维生素D受体在炎性肌病的发病作用及维生素D的干预研究

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分类号：，学校代码密级：学号：论文题目：维生素受体在炎性肌病的发病作用及维生素的干预研究擂士莩位文培养院系医学院一级学科临床医学二级学科内科学论文作者汪静洋指导教师蒲传强教授新長南开大学研究生院旅年月 中图分类号学校代码：：密级：公开博士学位论文维生素受体在炎性肌病的发病作用及维生素的干预研究论文作者汪静洋指导教师蒲传强申请学位临床医学博士培养单位解放军总医院南开大学学科专业内科学研究方向肌肉病答辩委员会主席崔丽英评阅人崔丽英黄一宁贾建平卢家红卜碧涛南开大学研究生院二〇一四年五月 南开大学学位论文使用授权书根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在《著作权法》规定范围内的学位论文使用权，即：（学位获得者必须按规定提交学位论文包括纸质印刷本及电子版，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》；（为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；（根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；（学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及其万方数据电子出版社和中国学术期刊光盘电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：汪静洋年月日南开大学研究生学位论文作者信息论文题目维生素注射液对抗原诱导的肌炎模型的治疗作用姓名汪静洋学号答辩日期年月日论文类别博士々学历硕士口硕士专业学位口高校教师口问等学力硕士口院系所医学院专业内科学联系电话通信地址邮编：备注：是否批准为非公开论文否注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式两份签字后交校图书馆，非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。 南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公幵发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：汪静洋年月日非公开学位论文标注说明本页表中填写内容须打印）根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公幵学位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目申请密级口限制年）口秘密年口机密￡年）保密期限年月日至年月曰审批表编号批准日期年月日南开大学学位评定委员会办公室盖章有效注：限制女年可少于年秘密★年可少于年机密女年可少于年 摘要摘要目的：本研究旨在了解维生素受体在炎性肌病发病过程中的作用，并观察维生素对实验性免疫性肌炎动物模型的肌肉组织及血清的、促炎因子、抑炎因子及调亡相关因子的干预作用，以探讨在肌炎的发病机制及的可能对其的防治作用。方法：采用肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素免疫豚鼠以建立实验性免疫性肌炎动物模型；通过方法检测炎性肌病患者肌肉组织、、和的表达；应用分子生物学方法检测实验性免疫性肌炎动物模型的肌肉组织的、、、、、、丫、和表达；釆用方法测定实验性免疫性肌炎动物模型血清促炎因子（，，，、抑炎因子，，、调亡相关细胞因子（，，、和的浓度。以上所得数据均采用分析，正态分布的数据用检验，对于非正态分布的数据，选用非参数检验法。两变量间相关性分析釆用双侧检验法，检验水准，被认为差异有统计学意义。结果：、采用兔肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素联合免疫的豚鼠可以模拟人类肌炎的肢体无力症状及出现典型的病理改变，符合较理想的实验性免疫性肌炎动物模型。、炎性肌病患者肌肉组织出现、、与的显著表达；但肌肉组织的表达与、和的表达均无显著的相关性，提示独自参与炎性肌病的发病过程。、肌炎动物模型肌肉组织出现蛋白的表达，而更增强蛋白的表达， mm提示可能通过提高表达以减轻肌肉组织的炎症反应。且能够降低肌肉组织中炎症性因子、和的表达、升高肌肉组织中的抑炎因子、和的表达，提高肌炎动物模型肌肉组织和的表达，从而抑制炎症的发展。但除了能降低肌炎动物模型血清的含量外，对血清、、、、、、、、和含量的变化没有明显的影响。