞仪在检测临床患者粪便时，分析20000个事件，在设定的参数下，事件发生数在34～90个之间即可判定为疑似，事件发生数在91个及以上即可诊断为环孢子虫感染。为鉴定和比较2007．2013年期间河南省的显微镜检测到的84份环孢子虫分离株与GenBank上不同地区的环孢子虫分离株之间的进化关系，基于l8SrRNA基因和ITS．1基因的PCR测序结果，采用clustalX和MEGA等生物学软件对其进行生物种系发育分析和同源性分析。l8SrRNA基因种系发育结果显示，所有的人环孢子虫分离株均在同一分支上，且与已经提交的人环孢子虫分离株(AFIl1183)只有一个碱基差异。ITS．1基因的种系发育分析发现，从河南分离的人环孢子虫与从危地马拉，尼泊尔，秘鲁和海地等不同地区提交的环孢子虫ITS．1基因序列差异较大。同时也显示不同分离株之间的ITS．1基因序列具有较大的变异性。为了解河南省奶牛环孢子虫的感染情况，从河南省11个不同的奶牛场采集了l229份奶牛粪第1页共6扛页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文便样品，采用显微镜直接观察和饱和蔗糖漂浮方法检测。提取样品的基因组DNA进行18SrRNA基因部分序列的PCR扩增，为区分环孢子虫和艾美尔球虫，设计了一种限制性内切酶8SpEI进行限制性内切酶片段长度多态性0i_VLP)分析与艾美球虫属区分。共发现44份阳性样品，环孢子虫的总感染率为3．58％，其中感染率最高为8周龄组，其感染率为9．6％。基于18SrRNA基因的种系发育分析表明，从河南省奶牛体内分离的环孢子虫与从广州分离的Guangzhoul株和从日本分离的Cyclosporasp．Oita株在同一个分支上。本次试验通过对奶牛环孢子虫病的流行病学和分子生物学的研究，为其生物学特性的进一步研究和防治奠定了理论基础。本次研究对我国部分地区非人灵长类动物肠道寄生虫的感染情况进行了调查，建立了流式细胞仪检测环孢子虫卵囊的方法，并对人环孢子虫和奶牛环孢子虫进行了分子鉴定和序列比对，以及种系发育分析。关键词：非人灵长类：环孢子虫；奶牛；18SrRNA基因；ITS．i基因；种系发育分析‘第2页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第一部分文献综述非人灵长类动物肠道寄生虫感染情况和环孢子虫流行病学及检测技术研究进展非人灵长类(Non-humanPrimates)动物具有许多与人类相似的生物学特征，是一种重要的物种资源，在研究物种进化中起着重要作用；同时也具有较高的观赏价值；再次作为医学生物的重要实验动物，其应用价值远超过其他种属的实验动物【l】。然而，最近兴起的生态旅游过程中人与非人灵长类动物无任何保护措施的频繁接触，可能造成人猴共患寄生虫病的传播。因此，了解和掌握己知非人灵长类动物肠道寄生虫的种类、危害及传播方式，既能科学有效地制定相关管理策略和管理办法，让人们既欣赏野生动物的美好，同时又最大限度的避免人兽共患寄生虫病的传播。环孢子虫(Cyclospora)是一种新出现的食源性和水源性传播的细胞内寄生的肠道寄生性原虫，可以引起人和动物的胃肠炎和严重腹泻。自Ashfordl21于1979年在巴布亚新几内亚的腹泻患者粪便中首次查出环孢子虫卵囊，到目前世界各地陆续有感染环孢子虫的报道。最初，环孢子虫被认为是球虫样或蓝藻样小体，随后到l994年才确定其分类地位，属于顶复门，孢子虫纲，艾美尔科pJ。环孢子虫卵囊在光学显微镜下，是一个球形的折射体，中间是桑葚胚，卵囊直径为8～101am，经改良抗酸染色多呈深红色或不着色，孢子化卵囊含有两个孢子囊，且每个孢子囊含有两个子孢子，且其卵囊壁在330．380nm紫外激发滤镜下自发蓝色荧光【41(如图1)。1990s之前仅有散在的报道，1996至1997年期间，美国和加拿大的大规模环孢子虫病暴剧5】；及2000年德国一家餐厅的环孢子虫病暴发【6】，再到2013年环孢子虫病在美国25个州的暴发，均造成了严重的危害(71，因此环孢子虫病越来越受到重视。本文从非人灵长类肠道寄生虫感染情况及环孢子虫的流行病学和检测技术方面进行综述。1非人灵长类肠道寄生虫感染情况非人灵长类动物，首先是一种重要的物种资源，在研究物种进化中起着重要作用；同时在动物园中也具有较高的观赏价值；再次由于其在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，一直作为医学生物的重要实验动物，其应用价值远超过其他种属的实验动物【I】。然而，针对最近兴起的生态旅游过程中人与非人灵长类动物无任何保护措施的频繁接触，可能造成人猴共患寄生虫病的传播可能18J。1．1非人灵长类动物肠道寄生虫感染情况1997年Eberhard等I”】从狒狒和非洲绿候体内分离出肠道寄生性原虫一环孢子虫卵囊，随后又发现该地区的三种灵长类动物(非洲绿猴、疣猴、狒狒)粪便样品检查分离到不同形态的环孢子虫卵囊。对其18SrRNA基因序列研究中显示，C．papionis，Ccolobi和Ccercopitheci的与人类的分离株有O．3～0．6％的序列差异135’50l。我国的和占龙等191在2006年对自繁猕猴的肠道寄生虫的感染情况，应用直接涂片法和饱和盐水漂浮法，查出肠道寄生虫虫卵6种，其中肠道蠕虫：蛔虫、绦虫、鞭虫、吸虫、线虫；肠道原虫：结肠小袋纤毛虫，线虫感染最严重，其次为结肠小袋纤毛虫。接下来，吕向辉等【l0】于2007第3页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文年1l～12月对陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心的川金丝猴、猕猴进行了肠道寄生虫感染情况及其种类形态的研究发现川金丝猴、猕猴肠道寄生虫的感染率分别为91．67％、100％，共检出7种肠道寄生虫，其中以鞭虫、芽囊原虫、溶组织内阿米巴感染较为严重，可见感染率之高。2008年胡延春等【¨】对I四JII绵阳地区的野生猕猴的抽样调查监测显示，感染当地野生猕猴的肠道寄生虫主要有8种，总感染率为78．0％，分别为：吸虫50．0％，毛尾线虫48．0％，蛲虫41．0％，钩虫32．0％，蛔虫26．0％，泡状带绦虫16．0％，球虫4．O％，后圆线虫4．0％。且该地区野生猕猴寄生虫感染较普遍，感染强度较大。2009年，蔡娟等112】对陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心中的珍稀野难动物进行了寄生虫感染情况及其种类、形态的观察。其中，金丝猴粪便中监测到结肠内阿米巴包囊，感染率较高。2010年纪欢f131对黄山短尾猴肠道寄生虫感染方面共发现9种肠道寄生线虫，感染l～2种者较多。以水、土经口的感染途径所占比例最多为57．78％。李健等16l】于2008～2012年间采集广西地区六家驯繁场共784份粪样，采用同样方法，结果5种原虫，5种线虫和2种绦虫：以及1种吸虫和1种粉螨，猴胃肠道寄生虫总感染率为72．4％。赵金凤等【14l对广西、河南和四川的3个猕猴养殖场共346份新鲜猕猴粪便进行检查发现，寄生虫总感染率为51．4％。河南、广西和四川圈养猕猴肠道寄生虫感染率分别为89．2％、42．2％和35．0％。1．2肠道寄生虫感染情况与饲养方式的关系2006年，和占龙等【9】对自繁猕猴肠道寄生虫的感染情况的调查发现，单笼饲养猴42．9％(幼猴，1只／笼)；50．O％(幼猴，2只／笼)；育种猴群84．0％；繁殖猴群90．0％：猴园猴100．O％。感染2种寄生虫的猕猴：单笼饲养猴14．3％(幼猴，1只／笼)；20．0％(幼猴，2只／笼)；育种猴28．0％；繁殖猴43．3％；猴园猴40．0％。感染3种寄生虫以上的猕猴：育种猴群12．0％；繁殖猴群8．4％；猴园猴33．3％。表明幼猴感染率较低，猴园猴感染率较高，其中线虫感染最严重，其次为结肠小袋纤毛虫。2009年，吕超超等【l5】对194份野生太行猕猴粪便样品，共检查出7种寄生虫，寄生虫总感染率为97．4％，寄生虫混合感染率为87．1％。赵金凤等f14】对广西、河南和四川的3个猕猴养殖场共346份新鲜猕猴粪便进行检查发现，寄生虫总感染率为51．4％。对四川绵阳地区的野生猕猴的抽样调查监测显示，感染当地野生猕猴的肠道寄生虫总感染率为78．0％t⋯，感染较普遍，感染强度较大。对黄山短尾猴肠道寄生虫感染方面共发现9种肠道寄生线虫，感染率为57．78％113】，感染l～2种者较多。广西地区驯繁场共的粪便样品，猴胃肠道寄生虫总感染率为72．4％，共检查到5种原虫【16】。2环孢子虫流行性2．1流行地区环孢子虫的感染主要集中在旅游者(表1．1)、艾滋病人和呈地方流行地区的居民(表1-2)。1995年之前仅有散在环孢子虫感染的报道。1996年到1997年间，美国和加拿大有大规模的环孢子虫病暴发，共有2944个环孢子虫感染病例【171。自2000以来，在美国、加拿大、英国、土耳其、哥伦比亚、南非等地区相继暴发，总共超过550例确诊环孢子虫病病例【7】。及2013年墨西哥报道第4页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文了一例从秘鲁飞行回来的航空飞行员感染环孢子虫的病例118】，环孢子虫病越来越越受到人们的重视。特别是2013年7月以来，截止12月2日，在美国包括纽约州在内的爱荷华州、内布拉斯加州和德克萨斯州等25个州的63l例感染环孢子虫的确诊病例，至少有8％的病例(49例)由于严重腹泻而住院，目前还没有死亡的报道【．71。我国于1995年首次报道环孢子虫感染病例，随后我国的云南、安徽、浙江等地曾有环孢子虫感染病例报告【19】。2011年，Zhou等㈣报道了河南省的住院病人的环孢子虫感染情况。环孢子虫的流行性越来越受到国内外学者的重视。可见，环孢子虫病在世界范围内流行，无论是像我国一样的发展中国家还是欧美发达国家，造成严重的经济损失，甚至危及生命健康。除了人感染环孢子虫之外，现在发现猴、鸭、鸡、犬、狒狒和奶牛等动物的粪便中也存在环孢子虫卵犁35—6’3引。表卜3标明了1990年至今环孢子虫食源性和水源性暴发的国家及地区、发病人数、发病传播媒介及来源，显示美国和加拿大的多个地区都有环孢子虫病的食源性和水源性暴发。图1．1显示了世界范围内环孢子虫流行的国家和地区，可见环孢子虫的感染在世界多个国家发生。图1．1环孢子虫在世界范围内的流行地区注；阴影部分表示曾经报道环孢子虫暴发的国家和地区Fig．I-lReportedCyclospm臼infectionintheworldNote：ShadingmeansCyclosporaoutbreaksreportedofcountriesandre百ons2．2传播途径目前尽管对环孢子虫的传播途径仍不是很清楚，但有不少研究报告认为环孢予虫主要通过水源进行传播。2003年，Dowd等【2l】在危地马拉城市周围的乡村的居民水源地检测到人环孢子虫的存在，这是首次在饮用水中发现环孢子虫，表明环孢子虫可能通过水源传播。之后，无论是用于灌溉或是蔬菜加工的水都检测到环孢子虫卵囊。从越南‘221和埃及1231的河湖水等环境水中也检测到环孢子虫阳性。在美国加利福尼亚的河水中，也检测到环孢子虫卵型2钔。Cam等【6l】通过对Hanoi地区长达1年的流行病学调查，发现饮水也是一种重要的传播方式，他们在自来水中和水龙头上第5页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文发现了环孢子虫卵囊。在被环孢子虫污染的水中游泳或者仅接触疫水可能感染环孢子虫，但是还不能确定。一项由Tram等㈤人的研究发现在越南首都河内，11．8％的市场用水和8．4％的农场草本植物样品呈现环孢子虫阳性，从农场生长的多种草本植物(罗勒、香菜、生菜、马郁兰和薄荷)都检测到环孢子虫卵囊。2013年Galvfin等【39】在西班牙某地进行了为期一年的饮水和污水中的环孢子虫感染率为9％(20／223)。有可能通过水源来传播环孢子虫病。也有报道表明，环孢子虫病也可经食物传播。1996年到1997年间，美国和加拿大有大规模的环孢子虫病暴发，共有2944个环孢子虫感染病例，对其传染源追踪调查发现，此次暴发是由于食用从危地马拉进I：I的木莓引起【171。1999年夏天，美国密苏里州发生了一次环孢子虫病的暴发，研究者们调查发现，证明该次暴发是经过食用的受环孢子虫卵囊污染的沙拉而传播13】。2000年德国环孢子虫暴发与法国和意大利南部农场生产的莴苣有关【6l。2013年美国25个州的环孢子虫暴发，到目前为止还没有确定其感染来源，但有学者认为存在以下可能，第一，从墨西哥进口污染的农产品从德克萨斯货运到北部的爱荷华州、内布拉斯加州：第二，由泰勒农场的农作物污染造成；第三，大范围的水源污染也可能导致农产品的污染I71。环孢子虫感染者的粪便中含有大量卵囊，因而粪便为该病的传染源1261。然而大量的证据表明，环孢子虫卵囊可能是直接污染蔬菜类草本植物或是通过含有环孢子虫卵囊的水体被误食而引起人体的感染。环孢子虫卵囊在23～300C的条件下贮藏7～l5天将分化为含有两个孢子囊的具有感染性的孢子化卵囊才具有传染性，所以人与人之间是否能直接传播还有待进一步研究。表1．3标明了环孢子虫食源性和水源性暴发的可能的传播媒介和传播媒介来源，显示大多与饮水和蔬菜、水果的摄入有关。2．3易感年龄2006年，Sancak掣27】在报道了土耳其5例免疫功能正常，年龄在27到67岁之间的住院病人粪便中检测到环孢子虫卵囊。王克霞等【301对安徽省不同地区人群环孢子虫感染情况调查发现有腹泻症状儿童感染率为5．62％：2013年，Tandukar掣”】对尼泊尔的在校儿童的肠道寄生虫的调查发现，环孢子虫的感染率为1．6％，高于其他年龄段的环孢子虫感染情况。2011年进行的在对河南省郑州和开封两地为期两年的住院病人的肠道寄生虫的感染情况调查显示，环孢子虫的感染率为0．70％，其中7～17岁年龄组的环孢子虫的检出率最高为1．47％t201。2013年美国的环孢子虫大暴发，其感染年龄从不到1岁至94岁，平均年龄为52岁1710环孢予虫的感染年龄应该主要集中在免疫力低下的小孩和老人，但是环孢子虫在不同地区具有不同的传播流行特点，其易感人群有所不同，也有免疫功能正常、没有出国旅行史的30岁女性住院病人粪便中检查到环孢子虫卵囊的报道。第6页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文表l-l旅游者感染环孢子虫的感染报道Tablel-lCasereportsofCyclosporainfectioninreturningtravelersa土耳其(2)，印度(2)，印度尼西亚(I)，马达加斯扣岛(1)：b越南(2)，印度(3)，巴厘岛(2)，爪哇岛(1)，巴基斯坦(2)，多米尼加(3)：C斯里兰卡(2)，泰国(I)，巴基斯坦(2)，秘鲁(1)，印度尼西亚(1)，印度(1)，南非(1)：d巴布亚新几内亚(1)，澳大利亚(1)，巴厘岛(3)：e多米尼加(4)，墨西哥(2)，危地马拉(1)，印度(4)．马来西亚(1)，印度尼西亚(5)，斯里兰卡(I)，土耳其(1)，加蓬(1)：f越南(I)，土耳其(I)，黎巴嫩(I)，哥伦比亚(1)，东欧(1)：g印度尼西亚(11)，尼泊尔《8)，所罗门群岛(1)，英国(3)，柬埔寨(2)，泰国(2)，远东(1)，东南亚(2)，印度(9)，东南亚(1)，摩洛哥(1)，尼日利亚(1)，坦桑尼亚(I)，土耳其(5)，墨西哥(1)，孟加拉国(4)，印度(2)，墨西哥(2)，保加利亚(1)，印度尼西亚(1)，尼泊尔《1)：h印度(6)，柬埔寨(1)，墨西哥(1)。所罗门群岛(1)，澳大利亚(1)。第7页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文表1．2无旅游史人环孢子虫感染情况Tablel-2CasereportsofindividualswithCyclosporainfectionandwithouttravelinghistory2．4流行季节环孢子虫病的暴发具有明显的季节性，多发生于温暖多雨的夏秋季节，这可能与感染性的孢子化卵囊需要一定的温度才能孢子化有关，又由于夏秋季节人们与水接触频繁而且有生食蔬菜和水果的习惯，同样为环孢子虫的传播创造了条件。在秘鲁，经过5年的调查表明，环孢子虫病发生于1～7月，而其发病高峰集中在4～6月。统计认为1995～1999年美国和加拿大环孢子虫病的暴发97．8％集中在晚春和初夏季节，4～7月为发病高峰期171。Hoge-等1281调查发现尼泊尔的环孢子虫感染主要发生在雨季，Bern等‘31I在危地马拉通过粪便样品监测证实该病流行高峰期在7fl份。