贝氏贝诺孢子虫遗传进化分析及巢氏pcr检测方法的建立

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1、本论文受到黑龙江省科技攻关项目“黑龙江省集约化养殖奶牛寄生虫病综合防控技术体系的建立与应用”（GZ13B001）、黑龙江省农垦总局科技攻关项目“垦区集约化养殖牛寄生虫病综合防控技术体系的建立与应用”（HNK125B-11-4）、黑龙江省动物普通疾病防治重点实验室开放课题（120101）资助，特此致谢！摘要贝氏贝诺孢子虫（Besnoitiabesnoiti）主要寄生于牛的眼、皮肤和生殖系统等部位，引起牛贝诺孢子虫病（Besnoitiosis）。牛感染后会出现消瘦、贫血、水肿及消化功能障碍，导致母牛流产、产奶量下降、公牛精液质量下降，严重感染时可引起死亡，

2、给养牛业带来重大的经济损失。目前对贝诺孢子虫的研究主要集中在贝诺孢子虫病的流行病学、诊断和综合防治等传统寄生虫学方面，在分子水平上仅对核糖体内转录间隔区1（internaltranscribedspacerITS1），进行了研究，对线粒体全基因组的研究还未见报道。因此，本研究的第一部分内容是利用分子生物学的方法，扩增贝氏贝诺孢子虫的线粒体全基因组和贝氏贝诺孢子虫中国株的ITS-1序列，对获得的整个线粒体基因组序列和ITS-1进行测序和序列分析，并基于线粒体基因组蛋白质编码基因序列和核糖体rDNA的ITS-1构建系统发生树，探讨贝氏贝诺孢子虫与孢子虫科其

3、他原虫的进化关系，确定其在原虫中的分类地位。结果，获得的贝氏贝诺孢子虫线粒体全基因组由2个蛋白质编码基因和7个tRNA基因组成，大小为3679bp。整个线粒体基因组中核酸组成为A=29.14%，C=19.30%，G=18.48%，T=33.08%，A+T占62.22%，G+C占37.78%，基因组碱基组成明显偏好碱基A和T。以串联的线粒体2个蛋白质编码基因为基因标记，采用BI、MP和ML法构建系统发生树的结果相似，进化树分为二个大的分支，叶足亚纲和球虫亚纲各为一支。在球虫亚纲中，真球虫目和梨形虫目各为一独立分支。在真球虫目中，艾美耳亚目和血孢子亚目各为

4、一个大的分支。在艾美耳亚目中，艾美耳科为一个大的分支，其他科共同位于一个分支上。而贝氏贝诺孢子虫与刚地弓形虫、新孢子虫和哈蒙球虫在一个姐妹分支上，是亲缘关系最近的虫种。此结果与传统形态学分类一致，说明线粒体全基因序列是研究寄生虫分子种系发生的良好基因标记。以所获得的ITS-1rDNA为基因标记，采用MP、ML和BI三种方法构建系统发生树的结果相似，贝氏贝诺孢子虫与刚地弓形虫、新孢子虫和哈蒙球虫在一个姐妹分支上。此结果与以线粒体全基因序列为标记基因构建的进化树结果相似，同时贝氏贝诺孢子虫中国株和美国、德国、澳大利亚、以色列等国家检出的病原一致。贝氏贝诺孢

5、子虫病诊断方法的研究一直还停留在最原始的临床观察诊断方面，但是对感染贝氏贝诺孢子虫的病牛来说，在感染初期，病牛临床表现不明显，出现临床症状的时候已经到了晚期，只能选择淘汰，给畜牧业造成重大的经济损失。因此本研究的第二部分内容是在分子水平上，建立一种快速、准确的诊断方法，对疾病进行早期诊断，以减少经I济损失。根据已发表的贝诺孢子虫rDNA序列，设计贝氏贝诺孢子虫rDNAITS巢氏引物。提取病牛含有贝氏贝诺孢子虫血液的基因组总DNA，进行巢氏PCR扩增和测序，建立一种快速、特异、敏感的巢氏PCR诊断方法，并应用该方法对黑龙江省部分地区196份奶牛血液样品进

6、行感染情况检查。结果表明，建立的贝诺孢子虫巢式PCR方法具有敏感、特异的优点；临床检测出阳性血样3份，阳性率为1.53%。本研究首次获得了贝氏贝诺孢子虫的线粒体全基因组序列，并对其特征进行了分析，丰富了原虫线粒体全基因组资料，基于线粒体基因组蛋白编码序列和ITS-1序列构建的系统发生树从分子水平上明确了贝氏贝诺孢子虫及其他原虫的进化关系，为其它寄生原虫群体遗传学、系统发生学的研究奠定了基础。首次建立了奶牛贝诺孢子虫巢氏PCR的诊断方法，并对黑龙江省部分地区奶牛感染情况进行初步调查，为该病进一步的防控提供可靠依据。关键词：贝氏贝诺孢子虫，线粒体全基因组，

7、核糖体ITS-1，遗传进化分析，巢氏PCRIIAbstractBesnoitiabesnoitimainlyparasitizeinthescleralconjunctiva,skin,subcutaneousconnectivetissue,mucosalmembranes,testes,vaginaofBovine,andresultinemaciation,anemia,swelling,digestivedysfunction,whichmaycausecattletomiscarry,reducemilkproduction,declines

8、eminalquality,andevenleadtodeath.Therefore,Besn