结论：、釆用兔肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素联合免疫豚鼠，可以模拟为较理想的实验性免疫性肌炎动物模型。、与、和参与人类炎性肌病的发病过程，但相互不存在依赖性。、可能通过提高的表达，降低炎症性因子和升高抑炎因子，达到防治炎性肌病的作用。关键词：维生素维生素受体；实验性免疫性肌炎动物模型；抑炎因子；促炎因子 AbstractAbstractObjective:WeaimedtoillustratetheeffectofVitaminDreceptor(VDR)inthepathogenesisofmyositis.WiththetreatmentofVitaminD，、、、、、、，，，，，，， AbstractmuscletissuebyelevatingthelevelofVDR.VDalsocanreducethepro-inflammatoryfactors(IL-6，，，，，，，，，，，，， 目录目录第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立弓第二节材料和方法实验动物选取和分组实验试剂及免疫原的配制免疫方法标本的获取肌肉酶组织化学检査苏木素伊红染色改良还原型辅酶四唑蓝还原酶（氧化酶组织化学染色法改良染色法染色（临床观察与病理形态观察指标第三节结果表现肌肉组织病理第四节讨论第五节小结第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第一节引言第二节材料和方法病人的入组和样本肌肉组织的获取、处理及保存 目录生化指标分析、、、的测定肌肉组织总提取浓度测定的反转录实时定量实时定量所需引物统计学分析第三节结果■表现炎性肌病患者肌肉组织表达炎性肌病患者肌肉组织、、的表达变化炎性肌病患者血清、、、水平肌肉组织、、和的表达和血清和水平的相关性第四节讨论第五节小结第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用第一节引言第二节材料与方法实验动物选取和分组模型的建立给药方法标本的获取与保存临床观察与病理形态观察指标肌肉组织各种生物活性因子的表达检测测定指标包括、、、、、、、、、 目录肌肉组织总提取浓度测定的反转录实时定量肌肉组织蛋白测定血清促炎因子、抑炎因子、凋亡相关因子、和含量测定统计学分析：第三节结果丨床表现肌肉病理形态学改变（对肌肉组织中蛋白表达的影响对肌肉组织，和表达的影响对肌肉组织、、和表达的影响对肌肉组织、的表达的影响对肌肉组织表达的影响对血清、、、、含量的影响对血清，含量的影响对血清、、含量的影响对血清和含量影响及其相关性分析肌肉组织与血清促炎因子、抑炎因子及凋亡相关细胞因子的相关性分析第四节讨论第五节小结舰参考文献麵 目录■隱个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果 符号说明符号说明缩略英文名称中文名称特发性炎症性肌病多发性肌炎皮肌炎包涵体肌炎肢带型肌营养不良诱导共刺激分子配体实验性自身免疫性肌病完全弗氏佐剂苏木素伊红染色改良还原型辅酶四唑蓝还原酶维生素受体维生素趋化因子受体颗粒酶肌酸激酶乳酸脱氢酶谷丙转氨酶谷草转氨酶调节性细胞干扰素白介素 符号说明符号说明续上表白介素白介素白介素白介素白介素白介素转化生长因子肿瘤坏死因子细胞毒淋巴细胞相关抗原淋巴细胞瘤相关死亡人促进因子相关蛋白炎性肠病多发性硬化系统性红斑狼疮破碎的红纤维实时定量曲线下面积 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第一节引言特发性炎性肌病（是一组慢性、获得性、炎性的骨豁肌自身免疫性疾病。这组疾病都有明显的肌肉无力和肌萎缩，病理上肌肉组织中炎性细胞的浸润。根据临床表现，人口学特点，组织病理和免疫学改变，这组疾病分为三种类型，包括多发性肌炎（、皮肌炎（，及包涵体肌炎（。特发性肌炎的病因和病理生理过程还不清楚，也体现出了该疾病的复杂性。人类的为一种主要以骨豁肌受累的全身性炎症性疾病，临床上主要表现为对称性的四肢近端的无力和肌萎缩，亦可伴有吞咽困难和发音困难，少有累及呼吸肌而出现呼吸困难的情况，部分患者可能伴有间质性肺炎和恶性肿瘤，一般这种情况预后较差。血清肌酶升高，肌电图表现为肌源性损害，其病理改变包括肌纤维变性、坏死、吞嚼现象及有较多的炎性细胞浸润。为更好的研究炎性肌病，国内外的研究者设计了不同的肌炎模型，运用动物模型模拟肌炎的特点，以研究肌炎的发病机制和治疗药物。目前报道的肌炎模型包括转基因肌炎模型、环境诱导肌炎模型、自发的肌炎模型和抗原诱导的肌炎模型。不同的动物模型用于不同的疾病研究，如转基因动物模型主要是针对包涵体肌炎建立的，该动物模型主要模拟了遗传性包涵体肌炎的发病特点，并用于研究包涵体肌炎的发病机制。