2006～2009年期间，Ozdamarl321等在土耳其伊斯坦布尔进行了人环孢子虫(ecayetanensis)病流行病学调查，使用光学、荧光显微镜和改良抗酸染色的方法来检查环孢子虫卵囊，阳性样品扩增基因组的ITS．1区域进行确认，调查发现环孢子虫病集中发病与7月份的15天内。2007年至2008年，对开封地区临床病人进行了为期一年的肠道寄生虫调查，发现环孢子虫感染率为0．49％(20／4067)，并且感染具有明显的季节性，主要集中于夏秋季(7．11月)。2013年美国环孢子虫的大暴发，其感染者主要集中于6月中旬和7月中旬【_丌。可见环孢子虫的暴发流行还是有一定的季节性。第8页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第9页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3分子流行病学及遗传特性3．1分类学目前为止，环孢子虫己知的有19个确定种【34J(Cglomericola、Ccaryolytica、Cviperae、Cbabaulti、Cscinci、Ctropidonoti，Czamenis、Cyclosprasp、Cn&iae、Ctalpae、Cmegacephali、C．ashtabulensis、C．parascalopi、C．angimurinensis、C．cayetanensis、C．cercopitheci、C．colobi、Cpaphgnis、c．schneiderin．sp)，宿主包括啮齿类、爬行类、非人灵长类和人类‘431等(见表1-4)，还在哺乳动物和禽类发现一些未定种134’36“91。3．1．1Ccayetanensis自首次发现环孢子虫卵囊后，随后各国研究人员在病人粪便样本中均有相似发现，主要集中在一些卫生条件较差和存在人量免疫功能缺陷病人的地区，其中大部分患者有急性腹泻症状。由于其表面超微结构与单细胞生物蓝绿色藻类相似，起初被命名为为“Cyanobacterdum．1ikebodies”(CLB)，随后研究发现其含有2个孢子囊，每个孢子囊含有2个子孢子，因此将其归类为环孢子虫属【3】。Ortega在文章中首次使用c．cayetanensis这个名称。1994年Ortega等利用电子显微镜照片对卵囊细节进行描述，最终确立了Ccayetanensis这个种并沿用至今。c．cayetanensis卵囊为球形，直径8～lOpm，卵囊壁厚度为l13nm，分内外两层，外壁较厚为63lnm，内壁约为50hm。每个卵囊含有两个孢子囊，孢子囊呈卵圆形，大小为41unx6um，每个孢子囊含有两个子孢子。环孢子虫卵囊在紫外线照射下卵囊能够自发荧光，在365nm下发深蓝色的荧光，在450～490nm下发薄荷绿色的光【201，经改良抗酸染色法染色的多p囊呈暗红色或不着色。3．1．2Ccercopitheci，Ccolobi，Cpapionis1997年Eberhard掣351从狒狒和非洲绿候体内分离出未孢子化的环孢子虫卵囊，随后又发现该地区的三种灵长类动物(非洲绿猴、疣猴、狒狒)粪便样品检查分离到不同形态的环孢子虫卵囊。根据三种卵囊的宿主种类、卵囊形态、孢子化过程及分子生物学方法分析，Eberhard等于2005年将它们分别命名为Ccercopitheci．Ccolobi．Cpapion括。Ccercopitheci寄生于非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)，卵囊呈圆球形，外壁光滑，直径为8～10“m，平均为9．2Inn，卵形指数为1．5，在紫外线照射下自发荧光。孢子囊呈柠檬状，大小为6～79mx4～59m，含有2个子孢子，两端逐渐变细，卵囊内含有成簇的球状残体。C．colobi寄生于东黑白疣猴(Colobusguereza)，卵囊呈圆球形，外壁光滑，直径8～9岬，平均8．3岬，卵形指数为1．66，在紫外线照射下自发荧光。孢子囊呈柠檬形，大小为7～8岬×4～5岬，含有2个子孢子，两端逐渐变细，卵囊内含有成簇的球状残体。第10页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文表1．4目前已报到环孢子虫种的宿主、卵囊大小以及内生发育阶段Table1．4SofarCyclosporaspecies埘minformationonhost-morphometriccharactersofoocystSandorganlocation种类Species宿主Host卵囊大小(“m)Oocystsmorphometric内生发育阶段organlocationCpapion括寄生于狒狒(Papioanub括)，卵囊里圆球形，外壁光滑，直径为8～109m，平均8．8pro，卵形指数为1．66，在紫外线照射下自发荧光。孢子囊呈柠檬形，大小为7～8岬×4～5岬，含有2个子孢子，两端逐渐变细，卵囊内含有成簇的球状残体。第l1页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．1．3Cyclosporaschneider2005年，Laillson【341对筒蛇的环孢子虫进行了描述，24．26。C需要大约一周的时间完全孢子化，成熟卵囊大约19．8×16．6Inn(15．1×13．8～25．7x20．1)，卵形指数为1．2(1．0～1．3)，不含卵囊残体或极体。孢子花卵囊大小为13．6x9．4pm(11．3x8．3～15．1×9．9)，卵形指数为1．4(1．2-1．5)。3．1．4牛源环孢子虫牛源环孢子虫卵囊呈球型，直径6pm～10pm。直接涂片时可见卵囊内含折光性较强的成团小球体，呈桑椹胚状，淡绿色。碘液染色不着色。新排出的卵囊均未孢子化，需要置于2．5％重铬酸钾溶液培养后，可见部分卵囊孢子化，内含2个孢子囊。经改良抗酸染色后，卵囊着色变化较大，呈淡红色、深红色或不着色。与未染色卵囊相比，染色后卵囊仍呈圆形，但囊内结构不清，体积有所减小。经PCR．RFLP鉴定为环孢子虫属寄生虫【36】。3．1．5鸭源环孢子虫2010年，程家林【4明等报道了鸭粪中疑似于环孢子虫，直接涂片显微镜观察时可见卵囊大小约为8～101am，其内含折光性较强的成团小球体，呈桑椹胚状，淡绿色；孢子化后卵囊有两个孢子囊，每个孢子囊有两个子孢子；经改良抗酸染色卵囊着色不均，呈深红色或淡红色或不着色。3．1．6犬源环孢子虫2010年，岳彩玲㈣等报道了犬源环孢子虫卵囊呈球形，直径为8～101ara。显微镜检查时可见卵囊细胞质呈淡绿色，内含折光性较强的成团状小体，呈桑椹胚状。改良抗酸染色后，卵囊仍然呈球形，但着色不一，呈深红色、淡红色或者不着色。孢子化卵囊内含两个孢子囊，每个孢子囊内含有两个子孢子。经过荧光显微镜检查发现，犬源环孢子虫在紫外光激发下，边缘发出蓝色光环。3．2分子生物学特征依靠传统的表型分析已不能满足病原体丰富的遗传变异及公共卫生快速反应体系的需求，基于现代分子生物学的基因分型技术以其良好的分辨力和稳定性，因而建立相应的基因信息库，诊断与鉴别新发、输入、变异及未知病原体已经逐渐成为热点。微生物的基因组中的保守区和多变区域的特征已经被广泛研究，进行相关的遗传特性研究。利用分子生物学工具研究的环孢子虫种只有从哺乳动物中获得的5种，包括寄生于人类的Ccayetanensisll71，寄生于非人灵长类的Ccercopitheci、ccolobi、c．papionisl351和寄生于奶牛的牛源环孢子虫【361(未定种)。应当注意的是18SrRNA基因具有高的保守性，因此，18SrRNA基因对区分Ccayetanensis或者其他环孢子虫种的不同分离株之间的亲缘关系是十分有用。已经有研究者利用环孢子虫18SrRNA基因区分环孢子虫和其他的顶复门寄生虫I”1。另外，分析来源于人类和狒狒的环孢子虫分离株的l8S核糖体RNA(rDNA)基因显示有1．6～1．7％的差异，然而人类和狒狒的环孢子虫的分离株的差异分别有0．78％和0．73％t3引。在另一一项研究中显示，Cpapionis，C．colobi，和Ccercopitheci的18Sr刚A基因与人类的分离株有0．3～0．6％的序列差异1351。针对其他哺乳动物的环孢子虫的18SrRNA基因的研究也在进行，主要集中在非人灵长类和奶牛。高振永【40】等，根据猴源环孢子第12页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文虫18SrRNA基因序列，设计一对保守引物，进行了特异性和敏感性试验。随后，Li【4l】等对从肯尼亚捕获的狒狒样品中，扩增了18SrRNA基因的部分序列，发现Cpapionis感染率为17．9％，并对其进行了分子种系发育分析。2006年，肖淑敏【36】等利用巢式PCR技术对首次在牛体内发现的形态学特征与人环孢子虫极为相似的牛源环孢子虫的18SrRNA基因进行了扩增。由于18SrRNA基因的高度保守性，限制了其区分亲缘关系较近物种的能力，因此要进行环孢子虫属内鉴定，需要相对多态的序列作为靶基因。已经有运用高变异的ITSl区分Ccayetanensis和cpapionis。Hoge掣28】运用高变异的ITS-l区域序列区分人环孢子虫(ccayetanensis)和狒狒环孢子虫(Cpapionis)，发现ITS．1序列为高度变异的区域，人环孢子虫和狒狒环孢子虫的ITSl基因序列存在差异。考虑到Ccayetanensis分离株的ITSl序列的变异性(0～6．5％)，内部转录间隔区(ITS)美国分离株(8．3％)比危地马拉分离株(3．8％)序列变异大，但是序列和地理差异没有相关性。从没有海外旅游历史的美国人获得的样品观察到序列有高变异性显示，环孢子虫主要呈地方流行性。5份1996年在美国暴发时获得的分离株的ITSI序列是相同的，然而在危地马拉和秘鲁分离株的ITSl序列是不同的。7份危地马拉分离株的分离株与佛罗里达州的分离株相刚31。肖淑划42】利用PCR技术对首次在牛体内发现的形态学特征与人环孢子虫(ccayetanensis)极为相似的牛源环孢子虫的ITS．1+序列进行了扩增。在所有的ITSl基因序列中，共感染或多拷贝也许能解释ITSl区域的变异性较大的原因。人环孢子虫(Ccayetanensis)和狒狒环孢子虫(Cpapionis)的5．8SrRNA基因已经测序完成，经过校正以后的序列显示其高度的保守性【431。2013年，Sulaimant441等，建立了一种基于HSP70蛋白基因的快速检测人环孢子虫(Ccayetanensis)的方法，结果显示HSP70蛋白基因在不同分离株之间未发现存在多态性。环孢子虫卵囊需要在外界适当的条件下分化一段时间，才能发育为含有两个子孢子的具有感染性的孢子化卵囊。在食物或是水中的环孢子虫卵囊是否具有感染性，对于环孢子虫的传播感染是十分重要的。虽然PCR能有效地在不同样品中检测环孢子虫，但是不能区分孢子化和未孢子化卵囊‘361。4检测技术环孢子虫感染者的粪便中含有大量卵囊，为该病的主要传染源【261。目前，研究者普遍怀疑环孢子虫的感染是由于患者食入被环孢子虫卵囊污染的罗勒、香菜、生菜、马郁兰和薄荷等草本植物类食物，或饮用被环孢子虫卵囊污染的水源，但因随粪便排出的卵囊须在适宜的环境中数天至数周孢子化后才具有感染性。环孢子虫的检测对于环孢子虫的流行病学研究有着特殊而重要的意义，为环孢子虫的控制和防治提供重要的依据。4．1常规检测技术环孢子虫常规的检测技术包括显微镜检测、改良抗酸染色和孢子化试验等方法。环孢子虫在光学显微镜下，环孢子虫卵囊是一个球形的折射体中间是桑葚胚，卵囊直径为8～101am，经改良抗酸染色多呈深红色。孢子化卵囊含有两个子孢子，且每个孢子囊含有两个子孢子。第13页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文由于环孢子虫卵囊通常在草本植物和饮水中的含量较少，在使用常规显微镜检测和改良抗酸染色检测时，需要将植物或是水体中的环孢子虫卵囊浓集，另外，传统的卵囊检测方法敏感性低、检测时间长、易造成检测人员眼疲劳、受到检测人员知识水平限制，以及粪便中的杂质会造成假阳性或假阴性等影响检测结果。4．2流式细胞术近年来出现了一种新的检测环境中和临床样品中环孢子虫卵囊的方法，即流式细胞术。在荧光显微镜下使用330～380am的滤光器环孢子虫卵囊自发些微蓝光，当使用450～490hill滤光器有绿色荧光0201。这个特性已经用于环孢子虫的检测和流行病学的调查。Dixon等‘4q利用流式细胞计量术检测人粪便中的环孢子虫卵囊，结果显示该方法的敏感性比显微镜检查法高。由于粪便样品的时间和贮藏条件会影响卵囊荧光的强度，可能会影响检测结果。血清学筛选试验同样也可以用于环孢子虫的检测，有利于大范围的环孢子虫流行病学调查，但是由于目前还没有针对环孢子虫的特异性抗体，限制了其广泛应用。分子生物学方法具有灵敏性和特异性的优点，环孢子虫不同分离株之间的基因组学的可以追踪传染来源，在环孢子虫病的分子流行病学调查和检测研究中有重要的意义。4．3分子生物学方法微生物的基因组中的多变区域的特征已经被广泛的研究以了解它们在流行病学中的地位，分离株之间的基因组学的可以容易追踪传染来源。4．3．1巢式PCRHelmy等【381对显微镜镜检和巢式PCR(nest-PCR)检测环孢子虫卵囊两种方法的比较显示，巢式PCR方法具有更高的特异性和敏感性。Orlandit481等基于18SrRNA基因部分序列成功PCR扩增了木莓样品中的环孢子虫，灵敏度可达30个卵囊／1009；同样利用PCR方法检测木莓、罗勒、莴苣中的环孢子虫(Ccayetsanensis)卵囊，灵敏度可分别达到40～100个／1009。针对其他哺乳动物的环孢子虫的18SrRNA基因的研究也在进行，主要集中在非人灵长类【501和奶牛‘361，主要集中在环孢子虫的报道和分子诊断方面。由于ITS基因转录但不编码蛋白，因此它不具有结构功能的限制。长期以来，ITS基因已经用于植物基因组和进化的研究，同样ITS基因也可以作为环孢子虫分子鉴定的靶基因。针对ITS．1靶基因，许多学者扩增了多种环孢子虫的ITS．1基因序列。2000年，Adam等【511研究了与木霉进口有关的环孢子虫暴发的病例分离株、危地马拉和秘鲁环孢子虫病的分离株进行ITS．1基因序列比较分析，结果发现单克隆基因组的ITS．1区域存在多样性。Ozdamarl321等在土耳其伊斯坦布尔进行了人环孢子虫阳性样品的ITS．1基因进行了扩增。ITS．1基因具有高的拷贝数，序列多变和长度适中等优点，致使这个基因成为基因分型的理想靶基因。4．3．2PCR．RFLP近年来，PCR-RFLP方法被广泛用于各类寄生虫的分类鉴定，可以有效地区分种间和种内的差异，是研究亲缘关系较近的物种间和物种内遗传分化的有力工具。2003年，Shields等l冽以18S第14页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文rRNA基因为靶基因，并使用限制性内切酶AluI，建立了一种检测环境水中的环孢子虫的巢式PCR-RFLP方法，可以将环孢子虫的目的序列与可能发生交叉反应的其他序列区别开来。肖淑敏掣36】以进化速度相对较慢的18SrRNA为靶基因，设计了两对相对保守的引物利用巢式PCR进行扩增，并以rpnI酶对PCR产物进行RFLP分析，结果显示扩增的18SrRNA的片段大小为501bp，不含有KpnI酶切位点，与反刍兽艾美耳球虫的酶切图谱具有明显的差别。4．3．3PCR．寡核苷酸连接法Xiao等‘521在建立了一种检测临床样品中环孢子虫PCR产物的PCR．寡核苷酸连接法(PCR-oligonucleotideligationassay，PCR-OLA)，对牛源环孢子虫进行检测，并且将PCR-OLA与常规的PCR-凝胶电泳进行了比较，结果显示PCR．OLA比普通的PCR．凝胶电泳的敏感性高，能够准确地鉴别单个核苷酸之间的不同，而且PCR．OLA在对牛源环孢子虫的临床检测上，具有简单、快速和准确的优点，能够检测出最少0．5ngDNA。4．3．4多重PCROrlandi等【53】利用多重PCR(multiplexPCR)对环孢子虫和艾美耳球虫进行了区分。该试验根据18SrRNA的单核苷酸多态性(single·nucleotidepolymorphisms，SNPs)设计了一系列种属特异性引物，通过严格的退火和延伸条件，这些SNP引物可以将环孢子虫和艾美耳球虫成功地区分开来。HusseinI“】利用多重PCR对腹泻儿童可能感染的几种环孢子虫即人环孢子虫、长尾猴环孢子虫(C．cercopitheci)、疣猴环孢子虫(C．colobi)、狒狒环孢子虫进行了分子鉴定，并与常规检测方法和巢式PCR进行了对比，并对来自35个患者体内环孢子虫的18SrRNA的单核苷酸多态性进行鉴定，结果只有多重PCR能够将同时感染4种环孢子虫的患者诊断出来，电镜显示从这个患者体内分离的4种环孢子虫卵囊并没有形态上的差异。2010年，Lee等㈣建立了一种简单，快速，高效的多重PCR用于环孢子虫的检测，检测限位101～102个卵囊。随后，Taniuchi等【561检测了多重PCR的特异性，表明其对于环孢子虫暴发有用的快速检测方法。4．3．5实时定量PCRVarma等1571第一次报道了实时定量PCR(real．timequantitativePCR，RT．PCR)技术在环孢子虫卵囊检测上的应用，他根据环孢子虫18SrRNA基因序列设计了一对特异性引物和两个荧光标记的环孢子虫杂交探针，结果显示实时定量PCR技术最少可以检测到51aL反应体系中相当于一个环孢子虫卵囊的DNA。此外，针对环孢子虫卵囊的外壁难于溶解和样品中存在较多影响PCR结果的制约因素，新的改进方法不断出现。Lalonde掣581建立了一种高度敏感和特异的检测环孢子虫卵囊的PCR方法，该方法对水和罗勒洗涤物中不同数量(卵囊数分别为1000、100、lO、1)的卵囊进行DNA的反复抽提，并进行PCR扩增。结果显示，水和罗勒洗涤物中的卵囊数量越多，用于成功扩增PCR所要提取的DNA次数就越少。第15页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文5小结非人灵长类由于其特殊的分类地位以及生活方式，生活史相对简单的阿米巴原虫以及驱虫药驱杀效果不佳的线虫已经成为了非人灵长类动物主要感染的寄生虫种类，现在应着眼于选择更为合适的驱虫药并完善驱虫程序以控制目前的流行状况。值得一提的是，在猴群中感染的肠道寄生虫中大部分可作为人兽共患寄生虫病病原体，因此在注重猴群健康、提高实验动物品质的同时，防范人与猴群之间由于频繁接触造成的人兽共患寄生虫疾病传播也是具有重要的公共卫生意义。环孢子虫病例经常在世界各地散发感染，但是1996年美国和加拿大的大暴发以及2013年美国的环孢子虫的暴发，引起越来越多的研究者的重视。我国的环孢子虫感染的报道也时有发生，但其来源还未完全清楚，其流行病学和检测研究有待更进一步。因此，通过严格控制水源和食物避免环孢子虫的污染；加强检疫，建立方便可靠地检测方法，避免随食品进口或长途运输而传播环孢子虫，成为防治的重点。另一方面，通过环孢子虫的流行病学特点和分子生物学手段追溯其来源也成为研究的热点和防治的基础。第16页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第-gg分非人灵长类动物肠道寄生虫感染情况调查1引言非人灵长类(Non．humanPrimates)动物具有许多与人类相似的生物学特征，与人类的遗传物质有75％．98．5％的同源性。非人灵长类动物首先是一种重要的物种资源，在研究物种进化中起着重要作用：同时也具有较高的观赏价值，尤其是在动物园中；其次由于其在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，一直作为医学生物的重要实验动物，其应用价值远超过其他种属的实验动物【l】。然而，针对最近兴起的生态旅游过程中人与非人灵长类动物无任何保护措施的频繁接触，可能造成人猴共患寄生虫病的传播可能【8】。因此，了解和掌握已知非人灵长类动物肠道寄生虫的种类、危害及传播方式，即能科学有效地制定相关管理策略和管理办法，让人们既欣赏野生动物的美好的同时，又最大限度的避免人兽共患寄生虫病的传播。本次调查旨在了解我国部分地区非人灵长类动物的肠道寄生虫的感染现状，为疾病防治及人兽共患寄生虫病原的控制提供参考依据。2材料与方法2．1样品采集2009～2013年之间，从我国11个省市自治区的16个不同地方，采集60余种非人灵长类动物粪便样品3234份。将采集的样品按照饲养方式的不同分为野生型、圈养型和动物园型饲养方式，并记录种类，尽快带回实验室置4。C冰箱保存，显微镜检测。采集的样本数：南阳猕猴场为357份；四川绵阳猕猴场为552；广西猕猴场为873份；广东食蟹猴场为328份；济源中华猕猴园为254份；昆明实验动物中心为117份；石家庄市动物园为102份：武汉市动物园为66份；太原市动物园为65份；北京市动物园为72份；长沙市野生动物园为75份：上海市动物园为6l份；上海市野生动物园为67份；成都市动物园为73份；昆明市动物园为28份；洛阳市动物园为144份；详见表2-l。2．2材料2．2．1主要仪器和耗材Olympus显微镜，购自上海光学仪器厂；TDL．5．A大容量离心机，购自上海安亭科学仪器厂：60目铜筛；载玻片；天平；盖玻片；漏斗；吊环；小烧杯等。2．2．2主要试剂及配制卢戈氏碘液的配制：碘lg碘化钾29蒸馏水300mL配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。第17页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文饱和蔗糖溶液的配制：食用白糖5009蒸馏水350mL比重为1．282．3检查方法2．3．1卢戈氏碘液染色法操作步骤：①取新鲜混合粪便109加5倍的自来水，浸泡10min：②搅匀，用60目铜筛过滤：③滤液置于离心管中以3000rpm离心10min，弃去上清液；④置于载玻片上一滴(约0．SmL)卢戈氏碘液；⑤取少许沉淀物与卢戈氏碘液混合均匀；⑥加盖玻片后400x倍光学显微镜下观察。2．3．2饱和蔗糖溶液漂浮法操作步骤：①将上一步骤的沉淀加入10倍量饱和食糖漂浮液，搅匀，以3000rpm离心10min后取出；②用自制铁丝圈蘸取表层漂浮液置于载玻片上；③加盖玻片后10x40倍光学显微镜下观察。2．4数据统计与分析所有调查数据采用卡方检验。3结果与分析3．1肠道寄生虫总体感染情况2009-2013年之间，从共收集3234份非人灵长类动物粪便样品，其中l748份检查到肠道寄生虫，肠道寄生虫的总体感染率为54．05％，部分虫卵或卵囊见图2．1。本次调查显微镜共检查到11种肠道寄生虫(见表2．1)，分别为球虫、贾第虫、隐孢子虫、鞭虫、圆线虫、泡翼线虫、蛲虫、绦虫、阿米巴原虫、吸虫、螨虫，其感染率分别为：1．95％(63)，1．18％(38)，O．68％(22)，19．72％(638)，6．34％(205)，0．77％(25)，0．15％(5)，0．28％(9)，32．59％(1054)和其他的还有吸虫和螨虫1．05％(34)。其中感染率最高的为阿米巴原虫32．59％，其次为鞭虫19．72％和圆线虫6．34％。在混合感染率的调查中(见表2．2)，单个寄生虫的感染率最高为40．4l％，两个寄生虫的感染率为11．66％，三个及以上的感染率为1．98％。其中混合感染最高的寄生虫为阿米巴原虫、鞭虫和圆线虫。第18页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文图2．1本次调查发现的部分虫卵或是卵囊图400×A：隐孢子虫卵囊；B：贾第虫包囊；C：阿米巴原虫包囊；D：球虫卵囊；E：鞭虫虫卵；F：卵生圆线虫虫卵；G：胎生圆线虫虫卵；H绦虫卵Fig．2-lPartialofoocystsoreggsobservedinthisinvestigationA：Oyptosporidiumoocyst；B：Giardiacyst；C：dmoebidacyst；D：Coccidianoocyst；E：TheeggofTrichut‘istrichura；F：TheeggofStrongylid：G：TheeggofStrongylid：H：Theeggoftapeworm第19页共64页 墨蔓蔓星至导．t"-蜀竺=窝2．t"qN∞胬圣=·*·-·-·-冷譬譬一一景小·一一N寸一-·寸誊2·寸一*凑蕊一寸·-·刽暇葛衩隧oN昧oAI苗比Q皇∞们2d)8‘‘-：¨30Z掣区惦架》。燃式no．'【摹凸岬Nn零∞N．o器”_1．0摹瓮．o谭p寸n．崞摹N卜．岔一摹∞母．o装∞1．I装n夺．_l^世督一N^甚餐v瓮∞寸卜一寸nNn褂臻餐#粕，回霉臀怛置建圆S臀怛蜜嘧圜S臀忙赣餐圆赛臀州寄仨赠叫匾彝臀怛辫q圜霎需趟鼠怛念半圆器臀倍佞暑圆器臀忙隧长强S需怛赂饭圆S臀怛趟搽悼0导霉臀繇冰墨嘧圜《蘸抖d]赠蟋鎏纂潮担长L鎏慧蕊般L鎏《蘸医婚¨『臣辑黑蕊置怔∞矗暑。单球日opo暑《q隧印*宦暑J0李。口日卜q臻_L—墨o≥，口一山叶。口o_日—IIDZ口一。一}毗口—口．I-∽I_tI-I^v>≯Q一工≥警、鼍、蕊ko鲁9qh6时一它日一。口一一它一。uoU氆塔q婿璐赠q餐圈甚器qm恩篮q捺眍q嚣西m嚣仍JeQIe暑∞旦uI芎∞mQ>E粼熏q州韶冥}窿盘。口u拦Il_籁寐馋啪、罱IsQ一(III≈m籁疃悱∞QI。D△∞口。一芑拦II一称茫臻餐对口互u眉阱IIo罨ugu基o∽写Is旦一l盆高c甾∞旦II=o∞暑曼∞口尘u曾IIIsu苗IlIIJ山每暑罩q-coZu二■一曲u一号卜越墼稞镣珂州雅翔鼙粼半嗽、r特凶曾求箍圃裸：琳仪袋迥扑州妖窿书匿哩!oN扑K爿《怔暮万方数据 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．2不同地区寄生虫感染情况采集的l1个省市自治区的16个不同地方的3234份非人灵长类动物的粪便样品中，南阳猕猴场感染率为61．06％；四川绵阳猕猴场感染率为47．10％；广西猕猴场感染率为67．58％；广东食蟹猴场感染率为32．01％；济源中华猕猴园感染率为70．47％；昆明实验动物中心感染率为63．25％；石家庄市动物园感染率为47．06％；武汉市动物园感染率为63．64％；太原市动物园感染率为36．92％；北京市动物园感染率为45．83％：长沙市野生动物园感染率为46．67％；上海市动物园感染率为40．98％；上海市野生动物园感染率为35．82％；成都市动物园感染率为13．70％：昆明市动物园感染率为57．14％；洛阳市动物园感染率为45．14％；详细情况见表2．2。从图2．2可以清楚的看到感染率最高的地区分别为济源中华猕猴园70．47％，广西猕猴场67．58％和武汉市动物园63．64％；感染率最低的成都市动物园也13．70％；平均感染率为54．05％。可见非人灵长类动物的肠道寄生虫的感染比较普遍存在。图2．2不同地区非人灵长类肠道寄生虫的感染率Fig．2-2TheNon-humanPrimatesinfectionratioofintestinalparasitesindifferenceplaces注：l：南阳猕猴场2：绵阳猕猴场3：广西猕猴场4：广东食蟹猴场5：济源中华猕猴园6：昆明实验动物中心猕猴7：石家庄市动物园8：太原市动物园9：北京市动物园10：武汉市动物园ll：长沙市野生动物园12：上海市动物园13：上海市野生动物园14：成都市动物园15：昆明市动物园16：洛阳市动物园17：平均感染率Note：l：Nanyangmacaquesfarm2：Mianyangmacaquesfarm3：Guangximacaquesfarm4：Guangdongmacaquesfarm5：Jiyuanmacaquesfarm6：Kunmingexperimentalanimalcenterofrhesusmonkey7：ShijiazhuangZOO8：TaiyuanZOO9：BeijingZOO10：1l：WuhanZOO12：ShanghaiZoo13：Shanghaiwiidlifepark14：ChengduZOO15：KunmingZOO16：LuoyangZOO17：theaverageinfectionrate第21页共64页 万方数据表2-2不同地区非人灵长类肠道寄生虫混合感染情况Table2-2TheNon-humanPrimatesmixedinfectionstatusofintestinalparasitesindifferenceplaces样品数总感染数单虫感染两虫感染3个及感染率类别，地点以上InfectioSampleInfectionSingleTwo以上Category／place‘sizeNO．parasiteparasitesAbove3ratio注：“-”表示阴性Note．”-”expressnegative3．3不同饲养方式肠道寄生虫的感染将采集的样品按照饲养方式的不同分为野生型、圈养型和动物园型饲养方式，本次采集的圈养型猴类共计2227份，其中1247份检查到肠道寄生虫感染，感染率为55．99％；野生型猴类共计254份，其中179份检查到肠道寄生虫感染，感染率为70．47％；动物园型猴类共计753份，其中322份检查到肠道寄生虫感染，感染率为42．76％；详见表2．3。不同饲养方式非人灵长类动物肠道寄生虫的感染情况具有统计学差异(p<0．0l卡方值=69．60)，由图2．3可知野生型的猴类感染率最高为70．47％，其次为圈养型猴类为55．99％，感染率最低的未动物园性的猴类为42．76％。第22页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文表2-3不同饲养方式非人灵长类肠道寄生虫感染情况Table2-3TheNon-humanPrimatesinfectionstatusofintestinalparasitesindifferencefeedingway图2-3不同饲养方式非人灵长类肠道寄生虫感染情况Fig．2-3TheNon-humanPrimatesinfectionstatusofintestinalparasitesindifferencefeedingway4结论与讨论4．1非人灵长类动物肠道寄生虫感染情况吕向辉等【101于2007年1l～12月采用生理盐水涂片、碘液染色、铁苏木素染色法对陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心的川金丝猴、猕猴进行了肠道寄生虫感染情况及其种类形态的研究发现川金丝猴、猕猴肠道寄生虫的感染率分别为91．67％、100％，共检出7种肠道寄生虫，其中以鞭虫、芽囊原虫、溶组织内阿米巴感染较为严重，可见感染率之高。2010年纪欢I】3】对黄山短尾猴肠道寄生虫感染方面共发现9种肠道寄生线虫，感染1～2种者较多。以水、土经口的感染途径所占比例最多为57．78％。李健等1161于2008～2012年间采集广西地区六家驯繁场共784份粪样，同第23页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文时采用同样方法，结果5种原虫，5种线虫和2种绦虫；以及1种吸虫和1种粉螨，猴胃肠道寄生虫总感染率为72．4％。本次调查的非人灵长类动物肠道寄生虫共检查到阿米巴原虫、鞭虫、圆线虫，等12种肠道寄生虫，总体感染率为54．05％，较之前的报道总体的感染率稍低。其中肠道原虫的感染率相对较高，以阿米巴原虫感染为主，与之前的报道结果相同。4．2肠道寄生虫感染情况与地区的关系赵金凤等【141对广西、河南和四川的3个猕猴养殖场共346份新鲜猕猴粪便进行检查发现，寄生虫总感染率为51．4％。河南、广西和四川圈养猕猴肠道寄生虫感染率分别为89．2％、42．2％和35．0％。本次调查的河南、广西和四川的圈养非人灵长类肠道寄生虫的感染率分别为61．06％、67．58％和47．10％，但均以阿米巴原虫和鞭虫为主要感染虫种。4．3肠道寄生虫感染情况与品种的关系2009年报道【l5】的194份野生太行猕猴粪便样品，寄生虫混合感染率为87．1％：鞭虫、泡翼线虫、圆线虫3种线虫混合感染率为7l％，同时感染其中2种的占42％，同时感染3种的占29％。本次调查发现的混合感染率为13．“％，其中以阿米巴原虫、鞭虫和圆线虫的混合感染最为普遍。4．4肠道寄生虫感染情况与饲养方式的关系2009年，吕超超等fl5】对194份野生太行猕猴粪便样品，共检查出阿米巴原虫、等孢球虫、鞭虫、圆线虫，等7种寄生虫，寄生虫总感染率为97．4％。本次对野生中华猕猴园254份粪便样品的调查发现，共发现阿米巴原虫、鞭虫、圆线虫、泡翼线虫及球虫5种寄生虫，其总体感染率为70．47％，为三种饲养方式中感染率最高的。2011年，赵金凤等【591对广西、河南和四川的3个猕猴养殖场共346份新鲜猕猴粪便进行检查发现，寄生虫总感染率为51．4％。而本次调查的圈养猴类肠道寄生虫的感染率为55．99％，与之前的报道稍高。杨楠等【621．T-2011年对濮阳市动物园共85份粪便样品进行调查，共发现7种肠道寄生虫，总感染率56．5％。而本次调查的圈养猴类肠道寄生虫的感染率为42．76％，与之前的报道稍低。此次调查结果显示，生活史相对简单的阿米巴原虫以及驱虫药驱杀效果不佳的线虫已经成为了非人灵长类动物主要感染的寄生虫种类，现在应着眼于选择更为合适的驱虫药并完善驱虫程序以控制目前的流行状况。值得一提的是，在猴群中感染的肠道寄生虫中大部分可作为人兽共患寄生虫病病原体，因此在注重猴群健康、提高实验动物品质的同时，防范人与猴群之间由于频繁接触造成的人兽共患寄生虫疾病传播也是具有重要的公共卫生意义。