环境因素诱导的肌炎模型建立在有大量的证据表明，很多因素可以诱发遗传易感的个体发病，产生肌肉组织的慢性炎症，这些因素包括药物，胶原或硅胶植入，照射紫外线。在一些动物模型上，还运用病毒，药物，饮食和寄生虫感染作为疾病的促发因素。自发性的肌炎模型主要发生在基因已经变异的个体，这种模型与人类的发病和疾病的进程最相近，但是目前只能在狗和的小鼠身上实现，运用不是很广泛。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立研究肌炎的模型最常用的是抗原诱导的肌炎模型，用于诱导的抗原包括同源或异源的肌肉勻衆、蛋白、病毒感染或某些药物等，同时用于造模的动物种类也是多种多样，有猫、狗、小鼠、大鼠和膝鼠，猴等。最常用的主要有小鼠，大鼠和豚鼠，等人报道成功在小鼠建立肌炎模型。国内运用较多报道较多的是用豚鼠作为造模动物也有部分运用大鼠成功建立模型的。另外，在尝试建立模型的过程中，有报道用一些基因敲除动物造模或细胞因子阻滞药物，发现肌炎有所改善或加重。利用肌球蛋白在基因敲除的小鼠造模，发现没有典型的临床和组织病理上肌纤维损伤，考虑可能作为一个促炎因素，它的缺失使肌炎进程阻断，从而减轻了肌肉的炎症。诱导共刺激分子（表达于浸润肌纤维的细胞表面，当运用单克隆抗体时，可减少与配体（，的结合，减少细胞浸润，同时减少了和的表达，从而减轻了肌肉炎症，这些研究都为肌炎的治疗提供了多种途径。尽管国内外研制出较多的实验性免疫性肌炎动物模型，但是，最多用的是采用骨豁肌勾架和完全弗氏佐剂联合免疫皮下和肌肉注射，并配合百日咳毒素腹腔注射，经过次免疫后，周均可成模。以膝鼠为例，可运用家兔的骨豁肌勻梁和完全弗氏佐剂混勻后次免疫藤鼠，使体内产生特异性免疫抗体，肌肉组织内产生抗体，兔骨豁肌和豚鼠骨骼肌有抗原交叉性，同时前两次免疫需要腹腔注射百日咳毒素。研究表明单纯的完全弗氏佐剂免疫不能成模，表明骨豁肌勻衆在实验性自身免疫性肌炎（动物模型的形成过程中有决定性作用。而腹腔注射百日咳毒素的成模率较高，且肌炎更典型，说明百日咳可以使动物对肌球蛋白更易感，从而提高模型的成功率。判断实验性免疫性肌炎动物模型建立是否成功，主要依靠肌酶检查，肌电图检查，和病理学检查。肌酶检查简单，易行，创伤性小，可重复，可是该种 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立检查只能起到辅助检查的作用，不能作为诊断的金标准，因为肌酶较易受其他疾病的干扰，比如大量运动，心脏疾病都可能影响肌酶的水平，从而影响对疾病的诊断。肌电图呈现的是肌源性损害，可排除神经性损害的可能。不过最终诊断最可靠的是病理学检查，镜下找到变性的肌纤维，炎性细胞浸润，肌纤维萎缩，再结合肢体无力的表现，则可确定为实验性免疫性肌炎动物模型成功。为研究维生素受体在肌炎的发病机制及了解维生素对肌炎的干预作用，拟采用肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素联合免疫膝鼠，以制作理想的免疫性肌炎动物模型用于后续的研究。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第二节材料和方法实验动物选取和分组只健康的雌性英国短毛膝鼠（军事医学科学院动物中心提供），体重在之间，年龄为周。随机分为两组，即模型组只和对照组只。实验试剂及免疫原的配制纯化的兔骨賂肌肌球蛋白美国公司）完全弗氏佐剂（美国公司）百日咳毒素（美国公司）免疫原的配制：①模型组的免疫原：将肌球蛋白含肌球蛋白、生理盐水和振荡混匀，此为一只模型组膝鼠的一次免疫药量。②对照组的免疫原：将生理盐水和振荡混勻，此为一只对照组膝鼠的一次免疫药量。免疫方法将模型组的免疫原和对照组的免疫原配制好后，分别注射给不同组的膝鼠。药物每周注射次，每次间隔天，连续周。免疫注射部位为四肢和颈部后个部位皮下注射，注射前药物均需充分混勻。第一和第二次免疫原注射，在注射免疫原的基础上，两组均同时给于约百日咳毒素，每周一次，连续周，注射方式为腹腔注射，药物体积为。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立标本的获取两组膝鼠在末次注射天后，用戊巴比妥麻醉，在麻醉情况下心脏取血，采血后再取四肢肌肉，将肌肉组织用黄苗胶包埋、异戊院处理后，放入液氮，最后转入保存。需染色时，利用恒温切片机切成冰冻切片，厚度为染苏木素伊红染色（肌肉酶组织化学检査苏木素伊红染色（⑴苏木精（滤过）分钟⑵流水冲分钟⑶伊红（分钟⑷流水冲分钟⑶梯度酒精脱水（酒精—酒精—酒精—酒精—酒精—酒精号—酒精号）—二甲苯号—二甲苯号中性树胶封片改良还原型辅酶丨四睡蓝还原酶（氧化酶组织化学染色法配制染液：（氯化硝基四氮哩蓝还原型辅酶液⑵水浴箱°孵育分钟⑶水冲分钟⑷蒸馆水洗遍滤纸上瞭干甘油明胶封片改良染色法 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立⑴苏木精（滤过）分钟⑵流水冲分钟⑶染色分钟⑷冰醋酸洗秒钟梯度酒精脱水（酒精—酒精—酒精—酒精—酒精—酒精号—酒精号）—二甲苯号—二甲苯号中性树胶封片染色（配制酸液（巴比妥醋酸盐酸蒸馆水调制⑵配制孵育液：（巴比妥钠溶液蒸馆水调前加入。