第24页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第三部分环孢子虫流式细胞仪检测方法的建立1引言环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)是一种新现的肠道原虫，寄生于人肠道上皮细胞内，可引起人体腹泻、肠痉挛、食欲减退等胃肠炎症状，世界范围内传播流行141。光学显微镜下，环孢子虫卵囊呈球形，平均大小为8．6肛m(7．7um～9．9um)，内含成团颗粒状折光小体，孢子化卵囊内含有两个孢子囊‘”1。环孢子虫卵囊在紫外荧光显微镜(uV)330nm～365ni／1光谱下自发绿色荧光，在450姗～490nln光谱下自发蓝色荧光‘41，使用荧光显微镜检测卵囊比在普通光学显微镜下检出率高2倍以上，尤其是检测卵囊量较少时‘631。近年来流式细胞计量术常用于检测环境中和临床粪便样品中的病原微生物，该法敏感性高，特异性强。根据环孢子虫卵囊可自发荧光的特性，本试验采用流式细胞仪激发488nln光谱，对环孢子虫卵囊进行筛选检测，设定SSC(侧向角散射)、FSC(前向角散射)和FLI(FITC绿色荧光通道)3个参数对不同浓度环孢子虫卵囊液中卵囊含量进行数据处理和统计分析，以期为临床上人体环孢子虫卵囊的检测提供依据。2材料与方法2．1材料2．1．1样本来源2011年8月从开封某医院收集的一名65岁男性腹泻病人粪便样品，经显微镜检查和基于18srRNA基因的PCR扩增‘201鉴定为环孢子虫，收集其粪便样品，置于2．5％的重铬酸钾溶液，4。C保存。2．1．2主要仪器和主要试剂BDFACSCalibur流式细胞仪及流式细胞仪校准微球，购自北京东迅天地医疗仪器有限公司；TDL．5．A大容量离心机，购自上海安亭科学仪器厂；FB．OIT溶剂过滤器(1L)，购自杭州赛析科技有限公司；饱和蔗糖溶液；pH7．4的0．Olmol／LPBS溶液等：双蒸水。2．2方法2．2．1卵囊的纯化采用Chaput等‘631的蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊，经l：2饱和蔗糖溶液纯化后的卵囊保存于0．01mol／LPBS液中。2．2．2卵囊计数将经过纯化的环孢子虫卵囊原液摇匀，分别取511L涂片和15此50％甘油水滴加于洁净载玻片上，混合均匀后加盖玻片，普通光学显微镜下观察，计玻片上所有卵囊数，反复进行10次，取其平均值乘以200，即为环孢子虫卵囊液的浓度(个／mL)。2．2．3不同浓度样品的制备将经显微镜观察和分子生物学检测均为环孢子虫卵囊阴性的人粪便样品，采用1．2．1同样方法处理后的液体作为稀释液。将环孢子虫卵囊液和稀释液按5倍体积等比例稀释，制备的浓度分别第25页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文为：13l080个／mL、26216个／mL、5243．2个／mL、8．4个／mL，分别记为l、2、3、4、5、6、7测试组，照组，记为8和9测试组，每个浓度组制备6份。1048．6个／rnL、209．7个／mL、41．9个／mL、稀释液和双蒸水分别为阴性对照组和空白对为了更加准确的确定环孢子虫卵囊的检测限，用同样的方法，将环孢子虫卵囊的浓度分别制备为5243．2／mL、4194．56／mL、3145．92／mL、2097．28／mL、l048．64／mL的卵囊液，分别记为①、②、⑨、④、⑤测试组，稀释液和双蒸水分别为阴性对照组和空白对照组，记为⑥和⑦测试组，每个浓度制备5份。2．2．4流式细胞仪分析及结果的统计与分析用流式细胞仪校准微球对BDFACSCalibur流式细胞仪进行校正，将不同浓度测试组和阴性对照组的环孢子虫卵囊液分别用200目滤网过滤，分别进行流式细胞仪筛选分析，样品上样量为500vL，分析常量设定为20000个事件，观察结果，详细记录数据。2．2．5结果统计与分析应用WinMDlVersion2．9软件对流式细胞仪筛选的不同浓度测试组和阴性对照组的数据分别在SSC．FSC参数和SSC．FLI参数下制散点图进行统计和分析。3结果与分析3．1环孢子虫卵囊形态结构取20此PBS液中的环孢子虫卵囊液在微分干涉显微镜(DIC)下观察，卵囊呈球形，大小形态规整均一，卵囊壁和原生质均较清晰。紫外荧光(UV)显微镜下，可见卵囊自发蓝色荧光，与背景对比明显，易鉴定。图像经“融合”之后，可见环孢子虫卵囊均自发荧光，内部结构色彩对比明显(图3．1)。3．2卵囊的筛选分离将13l080个／mL的卵囊液经流式细胞仪样品筛选，在FSC．SSC双参数下制散点图，分析20000个事件，可见明显事件聚集区域RI(图3．2A)，在SSC．FLl双参数下制散点图，选择488nm光谱下荧光强度密集且适中的事件聚集区域R2(图3．2B)。在SSC．FSC两个参数条件下将聚集区域R1和R2内的数据进行分析处理，即获得聚集且能自发荧光的事件区G(图3．2C)。同样道理，对各阴性对照卵囊液进行数据处理和分析，由图3-2可见，在设定的区域Rl和R2内，阴性卵囊液内几乎无事件聚集，表明测试组所筛选的为环孢子虫卵囊。第26页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研宄生学位论文图3-I荧光微分干涉显微镜下卡耶坦环孢子虫卵囊图(400×)A：微分干涉条件下卵囊的形态和结构B：紫外荧光条件下卵囊形态和结构C：图像经融合后。环孢子虫卵囊均自发荧光Fig．3-lCyclosporacayetanensisoocystsbyfluorescenceanddifferentialinterferencecontrastmicroscope(400×)A：ThemorphologyandstructureofCyclosporaunderf]uorescencemicroscopeB：ThemorphologyandstructureofCyclosporaunderdifferentialinterferencecontrastmicroscopeC：themergeimagethatalltheoocystscanautofluorescence阳性对照阴性对照ABC图3．2阳性对照与阴性对照的散点图阳性对照：A在FSC．SSC两个参数下，可见明显事件聚集区域RI；B在SSC．FLI双参数下，也可见荧光强度密集且适中的事件聚集区域R2；C在SSC．FSC双参数下，即获得聚集且能自发荧光的事件区G阴性对照：A，B和C分别为选择事件聚集区域RI，R2和G时对应的杂质事件数。Fig．3．2ThedotplotsofpositivecontrolandnegativecontrolPositivecontrol：AUndertheFSC-SSCdual-parameter。itwasclearlythattheevenmgatheredareaGateRl：BUndertheSSC-FLldual．parameter．itwasalsoclearlythatfluorescenceintensitymoderateintensiveandeventSgatheredareaasGateR2；CUndertlleSSC—FSCdual-parameter,itCallbegoaentheGateG．Negativecontrol：ThecventSnumberofimpuritybyGateR1．R2andG．第27页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．3不同浓度环孢子虫卵囊液的检测结果将1-9测试组分别进行流式细胞仪进样，分析20000个事件，各组别均进行6次重复，在聚集区域Rl和R2条件下进行分析，计算其平均值，结果见表3．1。随卵囊液浓度递减，在聚集区域Rl和I匕内流式细胞仪检测到的卵囊量呈递减趋势，至l048．6个／mL浓度时呈直线趋势，提示在该区域内，卵囊液低于l048．6个／mL浓度时，卵囊事件发生数与阴性卵囊液中杂质事件发生数不易鉴别区分。结果表明，流式细胞仪可有效检测环孢子虫卵囊液的浓度在l048．6-5243．2个／mL之间，其卵囊量平均检测限为34～77．5个之间。为了更加精确地确定流式细胞仪的检测限可以将环孢子虫卵囊液的浓度在5243．2～l048．6个／mL之间再进行检测，利用同样的方法，分别制备①、②、③、④、⑤测试组，和⑥、⑦分别为阴性对照组和空白对照组。分析20000个事件，各组别均进行5次重复，在聚集区域R1和R2条件下进行分析，计算其平均值，结果见表3．2。随卵囊液浓度递减，在聚集区域Rl和R2内流式细胞仪检测到的卵囊量呈递减趋势，至4194．56／mL个／mL浓度时呈直线趋势，提示在该区域内，卵囊液低于4194．56个／mL浓度时，卵囊事件发生数与阴性卵囊液中杂质事件发生数不易鉴别区分。结果表明，流式细胞仪可有效检测环孢子虫卵囊液的浓度在4194．56～5243．2个／mL之间，其卵囊量平均检测限为63．6～90．8个之间。以上的结果综合表明，流式细胞仪分析20000个事件，在设定的聚集区域Rl和R2条件下，事件发生数在34个以上即可怀疑为环孢子虫感染，事件发生数在91个以上即可诊断为环孢子虫病。表3．1流式细胞仪检测不同组别中的，日囊量统计表Table3-IThestatisticalresultsoftheoocystsinthedifferentgroupsbyFlowCytome时注：8为阴性对照。9为空白对照Note：8：negativecontal，9：blankcontrol第28页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文表3-2流式细胞仪检测不同组别中的卵囊量统计表Table3-2ThestmisticflresultsoftlleoocystSintIledifferentgroupsbyFlowCytometry注：6为阴性对照。7为空白对照Note：6：negmivecontal，7：blankcontrol4结论与讨论目前，环孢子虫卵囊计数尚无统一的方法。环孢子虫在分类上属球虫目艾美耳科的原虫，可采用麦克马斯特计数法进行计数，本试验中对环孢子虫卵囊原液采用麦克马斯特计数法，其每毫升卵囊数仅为直接涂片计数值的1／4，因此，本试验选用直接涂片法进行计数，更为客观准确。2005年，Dixon等146】报道经过密度梯度离心后的人粪便样品，用流式细胞仪分析了15000个事件，在设定的参数下，将事件发生数为0时判为阴性，l～10时判为可疑，大于10时判为阳性，与显微镜检查结果比较显示，在检测到的34份显微镜阳性的样品中，32份流式细胞仪确定为阳性，2份判定为疑似；8份显微镜阴性的样品中，2份被流式细胞仪检测为阳性，5份为疑似，表明流式细胞仪可用于环孢子虫的检测并且比显微镜更敏感。本试验为更准确评价流式细胞仪检测的客观性，采用阴性卵囊液作为稀释液，可有效检测环孢子虫卵囊液的浓度在4194．56～5243．2个／mL之间，卵囊液低于l048．6个／mL浓度时，卵囊事件发生数与阴性卵囊液中杂质事件发生数不易鉴别区分，卵囊量平均检测限为34～90．8个之间。试验结果提示，流式细胞仪分析20000个事件，在设定的聚集区域Rl和l也条件下，事件发生数在34～90．8个即可怀疑为环孢子虫感染，事件发生数在91个以上即可诊断为环孢子虫病。由于人粪便中杂质较多，在临床样品中，建议先采用甲醛．乙酸乙酯离心沉淀法对粪便进行预处理，其沉淀物用双蒸水进行2．3次洗涤，用200目滤网过滤，制备检测液，可进一步消除检测样品中的杂质事件，更有助于结果的判定。多数用于流式细胞仪检测的环境和临床样品中的病原微生物需要接合荧光染料进行标记显色，环孢子虫卵囊可自发荧光，无需繁琐的染色步骤，分析20000事件数所需时间约2min，检测结果容易判断，方法简单快速，且能用于大量环孢子虫卵囊临床样品的检测。第29页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第30页共64页 万方数据 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文见第二章2．2．22．3显微镜检查方法2．3．1卢戈氏碘液染色法见第二章2．3．12．3．2饱和蔗糖溶液漂浮法见第二章2．3．22．4DNA提取每个样本取约200mg用于基因组DNA的提取，使用E．Z．N．A．StoolDNAKit(OMEGA，USA)试剂盒操作步骤，提取的DNA样本存储在-20。C，备用。2．5分子鉴定应用巢式PCR扩增18SrRNA基因的部分序列‘埘和参照Olivier等1321的ITS．1部分序列的引物如表4一l，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成部合成。表4-l环孢子虫各扩增位点的引物Table4-ITheprimersofdifferentgenesitesofcyclospora基因位点退火温度Geneticaflnealing片段大小locustemperature1arg—etSIZe引物名称primer序列Sequence1350bp501bp18SlF18SlR18S2FlgS2RAATGTAAAACCCTTCCAGAGTAACGCAATAATCTATCCCCATCACGAATTCCAGCTCCAATAGTGTATCAGGAGAAGCCAAGGTAGGCRTTTITS．158"(2500bpITslFGcTTGcTATGTTTTAGcATGTGG——一!：!釜!墨堡垒￡垒垒!g垒垒!g￡垒￡垒￡垒￡垒2．6PCR产物的检测取5旺PCR扩增产物，在含0．2lag／ml的DNAGreen的1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯观察出现特异性条带，然后在电泳凝胶成像系统仪中拍照，Marker为DL．2000DNAMarker。2．7测序。测序反应试剂：ABIPRISMRBigDyeTMTerminatorV3．1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems)；测序仪：ABIpRIsTM3730XLDNAAnalyzer(AppliedBiosystems)。测序委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。2．8分子进化分析基于18SrDNA的部分序列的进化分析，首先使用ClustalX(version2．0)对所测的序列自身比对和与Cyclosporacayetanensi(AFIlll83)进行序列比对。然后，用MEGA最大简约法的与从狒狒中分离的Cpapionis，从疣猴中分离的ccolobi，从非洲绿猴中分离的CcPrcop豇heci和从人体中分离的Ccayetanebsis做进化分析和同源性比较，并采用N．J法建立进化树(MEGA5．0)。同样第32页共64页℃5CJ5A附rS8 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文基于ITS·1部分序列的进化分析，采用同样的比对方法与危地马拉Guatemala(AF302616．1)，尼泊尔Nepal(AF302581．1)，秘鲁Peru(AF302605．1)和海地Haiti(AF302584．1)分离株进行比对并建立进化树。3结果与分析3．1显徽镜检测结果在显微镜下环孢子虫卵囊的直径约为8．6pro(7．7．9．90m)。当卵囊以未孢子化卵囊随粪便排出以后，在显微镜下呈现是一种未分化的球体包含桑椹胚，见图4．1。ll029份住院病人的粪便样品中共检测到84份环孢子虫阳性样品，感染率为0．77％。口-，+‘‘‘t●．缫掉．：。寸仁oi“A图4-l环孢子虫卵囊形态结构(所有图片均为1000X)A：光学显微镜下粪便涂片中的环孢子虫卵囊经改良抗酸染色呈深红色或不着色：B：微分干涉显徼镜下湿片中的环孢子虫卵囊形态，可以看到部分孢子化的卵囊：C：330．380nm紫外激发滤镜表面荧光显微镜下环孢子虫卵囊形态。Fig．4-1Cyclosporacayetanens括oocystSbymicroscope(1000x)A：CyclosporacayetanensisoocystSinfeces澌thmodifiedacidteststainunderthelightmicroscope；B：Cyclosporacayetanensisoocystswetindifferentialinterferencemicroscope：C：Cyclosporacayetanensisunder330～380Ilmfluorescencemicroscope．3．1．1环孢子虫感染和年龄的关系本次调查共收集的ll029份粪便样品中，其中0-6岁627份，感染环孢子虫为4份，感染率为0．64％；7～17岁532份感染环孢子虫为8份，感染率为I．50％；18-28岁1076份感染环孢子虫为10份，感染率为0．93％；29--44岁2156份感染环孢子虫为12份，感染率为0．56％；45-59岁3029份感染环孢子虫为23份，感染率为O．76％：60~74岁2655份感染环孢子虫为2l份，感染率为0．79％；75～89岁912份感染环孢子虫为6份，感染率为0．66％；大于90岁32份，感染环孢子虫为0份，感染率为0。由此可见，环孢子虫感染率最高的年龄段为7·17岁年龄组，大于90岁年龄组未发现环孢子虫感染，其他年龄段均有感染，见表4-l。第33页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．1．2环孢子虫感染和性别的关系本次调查的ll029份住院病人的粪便样品中，男性住院病人的粪便样品为633l份，感染环孢子虫为50份，感染率为0．79％；女性住院病人的粪便样品为4698份，感染环孢子虫为34份，感染率为0．72％，见表4-2。经卡方检验p>0．05，环孢子虫的感染与性别差异不显著。表4-2住院病人环孢子虫感染情况与性别的关系Table4-2ThepatientsinfectedstatusofCyclosporaindifferentsex3．218SrRNA基因部分序列3．2．1PCR扩增结果显微镜检测发现的84份环孢子虫阳性样品，经基于18SrRNA基因的巢式PCR扩增，经过三次PCR扩增以后，全部的样品均被扩增出来。经1％琼脂糖凝胶电泳的结果，显示扩增的目的片段大约为500bp(见图4-2)。第34页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文200010007505002501002000100075050()25010020001000750500250100M2l2223242526272829303l3233343536373839NⅥ404l4243444546474849505l52535455565758N2000100075050025010020(Jo1000750500250100M59606l6263646566676869707l72737475767778^M79808l828384N图4．2基于l8SrRNA基因的人环孢子虫巢式PCR扩增结果M：DL2000Marker；i-84：环孢子虫阳性样品；N：阴性对照Fig．4-2Thenest-PCRproductsbasedonCcayetanensisl8SrRNAgeneM：DL2000Marker；I·84：Cyclosporasamples；N：Negativecontrol第35页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．2．218SrRNA基因序列的进化分析从GenBank上下载的环孢子虫18SrRNA基因全基因序列(AFllll83)与具有代表性的R2008．1、R2008．2、R2008．3、l也008-4、R2008．5、R2008．6、R2008-7、R20ll-l、R201l-6、R20l卜15、R2011．19、R2011．20、R2012．1、R2012．6、R2012．7、R2012．8、l也013．24、R2013．117先用ClustalX2．0软件进行序列比对，结果显示只有个别的序列只有一个碱基的差异，结果如图4．3。然后用MEGA最大简约法与GenBank上来自不同种的环孢子虫分离株进行N．J建树，如图4’4显示Cyclosporacayetanensi(AFIl1183)与其他的不同种的环孢子虫在不同分枝上，而河南省的人环孢子虫分离株与Cyclosporacayetanensi(AFl1l183)在同一分枝上。基于18SrRNA基因的同源性分析结果如图4．5可以看出分离株与Cyclosporacayetanensi以及分离株之间的差异性较低，而分离株与其他种的环孢子虫差异性较高。第36页共64页 万方数据—_|—_1：河南农业大学2014届硕士研究生学位论文图4-3环孢子虫河南分离株与Cyclosporacayetanensis(AFIIl183)在18SrRNA基因序列上的差异性Fig4-3SequencedifferenceintheIgSrRNAgenebetweenCyclosporacayetanensisandCyclosporaisolatesinHenan第37页共64页R2口。BI—R20口甲q∞¨o。∞-3R20p7∞】}譬_rHH～卜叶一ll_∞uR20_p-2。冀2口p¨．q*20_¨．1R2口_～-eR2§1_1_．1m嚣口Hu-2．R2a110R20_1_．1冀2口l_p上口器o。8-”R200∞基R20口*-l≈口。∞-S●●●●●●●●●--●●●●●●●●●●●●●●霉●●●●●●●●●●●●■-●●●●●●霉●●●●●●●●●●●-●●●●●●●●●●●●●●‘●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●-●●●-●：●●●●●●●t●●-●●●●●●●●●●●●●●●●●●每净F1ppp∞∞TTonATTTCT01．n∞1．DGT写ccoDnCTDnnCGTAnGGl_TGnCCnCG由cTTTrTTnCGD窨on『TnnonoCTTCGqocG矗n价叫TGGTGTTncGoAAnr丌1AqTToAG；譬净iAn≯GT6TTTcA{fR200∞-3{fR20pN-6{f刁Mop∽．¨_q；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；：；；；；：；；；；；：：；：；；；；；：：；；；：：：．Iff{¨oo∞．H；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；；；；：：；；；；；；；；；；；：；；：；；；；：；；；；；；；；{f乃N。pp山妁c：；：；：：：；：：：；：；：；；；；；；；一：：；；；；：：；；；；；：：；；；；；；：；；；；；：：；．If刃NopN．q；；：；；；；；；；；；：；；；；；；；；；：一：：；；；；；：；；；；；：；；；；；；；：：；；；；：：：．If刃NopN．_；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；；；；：；；；；；；；：；；；；；；；；；；}f∞N。pp止Ms；；；；；；；；：；；；；；；；；；；；；：：；；；：；：；；；；；；；；；；：；：：；；；；：：；；；毫习NopN．∞；；；；；；：；；；：；；：；；；；；；；；；：；；；；：；；；；；：；；；；；；；：：；；；；：；：；；{fR20pp-6{fR20p∽．2A蕞R2011．1-IfR20pp-1∞参¨88．ulf忍吕8-∞}fR20赛．2≈R2萤厶鼍R28∞．7 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文趸2008-2B2R2e11．6殴2e11。15R2翻2-6R2e08-5民2008-’；C．：二交Vet鸯}nensisR2e1二1R2D13-24艮2c08-3§7良2G'冬"7R2012．8R20711．．1R麓11，19发2e0长6o，0005028p"0nE：B⋯⋯0．etcopitned图4-4河南省人环孢子虫分离株18SrRNA基因序列与其他种类的环孢子虫根据邻接法(NJ)建立的系统发育关系Fig．4-4PhylogeneticrelationshipofCyclosporaisolatedfromHenanprovinceandotherCyclosporaspeciesbyneigIlbor-joiningfNJ)analysisofthe18SrRNAgenenucleotidesequences第38页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文照擘笛声●．．上萄．一商’。；毒事‘羊对；蚕；∞善呈：：；：_耋9Nr，=l了：，口=lj-w户q：3口觎撼鸯垂：：D羹璧萎塞墓慧蔓耄垂萋C口王=口鳖塞主呈茎警鳖釜譬cb督‘k二_．：·釜筌翟≈譬叫芦p口9芦p口p芦p口p星量景量巷善景量重量萎营量善量萤蕊萎p9∞目p9；)pc3p曼一萤萎．量曼巷基量萤一星，萎．量曼晷基曼量愚莹p9口jp口p9pc=，p9量艮．尽良。鸯蕊是委．屋．最愚畏量基．良墓愚量．良p目aCjp苫目知p9p每p『o白量曩量萎蚕量．墓量萎基蠹萤基p角芦p曼量萤量虽卢；==，p#j呈晷萤星。．量，9口p萎量基qp——曼景萎p∞量芦p9qp晕量星萎量善基墓基量萎一蔓量量．p萎萤曩善景蠹萤萎瞎舅一p口pIj、9芦萎善墓量萤量墓鑫童匿p9pI==，蠹熹景营萤善蓦景鑫塞．p9垂萎营量蕈藿量墓毒量芦p芦p日芦p基萤莹曼基囊量基萤量口p9p口卢9景黑景莹景．量虽莹萤最景芦p9p营j囊角p萤善量蕃善量善萤pPpp．pp萤量善萤萤{爱量芦9p口萋p‘9墓量寅萎量售【]．‘J’LJ一●，p9pp．p+9蓦募蓦：营蕈i量萎÷pp：p匀．p量量{景萤售-—-{}pP9‘pp善善{昌{量芦pp’晷萤莹；萋{pP曼量景{p咎骞i善p拦曼i附图4-5环孢子虫河南分离株与GenBank上不同的环孢子虫种在18SrRNA基因序列上的同源性比较结果Fig．4-5HomologyanalysisofCyclosporaisolatesfromHenanProvince18SrRNAgenesequencewithotherCyclosporaspeciesinGenBank第39页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．3ITS．1部分序列3．3．1ITS．1部分序列的PCR扩增基于18SrRNA基因的巢式PCR扩增，经l％琼脂糖凝胶电泳为阳性的样品(图4-6)，扩增的目的片段大约为500bp。20001000750500250100M1234567N图4-6人环孢子虫基于ITS．1基因的巢式PCR扩增结果M：DL2000Marker：I-7：环孢子虫阳性样品；N：阴性对照。Fig．4-6ThePCRproducebasedOnCyc，DsporaITS—lgeneM：DL2000Marker；l-7：Cyclosporasamples；N：Negativecontrol3．3．2ITS．1基因序列的进化分析从GenBank上下载的环孢子虫ITS．1基因序列与危地马拉(AF302616．1)，尼泊尔(AF302581．1)，秘鲁(AF302605．1)和海地(AF302584．1)分离株与本试验的河南分离株用CiustalX2．0软件进行序列比对，结果显示ITSl基因序列有较多的碱基差异，如图4．7。然后用MEGA最大简约法进行N．J建树(MEGA5．0)，引导分析采用的是1000重复，结果如图4．8显示，河南省不同年份的分离株与GenBank上不同地区的分离株之间的进化关系。图4-9显示了河南省不同年份的分离株与GenBank上不同地区的分离株之间的同源性。第40页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文图4．7环孢子虫河南分离株与危地马拉、尼泊尔、秘鲁、海地分离株在ITS-1基因序列上的差异性Fig．4．7SequencediversityintheITSIgenebetweenCyclosporacayetanensisfromGuatemala，Nepal，Peru，HaitiandCyclosporaisolatesinHenan第4l页共“页__亡，￡’c吝￡．楚．1誉．{摹一王F39篷皇器甜王订l～§Ft|1．与_轼譬警Z乱一：体X-：II_：8X邑一～op¨．3N∽{f¨o】．u．2A麓Hop¨_6缸NDpp_6鞋ocatmnlaIm缸zn口aI：If，m己|I工∞iti≈N007．n、，Bp麓¨oo∞^、rc04≈Noo∞。ovCp∽奇Nop¨-3N∽#¨op∞．2牟藉NopN小藉NDl_p_6耸ouatejⅢla麓z巾口al麓可nru麓工叫～t．缸Noo叫。cv[0H箍Noo∞。cv8§≈¨oo∞^‘n15：tlS；=l|；t1．；‘l●t：1．==ll：1．1o-o由》oanDD由^D》GcanDTTl-cTDnAll3窑^ATGTTcl磊c1焉TAD》nn．TAC>n1-DmTAcTGn。n01．GTn^Trrj口寻nDnDTGD口AA价。AAo由．I百_I-TG自由TG．--．-．．．．．．．．．．．．．．．．．．．●．．．．．．．．．-．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．●．．．．．．．．．．．．．．．-．．．．．．．．；．．．．．．；．．．．．．．．．．．．．．．．．．；．．．if．．．．．．．．．；．．．．．．；；；；；；；；；；；；；；；；．Jf，；：；；；：；：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；．；；；；；；；；；；；：；：；：．》：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；；；；；．．；；；：；；；；；；；；；；；；．、，；：；；：；；；：；：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；．．；；；；；；；．．．r；；L尸；：；：；、r；：；：o：；：；；；；；；；；；；；：；；；；；；．≯；；：．．；；；；；；；．．．1。尸；；；：：：；br；：；；；：、，．n；；：；：；：；；；；；；；；；；；；；；；；．；；；；；；；：H；：詈；；；．b；；；：；；；；；．D；；；；；；；；：；；：；：；：；；；：：；；；；；；；：■；：；；；：．≯；：；：；：；；；o；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；；；；；；；：H；：；；；；．P；：；：；：；；；；；：；；；；；：；；；；；；；；；：；；．一GT611B丌G盘n(j1_Qo喜，§昌ATon》cA苫昌9鲁口rAGATGnoTGnoTG窖AG》AA|G1ADaT6当oTG口Tr弓TGcTonl．oGnAGl_a^6昌1．GrrrG由T13D1-¨；．．．；；；；；；；；：；：；；；F；：；；；：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；fu；；；；；；；；；；；；；；；；，u；；；；；；；；；；；；；；；；：；：：；：；；；；；；；；；；；；；；．．；；；；；；；；；；；；；；；；；；；．^∥n：；；；：；：；；：；．》；；；；；；；；；．；；；；．．．；．。≯；；；；：；价；：；：．D；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；：；；；；；：；；． 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文卜———————一0005图4-8河南省人环孢子虫分离株ITS．1基因序列与不同地区的分离株根据邻接法(NJ)建立的系统发育关系Fig．4-8PhylogeneticrelationshipofCyclosporaisolatedfromHenanprovinceandotherplaceisolatesbyneighbor-joining(NJ)analysisoftheITS-1genenucleotidesequences12345678910111．Guatemala-AF302616．12．Haiti-AF302584．10．0293．NepaI-AF302501．10．0160．0334．Peru-AF302605．10．0280．0370．0285．2007-Cyc010．102{0．0870．1070．109：6．2008-Cyc040．1陀0．∞70．1070．1090．∞0|7．2008-ocl50．1∞0．0840．1040．1070．∞28．2011．60．0060．0310．018{0．0310．1050．105l0．1029．2012．60．0020．0310．0180．031。0．105l0．1050．1020．