⑶酸液染色分钟⑷倒掉酸液，加入孵育液°孵育分钟倒掉解育液，加入溶液，分钟，换液三次倒掉溶液，加入氯化钴溶液分钟用巴比妥钠溶液洗次流水冲洗黄色硫化铵溶液（现用现配）洗秒钟流水冲洗梯度酒精脱水（酒精—酒精—酒精—酒精—酒精—酒精号—酒精号）—二甲苯号—二甲苯号中性树胶封片临床观察与病理形态观察指标每周注射免疫原前称量膝鼠体重，记录体重数值，观察体重的变化趋势。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立观察实验动物的临床指标：①实验动物的活动度；②肢体肌无力程度；③皮毛色泽改变；④皮肤是否有破演；⑤体重变化。病理观察指标：①肌纤维大小；②有无肌纤维坏变及程度；③炎性细胞的浸润；④肌纤维间隙是否增宽。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第三节结果临床表现模型组：完成末次免疫天后，免疫注射部位均发现有直径的硬结，其中只硬结未破馈，其余只均发现硬结不同程度破演现象，只藤鼠均有出现四肢无力，以后肢明显，体重下降，毛色暗淡无光泽，硬结部位及周围肿胀，按压时膝鼠出现挣扎。对照组：完成末次免疫天后，对照组的膝鼠中有只注射免疫的局部有直径小于的硬结，硬结无破淸，余只没有发现明显的肿块，只膝鼠各项活动没有明显异常，毛色有光泽，体重逐渐增加。（图————一一‘一对照模型组‘‘‘说明：个时间点测量脉鼠体重，“”代表第一次注射免疫原，“”代表第二次注射免疫原，“”代表第三次注射免疫原，“”代表第四次注射免疫原。图两组膝鼠体重变化图 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立肌肉组织病理：①对照组膝鼠肌肉组织：肌纤维大小均勾，无肌纤维变性、坏死及吞嚼现象。无肌纤维肥大、分裂和核内移。肌纤维间隙不宽。血管形态正常。未见炎症细胞（图。②模型组豚鼠肌肉组织：肌纤维大小不一，有大量小圆肌纤维。肌纤维变性、坏死，伴有大量炎性细胞浸润，无肌纤维肥大、分裂和核内移。肌纤维间隙增宽（图。：对照组和模型组膝鼠均能显示较多肌纤维膜下有红染现象，提示为线粒体增多现象，但是未见典型或不典型的破碎红纤维。模型组有大量小圆肌纤维和大量炎性细胞浸润。（图，图；对照组肌纤维结构正常，可见型和型肌纤维分化不好，型纤维占优势，而模型组可见大量炎性细胞浸润，坏变肌纤维结构破坏严重。（图图染色：对照组和模型组豚鼠型和型肌纤维分化不好，以型肌纤维占优势，无群组化现象。（图，图 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立、‘一图对照组膝鼠肌肉组织染色（如图示，肌纤维大小均匀，未见炎性细胞）、、：■齊声臂！“‘巧、、袭、：：办、’：、“；■，，讀、：彩”爆麵工画暴：：气：：栽—■、■▲‘；图模型组膝鼠肌肉组织染色（肌纤维大小不均，可看到小圆形肌纤维，大量炎性细胞浸润，肌纤维结构破坏） 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立‘‘：；、‘气：厂‘‘：二：』图对照组膝鼠肌肉组织染色（肌纤维膜下较多红染现象，未见和炎性细胞）樣義經參认々仰、感麟“賴式！徒：，■樣》：‘‘《望；‘：梦，人：七，感：‘：感’二—“、‘、图模型组豚鼠肌肉组织染色（肌纤维大小不均，大量小圆肌纤维，大量炎性细胞，肌纤维结构破坏，可见大量炎性细胞） 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立【細春一…；‘■图对照组豚鼠肌肉组织染色（肌纤维大小均一，型和型肌纤维分化不好，型纤维占优势）：、、；：‘於、分”、、’：广声￡參‘“‘？‘工￡；头、‘擎“《、、女‘么姿，，’一，、、”秦、‘、、，一、、，《雕補‘七、：，，图模型组膝鼠肌肉组织染色（大量坏变肌纤维，结构破坏严重） 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立‘”’■：广攀一“觀‘‘■、、鼻讀：“―■—。’、’■‘、〃‘‘‘■缚‘”‘—…，‘‘‘乂‘图对照组藤鼠肌肉组织染色（可见型和型肌纤维分化不好，以型肌纤维占优势，无群组化现象）孤：一考巧丫‘■说、、广、、‘‘‘；‘；￥、’■”产、飞：厂、’、■‘：、‘。