0∞10．2013．240．们00．035；0．026；0．035i0．11—3}10．1130．1100．0160．008；11．201孓3250’啷．⋯．⋯．⋯_：==二．={二一0．0330．0240．0330．105|0．1050．102i0．0140．0060．01【图4-9环孢子虫河南分离株与C-enBank不同地区的环孢子虫分离株在ITS．1基因序列上的同源性比较结果Fig．4-9HomologyanalysisofCyclosporaisolatesfromHenanProvinceITS·1genesequencewithotherplacesCyclosporaisolatesinGenBank第42页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文4结论与讨论4．1人环孢子虫流行病学环孢子虫是～种新出现的食源性和水源性传播的细胞内寄生的寄生虫，可以引起入和动物的胃肠炎和严重腹泻，在分类上属于顶复门，艾美尔科。2003年，王克霞等【30】对安徽省不同地区人环孢子虫感染情况调查发现有腹泻症状儿童感染率为5．62％；2005年，在埃及的住院病人的粪便样品中，环孢子虫的感染率被确定为1．91％I”1；2011年，周洋1201对于河南省郑州和开封人环孢子虫感染情况的调查显示感染率为O．70％，其中7．17日的年龄组最高(0．87％)。2013年，Tandukar等【删对尼泊尔的在校儿童的肠道寄生虫的调查发现，环孢子虫的感染率为1．6％，高于其他年龄段的环孢子虫感染情况。本次调查结果显示郑汴两地人环孢子虫的总体感染率为O．77％，环孢子虫感染率最高的年龄段为7．17岁年龄组，感染率为1．50％，与其报道基本符合。4．2环孢子虫分离株种系发育关系依靠传统的表型分析已不能满足病原体日益加快的变异速度及公共卫生快速反应体系的需求，基于现代分子生物学的PCR方法以及基因分型技术，微生物的基因组中的保守区和多变区域的特征已经被广泛研究，进行相关的遗传特性研究。4．2．1基于18SrRNA基因的环孢子虫分离株种系发育关系应当注意的是18SrRNA基因具有较高的保守性，因此，18SrRNA基因对区分环孢子虫种间和的不同分离株之间的亲缘关系是十分有用的。已经有研究者利用环孢子虫18SrRNA基因区分环孢子虫和其他的顶复门寄生虫1371。另外，分析来源于人类和狒狒的环孢子虫分离株的18S核糖体RNA基因显示有1．6～1．7％的差异，然而人类和狒狒的环孢子虫的克隆株的差异分别有0．78％和0．73％13引。在另一项研究中显示，epapion矗，ccolobi，和Ccercopitheci的18SrRNA基因与人类的分离株有O．3～0．6％的序列差异【351。本次试验结果显示，所有的人环孢子虫分离株均在同一分支上，且与已经提交的入环孢子虫分离株(AFIll183)之多只有～个碱基差异(图4-3)。4．2．2基于ITS．1基因的环孢子虫分离株种系发育关系要进行环孢子虫属内鉴定，需要相对多态的ITS基因序列作为靶基因。已经有运用高变异的ITSl区分Ccayetanensis和Cpapionis。Olivier等【41】运用高变异的ITS．1区域序列区分人环孢子虫(c．cayetanensis)和狒狒环孢子虫(Cpapionis)，发现ITS．1序列为高度变异的区域，人环孢子虫和狒狒环孢子虫的ITS．1基因序列存在差异。考虑到Ccayetanensis分离株的ITSl序列的变异性(0～6．5％)，内部转录间隔区(ITS)美国分离株(8．3％)比危地马拉分离株(3．8％)序列变异大，但是序列和地理差异没有相关性。本研究对于入环孢子虫的ITS-1序列的扩增显示与从危地马拉，尼泊尔，秘鲁和海地等不同地区提交的环孢子虫ITS．1基因序列差异较大。同时也显示不同的分离株之间的ITS．1基因序列具有较大的变异性。第43页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第44页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文第五部分河南省奶牛环孢子虫分子流行病学调查及生物特性研究1引言环孢子虫是一种寄生于肠道的能引起急性腹泻的顶复门原虫类寄生虫H1。环孢子虫的感染以厌食、恶心、胃肠胀气、疲劳、腹部绞痛、腹泻、低烧、消瘦为主要特征pl。环孢子虫的卵囊的直径大小为8．61JJn(7．7-9．9pm)。当这种寄生虫是随粪便排出，它是一种未分化的球体桑椹胚。有一个双层膜的卵囊，也存在一个极体和卵囊残留物，孢子化时间需要超过7天pl。自1979年Ashfordl21首次描述了在巴布亚新几内亚引起两个孩子和一个女人腹泻的球虫样生物体，得出结论可能是等孢子球虫属。直到1994年，Ortega和他的合作割41的描述了其特征并提出了Cyclosporacayetanensis的名字。1995年，分子系统发育分析的小亚单位SSUrRNA基因表明环孢子虫是一种与艾美球虫属相近的寄生虫【371。自此，己发表描述生物和分子特征、流行病学、治疗措施及防控环孢子虫的科研文章。到目前为止，在不同的动物机体内已经有19种环孢子虫被确认，啮齿动物、爬行动物、食虫类灵长类动物和人类‘341。人环孢子虫的典型的临床症状就是腹泻，大部分环孢子虫的感染者来自旅行者，艾滋病患者和呈地方流行地区的居民，原生动物是地方性，如海地、危地马拉、秘鲁和尼泊尔14l。奶牛是与我们的生活密切相关，人类每天消耗成千上万吨牛奶。2008年9月到2013年5月期间，在河南省我们收集了l229份奶牛的粪便样品。首先进行基于形态的显微镜观察，然后，提取阳性和疑似样品的基因组DNA进行18SrRNA基因部分序列的PCR扩增，为了进一步确定这些环孢子虫样生物体，在之前的基础上，发展了一种限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析来区分于艾美球虫属。本试验调查了奶牛环孢子虫的流行情况，并进行了分子鉴定，为奶牛环孢子虫的生物学特性研究和奶牛环孢子虫病的防治提供依据。2材料与方法2．1样品采集2008年9月至2013年5月期间，从河南省11个不同的奶牛场，采用直肠采样或者收集新鲜粪便的方法，总共采集l229奶牛粪便，立即放置在一次性塑料袋并标注编号和年龄。采集样品的年龄分布为l到8周龄，3月龄，4～6月龄，7～12月龄，l岁以上，对应的采集样品数为7、15、17、20、15、13、19、27、164、43、7和27份。采集的样品贮藏与4。C冰箱中，尽快进行显微镜检测。2．2材料2．2．1主要仪器和耗材见第二章2．2．12．2．2主要试剂及配制见第二章2．2．22．3检查方法2．3．1卢戈氏碘液染色法第45页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文见第二章2．3．12．3．2饱和蔗糖溶液漂浮法见第二章2．3．22．4DNA提取见第四章2．42．5分子鉴定应用巢式PCR扩增环孢子虫18srRNA基因的部分序列‘271，使用的引物如表5．1，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成部合成。表5-1巢式PCR扩增环孢子虫18SrDNA部分序歹fj的弓f物Table5-1Theprimerofcyclosporafornest-PCR基因位点退火温度片段大小引物名称引物序列annealingGeneticlocus—TargetsizePrimerSequence塑里巳!望堕堡l8S55℃1350bpl8SlFAATGTAAAACCCTTCCAGAGTAACl8SlRGCAATAA。TCTATCCCCATCACGrRNA18S2F55℃501bp18S2RAATTCCAGCTCCAATAGTGTATCAGGAGAAGCCAAGGTAGGCInlT2．6PCR产物的检测取5L扩增产物，在含0．2I_tg／ml的DNAGreen的1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯观察特异条带，然后在电泳凝胶成像系统仪中拍照，Marker为DL-2000DNAMarker。2．7RFLP分析PCR为阳性的样品进行RFLP分析，用来从艾美球虫属区分出奶牛环孢子虫。10uLPCR产物，21al10×反应缓冲区和lUBSpEI(TaKaRa)，总反应体积为201aL，随后在恒温水浴锅中37。C孵育4h以上，酶切产物进行含DNAGreen的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，然后在电泳凝胶成像系统仪中拍照，Marker为DL．2000DNAMarker。2．8测序见第四章2．72．9分子进化分析基于环孢子虫18S的进化分析，首先使用ClustalX(version2．0)对所测的序列进行比对，然后用MEGA最大简约法与从狒狒中分离的Cpapionis，从疣猴中分离的Ccolobi，从非洲绿猴中分离的Ccercopitheci和从人体中分离的Ccayetanebsis，从奶牛分离到的环孢子虫分离株Guangzhou1和Guangzhou2，以及2012年提交的日本奶牛分离株Cyclosporasp．Oita进行N．J建树(MEGA5．0)，引导分析采用的是1000复制。3结果与分析3．1显微镜检测结果在显微镜下环孢子虫卵囊的直径约为8．61am(7．7～9．90m)。当卵囊以未孢子化形式随随粪便排第46页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文出以后，在显微镜下呈现是一种未分化的球体包含桑椹胚。共检测到44份环孢子虫阳性样品，感染率为3．58％。3．2PCR扩增和RFLP分析基于18SrRNA基因的巢式PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳显示约500bp的阳性片段：阳性的PCR扩增片段，再用限制性内切酶BspEIRFLP分析，经1．5％琼脂糖凝胶电泳，环孢子虫阳性样品被分离成两个片段(130bp和370bp)。如图5．1所示为PCR扩增的部分结果，显示l、2、3、8、12、14、16、19、21、22、23、24、25、29、32、34、35、43号为约500bp的阳性结果；如图5-2所示为RFLP分析部分结果，显示2、3、5、6、8、9、17、19、22号阳性PCR扩增结果被酶切为约130bp和370bp两个片段，其中8号和19号显示，约500bp的PCR扩增片段与130bp和370bp酶切片段共同存存，这可能是共同感染的原因。Ⅵ117：弓456789】02】3】4l5]6】78】920222232420001000750500250i002000100075050025010020001000750500250100M2526272829303l32333435363738394041424344454647N图5一I基于l8srP,NA基因的奶牛环孢子虫巢式PCR扩增结果M：DL2000Marker；1．47：PCR扩增结果；N：阴性对照。Fig．5-IThenest-PCRproductsbasedoncattleCyclosporal8SrRNAgeneM：DL2000Marker；1．47：Cyclosporasamples；N：Negativecontrol图5-2奶牛环孢子虫18SrRNA基因片段的BspEI酶切结果图M：DL-2000Marker；1-22号为PCR-RFLP分析结果Fig．5-2PCR—RFLPanalysisof18SrRNAgeneampliconsweredigestedwithrestrictionendonucleaseBSpEILaneM：DL-2000DNAMarkerandlanes；l—22：BSpEIdigestedproductsfi'omnestedPCR第47页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文3．3环孢子虫流行病学基于18SrRNA基因的巢式PCR扩增，阳性样品的PCR产物使用限制性内切酶BSpEI进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析，结果表明，44个阳性样品分别被酶切为130bp和370bp两个片段。然后，阳性样品的PCR产物经测序鉴定与DQ082866．1相似性最高，奶牛环孢子虫的总感染率为3．58％。奶牛样品的年龄分布从1到8周，3月，4-6月，7～12月，1年以上。其感染率分别为0、2．33％、0、7．58％、2．90％、4．94％、4．89、9．96％、5．06％、4．07％、0、0(表5—2)。对于不同的年龄群体的环孢子虫感染如图5．3，显示不同年龄组的感染率几乎呈正态分布，感染数最多的年龄组为8周，其感染率为9．6％(8／82)，而l周龄、3周龄、7～12月、>l岁年龄组的感染数为0。这可能是南千该阶殷与外界栲触齐分而龟痦力涿不馋伞．故威婆塞比较高。寥-O_嵋比1遵奄奄§毒§心莳苓蜊梦图5-2环孢子虫感染在不同年龄组的分布Fig．5-2Cyclospora-likeorganismdistributionindifferentagegroupsofdairycattle3．4基于l8SrRNA基因的序列分析巢式PCR扩增环孢子虫18SrRNA基因的样品经限制性内切酶BspEI酶切的阳性样品，测定序列，经校正以后与GenBank上的参考序列进行进化分析，首先使用ClusmlX(verSion2．0)对序列进行比对，然后用MEGA最大简约法的进行N．J建树(MEGA5．0)，引导分析采用的是l000复制。如图5-3所示，从狒狒中分离的Cpapionis，从疣猴中分离的Ccolobi，从非洲绿猴中分离的Ccercopitheci和从人体中分离的Ccayetanebsis在单独一个分类枝，而从奶牛分离到的环孢子虫分离株与2007年提交的中国奶牛分离株Guangzhou1分离株和2012年提交的日本奶牛分离株Cyclosporasp．Oita在单独一个分类枝，与2007年提交的中国奶牛分离株Guangzhou2分离株在不同的分枝上。可见，从河南奶牛体内的环孢子虫分离株与从广州分离的Guangzhoul株和从日本分离的Cyclosporasp．Oita株关系最近。图5-4显示了河南省奶牛体内的环孢子虫分离株与GenBank上序列的同源性比较。第48页共64页 昌篙￡2里Q￡12蜀2苫6苫a苫量兰呈鐾詈兰。兰苫6苫一苫虽罢兰三=r,I呈譬兰三≤t'q罢NnNo—o—o蓦呈詈暑墓詈o罱9t'q写是罱S。摹。攀。n崞t"q口h一。竺2N口寸t-qo—o—o虽婆翟譬磊兰导景3星翟口9In心龟昏乱昀寸目吨々o@N∞叩h。9。n■No9。∞叼n寸口△t"q型蟓锄峨葛软暇∞寸妹．1日uh一≯z=coI_=一芝一)tQu≥、_一。^fr—uuc一>o_I厶二日cu二ko-I卫二u。叻c一勺uu．I丑u=一日u|(鲁一勺uII_～o=I-Io上们u二_们一呻I__叠=ut{∞一u_oZ。廿．凡一磐旺。=一名匪。≥j．廿忸鼷廿寂帮侄底一躐瓤。干，oo．oo∞_／ooo．o一寸一／oN卜一＼卜卜nN＼n—N∞、∞N∞＼寸n口＼寸小心＼N心心＼n∞n＼on寸＼一n一＼on／o∞／o￡o迎。口／0芝on／oo口／I口／0∞／o￡o譬o∞／0口／0oN＼on＼on、oo寸＼oo口／o一，0c，oI／一N／0一／0on／0N／0o_一＼_【N一＼o昏／0n一＼oo一＼oh＼o寸＼oo＼ooN／oc／oo昏一＼oo一＼N卜＼一∞、o岔＼一卜＼N寸＼oo∞／o芝oogoon／0芝。一／oon，o芝一￡一芝oon西＼nNn＼nnN＼NNN＼nnN＼o∞N＼N寸N＼onN＼一∞＼o世程乏相蟋礁K《世娥置建婶母心糖浆蒸候嚷巅昶≯_八至NH‘至口毒至n≥∞≥h≥口≥n≥寸≥n≥N≥一co号丑写∞Ip"訾葛2尝IQ＼枯太翁廿蛊匣v卞。口砖酲u>口一∞o厶oN一∞u一△I_——时∞u=们=o=uQIlou^式v料嫌馋巅掣区疑疃击幸区嗣奏}张QoIIIA2厶暑口u王口Iso∞日弓暑对们∞u叠厶兰2盘}I口c一晕。鲁D，望UJo∞暑墨们苫13盘II弓；葛u奇叠口oII卜N矗。一号卜罨磐球镇长蹈斟m鼎鸶廿器靶怔寒N．”搽仪磐遥扑州妖彦二}二瞪哩=oN扑K甍《证暮万方数据 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文卜———————————————_{0005n≮2o伪它o≈nensishuman图5．3河南省奶牛环孢子虫分离株l8SrRNA基因序列与其他种类的环孢子虫分离株根据邻接法(N-J)建立的系统发育分析关系。Fig．5-3PhylogeneticrelationshipofCyclosporaisolatedfromHenanprovinceandotherspeciesinferredbynel‘ghbor-joining(NJ)analysisofthel8SrRNAgenenucleotidesequences第50页共64页n《o—o∞口o，∞-l芹oo∞仕lo 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文c口；●一茹N=：；op●q；r'‘nP‘oN，p萋墓璺司堡望皇搭整∞；，’：-莹1q书高Ck詈誉譬三詈霹毋整‘D篮雹n薰塞萎萋营粤F萋萎吾萎萤謇二-‘。—‘pt：zap9p9p卢_垦暴量虽磊量虽磊爵磊最蚕虽墨萤基鑫磊曼蠹，蓦蚕_qc3。p；p二pq9p9p口二’虽昂．量萤星萎量蚕萤虽量萤善萤量p=9p=p9q9口9p一——I萤蚕萤量营萤善萤营萤萎营曩量；9=p9p9p—f9p量量一基p——量萤p——量9曼．莹曼量基星量量．蚕曼萎p9p9p虽基．暴量萤晷景薰一基量最p9p9p‘—●C3萤善萤善营最量虽pCj墨鑫萤善景晷墨9p9pC3虽蠹量誉善量最基虽=昌pPp虽蜀虽莹萤量莹p量善量营磊p9p蚕夏蚕萤爱基p善量萤善p9p量p{l}l量善量：置嚣--,t善目-p萤p量p虽二虽9虽i蠹p虽鑫二9虽蚕pcj萤爱p萤c3墨萤垦虽星虽暑pr‘∞p虽=c3星虽兰营虽p∞c)。垦晷虽C，p9p量墓蚕星曼p9萤营量星萤昌p兰蕃星虽c3p9虽謇量晕量p兰晷禹蕃，口p虽重星爱萤萎p三室晷萤p萤营量室虽蚕重p莹星虽t暑p9c，岩量善星莹；蚕蚕p；，二量星曼暑p兰垦莹星虽p萤馨莹譬萤莺萎p9p呈三墓虽萤9p霎星蚕蕃萎p瞽量垦量室虽羹萎p拦量三墓虽p心竺暑善p蹬昌璺善譬鼬图5．4环孢子虫奶牛分离株与GenBank上不同的环孢子虫种在18SrRNA基因序列上的同源性比较结果Fjg．5-4HomologyanalysisofcattleCyclosporaisolatesfromHenanProvince18SrRNAgenesequencewithotherCyclosporaONGenBank第51页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文4结论与讨论4．1牛环孢子虫分子流行病学进行粪便样品寄生虫检测的传统方法主要是显微镜检测，环孢子虫卵囊在显微镜下的形状类似于一种艾美尔属球虫，它也是一个无差别的球形桑椹胚【4】，在显微镜下环孢子虫卵囊和艾美尔球虫难以区分。PCR方法是鉴定物种一个有效的工具，Relman等‘3乃使用引物CYCF3E和CYCR4B建立了巢式PCR方法，扩增了294bp的18SrRNA基因，然后使用限制性内切酶MnII进行RFLP分析用于检测环境样品中的环孢子虫。2006年，肖淑敏‘361等使用引物NesCycF和NesCycR和限制性内切酶KnpI进行RFLP分析，结果表明艾美球虫属被酶切为两部分(大约420bp和80bp)，然而，环孢子虫不可分离的。在这项研究中，我们发现一个新的限制性内切酶BSpEI进行RFLP分析，当阳性PCR样品进行RFLP分析的时候，有的情况下，样品不能被酶切为两段产物，或是与酶切成的360bp和130bp的产物共同存在，这可能是由于共同感染情况的存在的原因。由于共同感染的存在，所有的样品都进行了三次的PCR扩增，其中有两份样品，直到第三次测序才被鉴定。2005年，在土耳其的医院删环孢子虫的粪便感染率被确定为1．91％。2006年，肖淑敏阳等利用巢式PCR技术对首次在牛体内发现的形态学特征与人环孢子虫极为相似的牛源环孢子虫的18SrRNA基因进行了扩增。2011年，Zhou等‘201检测河南省郑州和开封环孢子虫感染率为0．70％，其中7．17日的年龄组最高(0．87％)。总的来说，在这项调查中首次报道了河南省奶牛肠道寄生性原虫．环孢子虫的感染率为3．58％，其中感染率最高的年龄段为8周龄，感染率为9．96％。4．2基于l8SrRNA基因的牛环孢子虫分离株种系发育关系由于18SrRNA基因具有较高的保守性，因此，18SrRNA基因对区分环孢子虫种问和的不同分离株之间的亲缘关系是十分有用的。另外，分析来源于人类和狒狒的环孢子虫分离株的18S核糖体DNA(rDNA)显示有1．6～1．7％的差异，然而人类和狒狒的环孢子虫的克隆株的差异分别有0．78％和0．73％13引。在另一项研究中显示，Cpapion&，Ccolobi，和Ccercopitheci的18SrRNA基因与人类的分离株有0．3～0．6％的序列差异I”I。对于本次研究，从河南省奶牛体内分离的环孢子虫与与从广州分离的Guangzhou1株和从日本分离的Cyclosporasp．Oita株在同一个分离株上，显示其情缘关系较从狒狒中分离的Cpapionis，从疣猴中分离的C．colobi，从非洲绿猴中分离的Ccercopitheci和从人体中分离的Ccayetanebsis近。由于牛环孢子虫侵袭奶牛，对于奶牛的生产性能造成较大危害，甚至可能危及生命。本试验从分子流行病学和种系发育进化方面进行了初步的探索，但奶牛环孢子虫还是未定种，其诸多的生物学特性还有待进一步的研究。第52页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文结论和创新点1结论1．1非人灵长类肠道寄生虫感染率为54．05％，野生型的猴类感染率最高为70．47％。1．2流式细胞仪在设定的参数下，事件发生数在34．90个之间即为疑似，在91个以上即可诊断为环孢子虫病感染。1．3河南省人环孢子虫分离株与其他地区分离株18SrRNA基因只有一个碱基差异，不同分离株之间ITS．1基因的序列差异较大。1．4河南省奶牛环孢子虫感染率为3．58％，从河南省奶牛体内分离的环孢子虫与广州分离株GZI和日本分离株Cyclosporasp．Oita亲缘关系最近。2创新点2．1建立流式细胞仪检测环孢子虫卵囊的方法。2．2基于环孢子虫18SrRNA基因的PCR．RFLP方法将环孢子虫与艾美尔球虫区分。2．3对河南省奶牛环孢子虫进行了分子流行病学调查和分子鉴定。第53页共“页 万方数据塑塑奎些奎兰!!!!星堕主堕壅生兰篁笙奎参考文献【l】田朝阳，杨守凯．非人灵长类动物在医学科学实验中的应用【J】．中国比较医学杂志，2009，19(6)：74-77．【2】AshfordRW．OccurrenceofanundescribedcoccidianinmaninPapuaNewGuinea【J】．1979，73(5)：497-500．【3】OrtegaYR，SterlingCR．，GilmanRH，eta1．Cyclospraspecies-anewprotozoanpathogenofhuman【J】．TheNewEnglandJournalofMedicine，1993，328(18)：1308．1312．【4】OrtegaYR，SanchezR．UpdateonCyclosporacayetanensis，aFood．BorneandWaterborneParasite[J】．ClinicalMicrobiologyReviews，2010，23(1)：2】8-234．[5】HerwaldtBL．Cyclosporacayetanensis：areview，focusingontheoutbreaksofcyciosporiasisinthe1990s【J】．ClinInfectDis，2000，31(4)：1040-1057．【6】6D611erPC，DietrichK，FilippN，eta1．OutbreakinGermanyAssociatedwiththeConsumptionofSalad[J】．EmergingInfectiousDiseases，2002，8(9)：992．994．【7】CenterforDiseaseControlandPrevention．CyclosporiasisOutbreakInvestigations．UnitedStates．2013(FinalUpdate)【EB／OL]．http：llwww．cdc．gov／parasites／cyclosporiasis／outbreaks／investigation．2013．html，2013-12-2／2014．4．28．【8】叶砒婧，姚辉，向左甫．非人灵长类肠道寄生虫研究进展【J】．安徽农业科学，2013，41(12)：5384-5388．【9】和占龙，杨建发，杨亮宇，等．自繁猕猴肠道寄生虫的调查报告[J】．云南畜牧兽医，2006，42(1)：42．43．[10]吕向辉，陈旭旭，袁美群，等．圈养川金丝猴、猕猴肠道寄生虫感染及其形态观察【J】．经济动物学报，2010，14(2)：92．95．11l】胡延春，程安春，陈正礼，等．四川绵阳地区野生猕猴肠道寄生虫感染的调查研究【J】．四川动物，2008，27(6)：1038-1040．[12】蔡娟，乔继英，张旭，等．陕西圈养珍稀野生动物肠道寄生虫感染及其形态观察【J】．动物学杂志，2009，44(3)：63-69．[131纪欢．黄山短尾猴与游人接触行为及肠道寄生虫感染的研究【D】．合肥，安徽大学，2010．【14】赵金凤，齐萌，王鹤磊，等．圈养猕猴肠道寄生虫感染情况调查【J】．河南农业科学，201l，40(7)：135-138．【15】吕超超，王岩，宁长申，等．野生太行猕猴肠道寄生虫感染的初步调查【J】．动物学杂志，2009，44(I)：74-79．[161李健，全琛宇，施维，等．广西地区人工驯养繁猕猴、食蟹猴胃肠道寄生虫感染情况的初步调查【J]．实验动物与比较医学，2013，33(4)：279．284．【l7】CamPD，SorelN，DanLC，eta1．AnewcontributiontotheepidemiologicalsurveyofCyclosporacayctanensisinHanoiwatersupplies(Viet-Nam)；a12-monthlongitudinalstudy【J】．第54页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文MedecineetMaladiesInfectieuses，2001，3l(10)：591-596．【18]Sfinchez-VegaJT，Cabrera-FuentesHA，Romero-OlmedoAJ，eta1．Cyclosporacayetanensis：ThisEmergingProtozoanPathogeninMexico【J】．TheAmericanJournalofTropicalMedicineandHygiene，2014，90(2)：351-353．【19】夏艳勋，李国清．环孢子虫病的研究进展【J】．中国人兽共患病杂志，2004，20(21)：1001．1003．【20】ZhouY，LvB，WangQ，eta1．PrevalenceandMolecularCharacterizationofCyclosporacayetanensis，Henan，China．【J]．EmergInfectDis，2011，17(10)：1887-l890．【21】DowdSE，DavidJ，EliopolusJ，etai．ConfirmeddetectionofCyclosporacayetanesis，EncephalitozoonintestinalisandCryptosporidiumparvuminwaterusedfordrinking【J】．JournalofWaterandHealth，2003，l(3)：117-123．[22】MiegevilleM，KoubiV，DanLC，eta1．CyclosporacayetanensispresenceinaquaticsurroundingsinHanoi(Vietnam)Environmentalstudy(wellwater，lakesandrivers)【J】．BullSocPathoiExot，2003，96(3)：149-152．[23】El-KaramanyEM，ZaherTI，El·BahnasawyMM．RoleofwaterinthetransmissionofCyclosporiasisinSharkiaGovernorate，Egypt【J】．JEgyptSocParasitol，2005，35(3)：953-962．[24】ShieldsJM，OlsonBH．PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismmethodfordetectionofCyclosporacayetanensisinenvironmentalwaterswithoutmicroscopicconfirmation【J】．AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2003，69(8)：4662-4669．[25】TramNT，HoangLM，CamPD．，etai．Cyclosporaspp．inherbsandwatersamplescollectedfrommarketsandfarmsinHanoi，Vietnam[J】．TropMedIntHealth，2008，l3(11)：l415—1420．【26】岳彩玲，李国清，颜超，等．犬源环孢子虫的形态学与分子鉴定【J]．中国人兽共患病学报，2010，26(2)：124·127．【27】SancakB，AkyonY，ErguvenS．CyclosporainfectioninfiveimmunocompetentpatientsinaTurkishuniversityhospital【J】．JournalofMedicalMicrobiology，2006，55(4)：459—462．【28】HogeCW，EcheverriaP，RajahR，eta1．PrevalenceofCyclosporaspeciesandotherentericpathogensamongchildrenlessthan5yearsofageinNepal[J]．JournalofClinicalMicrobiology，1995，33fl1)：3058-3060．【29】徐前明，李国清．环孢子虫的研究进展【J】．寄生虫与医学昆虫学报，2008，15(1)：55．60．[30】王克霞，李朝品，王健，等．安徽省部分地区不同人群中圆孢子虫感染的初步调查【J】．中华流行病学杂志，2003，24(2)：93．【3l】BernC，HemandezB，LopezMB，eta1．EpidemiologicstudiesofCyclosporacayetanensisinGuatemala【J】．EmergingInfectiousDiseases，1999，5(6)：766·774．【32】OzdamarM，HakkoE，TurkogluS．HighoccurrenceofcyclosporiasisinIstanbul，Turkey，duringadryandwarmsummer【J】．Parasites&Vectors，2010，3：39．【33】TandukarS，AnsariS，AdhikariN，eta1．IntestinalparasitosisinschoolchildrenofLalitpurdistrict第55页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文ofNepal【J】．BMCResearchNotes，2013，6：449．【34】LainsonR．ThegenusCyclospora(Apicomplexa：Eimeriidae)，withadescriptionofCyclosporasehneiderin．sp．inthesnakeAniliusscytalescytale(Aniliidae)fromAmazonianBrazil—areview【J】．MemlnstOswaldoCruz，2005，lOO(2)：l03-llO．[35】EberhardML，SilvaAJ，LilleyBG，eta1．MorphologicandmolecularcharacterizationofnewCyclosporaspeciesfromEthiopianmonkeys：C．cercopithecisp．n．，c．colobisp．n．，andCpapionissp．n．【J】．EmergingInfectiousDiseases，1999，5(5)：651—658．