…二“：羞丨：：图模型组膝鼠肌肉组织染色（可见型和型肌纤维分化不好，以型肌纤维占优势，无群组化现象） 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第四节讨论多发性肌炎是一种以肌纤维变性和骨路肌间质性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，属于特发性肌炎的其中一种类型。近年研究显示，体液免疫和细胞免疫机制异常可能都参与疾病的发展，皮质激素和其他免疫抑制剂治疗后部分患者症状好转，也证实了免疫机制在发病过程中起到了一定的作用。但是，本病具体的病因及发病机制仍旧不十分清楚，国内外的研究者们一直致力于寻找到能够模拟人类肌炎病程的动物模型。虽然目前的所有肌炎动物模型并不能完全再现人类的疾病过程，但是在一定程度上，给众多研究者提供了一些研究思路，并为临床工作者们将一些药物用于临床治疗做出了一定的贡献。目前国内研究肌炎模型运用最多的实验动物就是膝鼠。豚鼠血清中含有大量的补体，常用于补体实验，也经常被用作建立自身免疫疾病模型。兔的骨豁肌与膝鼠骨豁肌有抗原交叉性，选取兔肌肉组织中纯化出的肌球蛋白更易使模型建立成功，单纯的完全弗氏佐剂免疫巳经被证实不能造成模型。本研究中，由单纯的完全弗氏佐剂免疫的对照组藤鼠在临床表现和病理检查上，均没有发现四肢无力和肌肉组织病理上的肌炎改变。对照组和模型组的唯一区别就是完全弗氏佐剂与生理盐水混勻，而没有加入兔肌球蛋白，其他的处理因素完全一致，由此可证实肌球蛋白在动物模型建立过程中起到了决定性作用，它作为一种抗原刺激了膝鼠体内特异的免疫反应，使动物体内的抗肌球蛋白抗体滴度增高。单纯的采用肌球蛋白和完全弗氏佐剂虽然能够诱发实验性免疫性肌炎，但是诱导出的肌炎病理改变非常轻，病理评分较低。国外有研究报道，分别釆用膝鼠、人、鸡和兔的肌球蛋白和完全弗氏佐剂免疫大鼠，由人和兔的肌球蛋白免疫的大鼠成功建立实验性免疫性肌炎动物模型，但是病理评分都比较低，炎性细胞浸润和肌纤维破坏都不够明显。而配合百日咳毒素联合免疫大鼠，四种不同种属来源的肌球蛋白均能使大鼠成功建立模型，并且炎性细 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立胞浸润和肌纤维破坏明显，所以百日晐毒素既能够帮助提高釆用不同来源的肌球蛋白免疫模型成功率，同时能够诱发较重的肌炎症状。百日咳毒素是放大联合注射药物造成的体液免疫和细胞免疫的辅助剂。模型与人类多发性肌炎（相比，很多临床表现和病理改变是相似的。模型组膝鼠在免疫第三周开始即出现活动减少，肌力减退，对称性的四肢无力，以后肢症状最重，末次免疫后天活动明显减少，不喜动，按压四肢肌肉出现疼痛、挣扎。模型组肌肉组织染色示，肌纤维大小不一，呈小圆形，肌纤维变性、坏死，大量炎性细胞浸润，大量坏死、姜缩的肌纤维。对照组藤鼠活动良好，按压四肢肌肉没有挣扎。显示肌纤维大小、形态基本正常，未见肌纤维坏死、萎缩和炎性细胞浸润。另外，成功的实验性免疫性肌炎模型的动物血清中能够找到与炎性肌病患者相同的抗肌球蛋白抗体，细胞免疫也主要以细胞和巨唾细胞为主，与人类多发性肌炎十分相似。然而膝鼠有些病理改变与人类的多发性肌炎也有所不同，染色中，肌肉组织中大量红染现象代表了膝鼠肌肉组织线粒体增多，较人类肌肉组织相比，代谢较高，但是这些红染现象并不是破碎红纤维（。考虑的原因可能是因为膝鼠活动较多，代谢与人类相比较旺盛，所需能量大，导致的肌肉中的线粒体较多，从而保证运动中的能量。染色法和酶染色法显示，模型组和对照组型和型肌纤维分化不好，无群组化现象，型纤维占绝对优势，而正常人的肌组织，型和型肌纤维分化良好，无群组化现象，型肌纤维数量能占到，考虑可能这种型和型纤维在数量上与人类的差异，是物种差异造成的，与肌炎模型并没有相关性。综上所述，动物的临床表现和病理改变证明该实验性免疫性肌炎动物模型是比较理想的，因该模型出现的临床表现和病理改变基本符合人类肌炎的特点，且存活率较高。 第一章实验性免疫性肌炎动物模型的建立第五节小结采用兔肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素联合免疫的膝鼠能成功模拟人类肌炎的临床表现和病理改变，为较理想的实验性免疫性肌炎动物模型。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第一节引言炎性肌病是一种累及骨豁肌的慢性炎症性疾病。主要以对称性的近端肢体无力，肌酶升高，肌电图肌原性改变，炎性细胞浸润为主要特点。根据不同的临床表现和组织病理特点，炎性肌病主要分为三种类型：多发性肌炎，、皮肌炎，和包涵体肌炎的病因目前尚未明确，考虑多与病毒感染有关，很多病人在发病前能够找到感染病史，例如感冒或者肠胃炎等，但是感染只是发病诱因，而不是主要的致病因素。目前多认为是由于感染后，患者自身产生的抗体不能识别自身的骨豁肌抗原，而对肌肉产生免疫反应，导致炎性细胞浸润，肌纤维坏死、变性等。是一种以细胞免疫损害为主的疾病，浸润的炎性细胞主要以细胞和巨唆细胞为主，的过度表达对的致病过程至关重要，患者的肌纤维弥漫的表达抗原，细胞必须通过与形成复合体，才能发挥细胞毒作用，免疫损伤肌纤维和毛细血管内皮细胞。细胞主要依靠释放穿孔素和颗粒酶来损伤细胞。另外，越来越多的研究显示、细胞等都参与了疾病的过程。被认为是细胞特异的标志物，在实验性免疫性肌炎动物模型中，若是去除体内的细胞，则肌炎加重，反之外源性注射多克隆细胞，则可以减轻肌炎症状，减少炎性反应。是细胞的特异标志物，主要由细胞产生，能够和其他炎性因子共同作用与肌纤维，使肌纤维结构破坏。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究维生素，是维持人体生命活动必需的营养成分，与体内的齊磷代谢相关，不仅是一种维生素，也是一种激素前体。在体内，血液中循环的的主要形式是，在生理浓度下，没有活性，不能发挥信号分子传递信号的作用。必须在的作用下，转变成后通过维生素受体（，来进行信号传导。年前，肿瘤细胞表面首次被发现存在二轻基维生素，受体，人类对于的传统观念也发生了重大的改变。的生物学效应是通过介导的现已证明不仅存在于经典的軸组织小肠、骨、肾脏、甲狀旁腺，还存在于视网膜、胰腺、垂体、肌肉、睾丸、乳腺、子宫、胎盘、卵巢、脾、骨豁、皮肤等许多组织中。人的单核细胞、激活的细胞、细胞也有。不仅表达于多种免疫细胞上，包括巨唾细胞、树突状细胞、效应细胞和效应细胞，也能表达于人类的骨豁肌组织上。然而在肌肉组织中的表达并不是一直都存在，而只是存在于某个特定的由成肌细胞（肌原性细胞）向肌小管发育的阶段，成熟的肌纤维并没有找到的表达也就是说当肌肉组织出现再生现象比较旺盛的时候，可能的水平就会伴随升高。表达的变化可能对用治疗肌病有十分重要的作用。国外的研究专注于对组织中、、、细胞表达的影响，研究的相关疾病集中在炎性肠病、系统性红斑狼拖、多发性硬化等，而对多发性肌炎的作用相关研究甚少。不过，近期发表的一篇关于特发性肌炎患者血清中水平的研究，发现特发性肌炎的患者与正常健康对照组相比，血中的水平是下降的，且具有统计学意义。那么，水平的下降和肌肉的再生是否影响到肌肉组织的表达？他们的肌肉组织中表达是否有差异，血液中肌酶的变化是否与肌肉组织中及其他免疫相关因子的表达水平有关，这些都值得我们进一步研究。目前关于、细胞、细胞和细胞相关在炎性肌病患者肌肉组织的表达研究很少，且其在肌炎中的发病机制是否有重要的作用 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究仍不清楚，为此，我们拟观察炎性肌病患者肌肉组织是否有、细胞、细胞和细胞相关的表达变化，以探讨炎性肌病的发病机制；同时，为了科学性，我们选择经肌肉酶组织化学、免疫组织化学和基因检查判断为正常者和肢带型肌营养不良（的患者作为阴性对照和阳性对照。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第二节材料和方法病人的入组和样本本研究入选的病例来源于年月日至年月日在解放军总医院神经内科就诊的例患者；这些患者均因肌无力、肌痛和肌酶升高而疑似肌肉疾病来诊，为明确诊断而进行的肌活检。患者信息如表所示。患者在就诊时抽取静脉血查，，和。根据肌肉酶组织化学、免疫组织化学和基因检测结果与相关的诊断标准，将病例分为三组：第一组为特发性肌炎（组人，其中，人为多发性肌炎，人为包涵体肌炎；第二组为组人；第三组为对照组人，此组患者只有肌肉无力和肌酶升高，但活检未发现病理形态学上的异常。肌肉组织的获取、处理及保存在活检前，向病人或其家属讲明活检的目的是为了疾病的明确诊断，还有活检中的风险，包括可能出现感染、药物过敏等。患者或其家属明确与该项检查所有的风险和注意事项后，签署检查治疗同意书。由于需要患者的肌肉组织进行后续的基础实验，在保护患者隐私的基础上，经患者及其家属同意，签署知情同意书。肌肉活检的过程：均选取肱二头肌、三角肌、股四头肌或腓肠肌。术者戴无菌手套，进行局部消毒，铺无菌单，用利多卡因进行局部麻醉。麻醉成功后，切开皮肤约左右、逐层分离皮下组织及筋膜，找到肌肉组织，剪取黄豆粒大小的肌肉组织块。之后进行皮肤缝合。撤无菌单，擦净皮肤并消毒后用纱布铺贴。嘱天换药，天拆线。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究肌肉标本的处理：①用于冰冻切片：将肌肉组织修正为长条状，横切面向上，用黄苗胶包埋固定在小圆木片上，前端高于黄苗胶左右。固定完毕后，在烧杯中加异戊烧，将烧杯轻轻放入液氮中，为了使异戊焼冷却均勻，用镊子不断搅拌异戊焼，待异戊焼充分冷却后，用大镊子夹住包埋好的木片，迅速放入异戊烧，并迅速沿杯壁搅动，避免碰到组织，在异戊烧中搅动左右，待组织完全冷却后放入液氮。