【36】肖淑敏，李国清，周荣琼，等．牛源环孢子虫的发现与分子鉴定【J】．中国预防兽医学报，2006，28(4)：380—383。[37】Relman，DA，SchmidtTM，GajadharA，eta1．MolecularphylogeneticanalysisofCyclospora，thehumanintestinalpathogen，suggeststhatitiscloselyrelatedtoEimeriaspecies【J】．J．InfectDis，1996．173(2)：440-445．【38】LopezFA，ManglicmotJ，SchmidtTM，eta1．MolecularcharacterizationofCyclospora-likeorganismsfrombaboons【J】．J．InfectDis，1999，l79(3)：670-676．[39】GalvanAL，MagnetA，lzquierdoF，eta1．MolecularcharacterizationofHuman-pathogenicmicrosporidiaandCyclosporacayetanensisisolatedfromvariouswatersourcesinSpain：ayear-longlongitudinalStudy【J】．ApplEnvironMicrobiol，2013，79(2)：449-459．[40】高振永，李国清，岳彩玲，等．猴源环孢子虫巢式PCR检测方法的建立【J】．中国动物传染病学报，20l0，18(5)：32-36．【41】OlivierC，vandePS，LeppPW，eta1．SequencevariabilityinthefirstinternaltranscribedspacerregionwithinandamongCyclosporaspeciesisconsistentwithpolyparasitism【J】．IntJParasitol，2001，3l(13)：1475—1487．【42】肖淑敏，李国清，周荣琼，等．以ITS-l+序列鉴定牛源环孢子虫【J】．中国兽医学报，2007，27(1、：59-65．【43】周洋，王强，吕彪，等．环孢子虫流行病学、分类及其遗传特征的研究进展【J】．中国人兽共患病学报，2009，25(3)：283—287．【44】Sulaiman1M．，TortesP，SimpsonS，eta1．SequencecharacterizationofheatshockproteingeneofCyclosporacayetanensisisolatesfromNepal，Mexico，andPeru【J】．JParasitol，2013，99(2)：379·382．[45】张晓丽，张唯哲，沈玉娟，等．卡耶塔环孢子虫的生物学和流行病学研究进展【J]．国寄生虫学与寄生虫病杂志，2012，30(4)：325．328．【46】DixonBR，BusseyJM，ParringtonLJ，eta1．DetectionofCyclosporaCayetanensisoocystsinhumanfecalspecimensbyflowcytometry【J】．JClinMicrobiol，2005，43(5)：2375-2379．[47】HelmyMM，RashedLA，Abdel-FaRahHS．Co-infectionwithCryptosporidiumparvumandCyclosporacayetanensisinimmunocompromisedpatients【J】．JEgyptSocParasitol，2006，36(2)：613-627．第56页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文【48】OrlaniPA．，LampelKA．Extraction-flee，filter-basedtemplatepreparationforrapidandsensitivePCRdetectionofpathogenicparasiticprotozoa【J]．JournalofClinicalMicrobiology，2000，38(6)：2271-2277．【49】程家林，李国清，岳彩铃，等．鸭粪中环孢子虫18SrDNA部分基因和ITS．1基因的克隆与分析[J】．动物医学进展，2010，3l(4)：6-10．[50】LiW，KiuliaNM，MwendaJM，eta1．Cyclosporapapionis，Cryptosporidiumhominis，andHuman—PathogenicEnterocytozoonbieneusiinCaptiveBaboonsinKenya【J】．JournalofClinicalMicrobiology，201l，49(12)：4326-4329．【51】AdamRD，OrtegaYR，GilmanRH，eta1．Interveningtranscribedspacerregion1variabilityinCyclosporacayetanensis【J】．JournalofClinicalMicrobiology，2000，38(6)：2339-2343．【52】XiaoSM，IiGQ，ZhouRQ，eta1．CombinedPCR—oligonucleotideiigationassayfordetectionofdairycattle·derivedCyclosporasp．【J】．VetParasitol，2007，149(34)：185·190．【53]OrlandiPA，CanerL，BrinkerAM，eta1．Targetingsingle-nucleotidepolymorphismsinthel8SrRNAgenetodifferentiateCyclosporaspeciesfromEimeriaspeciesbymultiplexPCR【J】．ApplEnvironMicrobial，2003，69(8)：4806-4813．【54】HusseinEM．MolecularidentificationofCycosporaspp．UsingmultiplexPCRfromdiarrheicchildrencomparedtoothersconventionalmethods[J】．EgyptSocParasitoi，2006，36(2)：613-627．【55】LeeSH，JoungM，YoonS，eta1．MultiplexPCRDetectionofWaterborneIntestinalProtozoa：Microsporidia，Cyclospora，andCryptosporidium【J]．KoreanJParasitol，20l0，48(4)：297-301．【56】TaniuchiM，VerweijJJ，SethabutrO，etai．MultiplexPCRmethodtodetectCyclospora，Cystoisospora，andMicrosporidiainstoolsamples【J】．DiagnMicrobiolInfectDis，201l，71(4)：386．390．【57】VarmaM，HesterJD，SchaeferFW，eta1．DetectionofCyclosporacayetanensisusingaquantitativereal-timePCRassay【J】．MicrobioiMethods，2003，53(1)：27-36．[58】LalondeLF，GajadharAA．HighlySensitiveandSpecificPCRAssayforReliableDetectionofCyclosporacayetanensisOocysts【J】．AppliedEnvironmentalMicrobiology，2008，74(14)：4354-4358．【59】SwarnaS，MadhavanR，GomathiS，eta1．ChronicdiarrheaduetoCyclosporaspp．Infection[J]．TropParasit01．2013，3(1)：85-86．【60】EkhlasH，AzzaK，BasmaA，eta1．OpportunisticParasitesamonglmmunosuppressedChildreninMiniaDistrict，Egypt【J】．KoreanJParasitol，2012，50(1)：57-62．【61】CamPD，SorelN，DanLC，eta1．AnewcontributiontotheepidemiologicalsurveyofCyclosporacayctanensisinHanoiwatersupplies(Viet-Nam)；a12·monthlongitudinalstudy【J】．MedecineetMaladiesInfectieuses，2001，3l(10)：59l-596．[62】杨楠，齐萌，菅复春，等．圈养野生动物肠道寄生虫感染情况调查【J】．河南农业科学，2011，40(3)：l54·l57．第57页共“页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文【63】ChaputMP．RecoveryandpurificationofCyclosporacayetanensisoocystsusingsucrosegradients[J]．FDAlaboratoryinformationbulletin．1999，15(4)：4163．[64】TandukarS，AnsariS，AdhikafiN，eta1．IntestinalparasitosisinschoolchildrenofLalitpurdistrictofNepal[J】．BMCResearchNotes，2013(6)：449．[65】DegirmenciA．，SevilN，GunesK，eta1．DistributionofintestinalparasitesdetectedintheparasitologylaboratoryoftheEgeUniversityMedicalSchoolHospital，in2005叨．TurkiyeParazitolDerg，2007，31(2)：133—135．【66】邢文鸾，吴康为，林秀英，等．温州地区腹泻患者圆孢子虫感染情况调查【J】．中国寄生虫病防治杂志，2002，15(5)：320．【67】张炳翔，俞慧，张莉莉．云南省腹泻患者圆孢子虫和隐孢子虫感染情况调查分析[J1．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2002，20(2)：106．108．[68】GuptaAK．IntestinalcoccidianparasiticinfectionsinruralcommunityinandaroundLoni，Maharashtra[J】．JParasitDis，201l，35(1)：54-56．【69】MansfieldLS，GajadharAA．Cyclosporacayetanensis：Afoodandwaterbornecoccidianparasite【J】．VetParasitol，2004，126(2)：73-90．【70】GuptaAK．IntestinalcoccidianparasiticinfectionsinruralcommunityinandaroundLoni．Maharashtra[J】．JParasitDis，201l，35(1)：54·56．第58页共64页 万方数据河南农业大学2014届硕士研究生学位论文EpidemiologyInvestigationandMolecularBiologyofCyclosporasp．FromHumanandCattleSupervisor-Prof．ZhangLongxianMasterCandidate：LiJunqiangABSTRACTCyclosporacayetanensisisakindofnewpathogenofintestinalparasitewhichmainlyinfectedthetourists，HIV／AIDSpatientsandresidentsinendemicarea．Theparasitesparasitizeinthehumanintestinalepithelialcells，anditcancausehumangastroenteritissuchasdiarrhea，intestinalcramps，lossofappetite．Beforel995，therewereonlysporadicreportsaboutCyclosporainfection．Duringl996tO1997，theUnitedStatesandCanadahadalargeCyclosporaoutbreaks，atotalof2944Cyclosporacayetanensisinfectioncaseswerereported．Since2000，theUnitedStates，Canada，Britain，Turkey，Colombia，SouthAfricaandsomeotherregionshadCyclosporaoutbreaks，especiallysinceJuly2013intheUnitedStatesmorethan25statesincluding63lcasesofCyclosporainfectioncaseshadconfirmed，andatleast49caseshospitalizedduetoseverediarrhea．ThefirstCyclosporainfectionreportedwas1995inChina，sincethenYunnan，Anhui，ZhejianghavehadCyclosporainfectioncasesreported．SinceCyclosporasiscauseseriouseconomicloss，evenendangerthelifeandhealth，therearemoreandmorescholarsgettheattentionoftheCyclospora，bothindevelopingcountriesandthedevelopedcountry．Inordertorealizetheinfectionstatusofintestinalparasitesofthenon-humanprimateanimal，andtheiodinestainingandsaturatedsucrosefloatingmethodwereused，3234fecessamplesweredetectedundertheopticalmicroscopy．Theresultsshowsthattherewerel748sampleswereintestinalparasitespositive，theoverallinfectionratewas54．05％，includinglintestinalparasites．ThehighestinfectionwasAmoeba，followedbywhipwormandroundWOrmS．Onlyonespeciesparasiteinfectionratesashighestas40．41％，thetwospeciesparasitesmixedinfectionratewasl1．66％，3orabovemixedinfectionratewas1．98％．ThehighestmixedinfectedofintestinalparasitesspecieswereAmoebasandwhipworm．Thesamplesweredividedintothewild，thecaptiveandtheZOOtypeaccordingtothedifferentmethodsofbreeding，theinfectionrateswere70．47％，55．99％and42．76％，respectively．Therehasstatisticallydifferenceindifferenttypesofbreedingbetweennon-humanprimatesinfectionsituationofintestinalparasites(P
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