所有肌肉组织全部处理完毕后，从液氮取出放入密封袋内，防止组织干燥，放入冰箱保存待用。②用于提取将肌肉组织放入冻存管内，直接放入液氮中保存。生化指标分析釆用自动生化仪测量例血清中肌酶、、、含量。这些肌酶的正常值分别为，为，和均为。、、、的测定肌肉组织总提取①大约每组织加入，室温下操作，用匀榮器高速振荡，室温静置分钟。②每加入氯仿，剧烈振荡上下翻转管），于室温静置分钟。③在°离心机，转分，离心分钟。④将上层水相小心吸起，移入无酶的管中，移入时不要吸到下层，不要贴壁吸。⑤加入冰冷的异丙醇（°，颠倒混勻，静置分钟。混勾需充分，但不宜剧烈。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究⑥在。离心机，转分，离心分钟。⑦加入酒精，颠倒混匀，悬浮沉淀。⑧在°离心机，转分，离心分钟。⑨弃上清，重复一次。⑩干燥。加入水，使溶解。溶解后可冻于冰箱长期保存。浓度测定样品溶于无菌注射用水中倍稀释后检测，。②用无菌注射用水调零，测量样品的和。③的比值最好在之间，纯度最好。的反转录按照反转录试剂盒（每个样品反应体系为：，样品总反应体系为。反应条件为：°分钟，°分钟，°〇分轴实时定量每个样品反应体系为：，灭菌注射用水，每个样品的，总反应体系为。所需的引物如图。。°个循环。一°个循环（溶解曲线）实时定量所需引物 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究表‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘统计学分析本实验中所有数据均用分析，正态分布的数据用检验，对于非正态分布的数据，选用非参数检验法。对于性别分析，选用交联表检验法。相关性分析用检验法。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第三节结果临床表现表为入组病人的临床资料，我们的研究中，组病人的发病年龄范围在至岁之间，明显比炎性肌病组病人的发病年龄小（：并且，炎性肌病组和组病人的性别也具有统计学差异（。炎性肌病更倾向于女性发病，而入组本研究的病人均为男性。但是，这种年龄和性别的差异对肌肉组织中的表达及血液中肌酶水平没有影响。两组病人间肌痛表现也没有统计学差异，但是炎性肌病组病人与正常对照组相比，更倾向于出现上肢近端的肌无力（炎性肌病对照：。下肢和上肢远端肌无力均没有统计学差异。表例患者的临床特点炎性肌病对照值—发病平均年龄性别男女临床特点：肌痛肌无力：上肢：近端远端下肢：近端远端肌海（平均值： 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究炎性肌病患者肌肉组织表达在本研究中，选取作为内参，炎性肌病患者肌肉组织中的表达显著高于组（和对照组（。组肌肉组织表达量也显著高于对照组，且具有统计学差异（。（见图—■技■丁‘—‘友■—：：雜—■图三组肌肉组织（人）中的表达量（炎性肌病患者肌肉组织、、的表达变化与对照组比较炎性肌病组的、和表达有显著性增高；：；：；但与组比较，没有显著性差别。与对照组比较，组的表达有显著性增高但和的表达没有显著性差别。见图。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究”——惡“入；丁謂■“■：：要、顆丨卜—麗：丨丁”一術、《二、：。…丨：：图三组肌肉组织、、的表达量（炎性肌病患者血清、、、水平炎性肌病组的平均值为，而和对照组分别为和。炎性肌病组和组的值都显著高于对照组（肌炎对照组，；对照组，。炎性肌病组的平均值为而组和对照组的平均值为和。炎性肌病组水平明显高于其余两组，与对照组相比，炎性肌病组是对照组的倍。炎性肌病组的平均值为组 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究和对照组的平均值为和。炎性肌病组水平最高，但是只与对照组有统计学差异（，而与组之间并没有差异。炎性肌病组的值为组和对照组值为和。炎性肌病组和组的比对照组水平高，但是三组间均没有统计学差异。所以综上，与对照组相比，炎性肌病组、、都有了显著的升高。（表，图——」、、…—撃⑷‘：！歷：卜；年……键嫌、命务。图三组的、、、水平士 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究肌肉组织、、和的表达和血清和水平的相关性在本研究结果显示肌肉组织、和的表达，且两两之间有很好的相关性图，。但是，肌肉组织的表达与和的表达均没有显著的相关性二图未显示。而相关分析显示的表达与呈正相关，图。而和表达与血清水平无相关性（或者。。。—■■■春：參■——“图三组肌肉组织、、和表达量与血清、、和水平的相关性 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第四节讨论国外有文献报道很多自身免疫病中，血清中水平下降。是发挥作用的受体，不仅表达于多种免疫细胞上，包括巨唾细胞、树突状细胞、效应细胞和效应细胞，也能表达于骨豁肌组织上。然而在肌肉组织中的表达并不是一直都存在于不同时期的肌纤维，而只是存在于由成肌细胞（肌原性细胞）向肌小管发育的特定的阶段，成熟的肌纤维并没有找到的表达也就是说当肌肉组织出现再生现象或者肌肉组织内炎性反应比较旺盛的时候，可能肌肉组织的水平就会伴随升高。在本研究中，炎性肌病组的表达水平与组和对照组相比最高。先前有研究报道与之间的信号传导与凋亡、炎症和自身免疫性疾病相关。炎性肌病和其它自身免疫性疾病的患者会出现血清中水平的下降。类似物能够在体内提高人角质细胞相应受体的表达。而在肌肉组织中表达的升高，更可能是因为炎性肌病的免疫炎症反应较对照组严重，多种浸润的炎性细胞具有受体。另外在肌肉组织中只表达于成肌细胞向肌小管分化的特定阶段。在正常生理状态下，肌肉的卫星细胞以未分化状态存在于肌肉中，当肌肉出现损伤时，这些细胞就会被激发，发育成成肌细胞，进而向肌小管分化。肌小管再发育为再生肌纤维。在这个再生过程中，的表达也十分重要。炎性肌病和组，对照组三组之间的表达均有明显差异。尽管是一种遗传性肌病，但其在发病时，由于病情进展较快，肌纤维坏死明显，可能有免疫因素的参与，因此，组的表达明显。综上表明的表达可能与炎症免疫反应的关系更大。被认为是细胞特异性的标志物，细胞具有抗炎和免疫调节的作用。是细胞特异性的标志物，细胞属于效应细胞的一个特殊亚群，能够分泌和，能够促使细胞因子的产生，和中性粒细胞向炎症组织趋化。通过来介导的细胞 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究聚集对于细胞介导的自身兔疫性疾病的发展是至关重要的。在我们的研究中，和在炎性肌病和这两个疾病中都起到了很重要的作用，并且的表达与的表达呈正相关，说明炎性肌病的发病过程中，肌肉组织中细胞数量的增高也伴随细胞细胞数量的增高。有的研究表明，血清中细胞数量的明显增高常伴随细胞数量的减低，在癌症、型糖尿病、系统性红斑狼掩、乙型肝炎和风湿性关节炎的发病过程中可能都会出现比例的失衡。而的活性形式能够降低上的表达和细胞的分化，所以可能在伴随着水平下降的自身免疫疾病中，和细胞的数量增多、的迁移功能增强，细胞被趋化因子趋化转移至炎症部位，试图限制肌肉中炎症的发展和肌纤维坏死，而导致血液中细胞的减少，所以呈现出炎症部位细胞和细胞数量都增加，而血液中细胞增加的同时细胞却减少。等人在肺泡灌洗液的研究中也发现了这种现象。但是本研究中并没有发现和比例的失衡。毒性细胞能够破坏肌膜，并释放穿孔素和颗粒酶而诱导细胞死亡。炎性肌病组和组、对照组之间的表达均有差异，但是炎性肌病组和组间没有统计学差异，细胞可能参与了这两种疾病的病程。多发性肌炎和包涵体性肌炎（都是主要以细胞浸润为主的自身免疫性疾病，虽然为一种遗传性疾病，但是也有明显的炎性细胞浸润。在我们的研究中，肌肉组织的表达与血清中水平成正相关，与无相关性。但的特异性更高，是神经肌肉疾病最敏感和最有价值的检查方法之一。的高低与疾病的早晚期、急慢性、轻重等很多因素有关系。炎性肌病组血清中水平是三组中最高的，但是与肌肉组织中和其他免疫细胞相关因子的表达均无相关性，考虑肌酶并不能反映当时肌肉组织中炎性细胞的多少，也与平代表的炎性反应的严重程度无关。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究总之，在炎性肌病和的病人，肌肉组织中的表达都有所升高。、、细胞都参与了炎性肌病和疾病的发展，但是的表达可能与炎性细胞、、细胞的数量并没有关系。 第二章炎性肌病患者肌肉组织维生素受体表达与免疫炎性因子相关性研究第五节小结炎性肌病患者肌肉组织出现、、与的显著表达；但肌肉组织的表达与、和的表达均无显著的相关性，提示与、和参与炎性肌病的发病过程中相互不存在依赖性。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用第一节引言由上一章我们发现，炎性肌病的肌肉组织中的表达是明显升高的，结合过去的文献研究，考虑的升高与炎症反应相关，但是与肌肉组织、、导致的炎性细胞浸润并不相关。另外，我们的研究也有一定的不足之处，由于入组的患者发病年龄不同，性别比例不同，病程时间长短也不同，有的可能已经过了炎症的急性期，甚至部分在肌活检时已经接受过激素或免疫球蛋白治疗，这些因素可能都会对研究的结果造成一定的影响。因此，为了更科学地了解炎性肌病肌肉组织的和蛋白的表达，我们进一步采用已经建立的实验性免疫性肌炎动物模型观察肌肉组织和蛋白的表达，并且研究对炎性肌病的干预作用和一些免疫相关因子表达的变化。是维持人体生命活动必需的营养成分。近年的研究显示，还具有广泛的免疫调节作用，与固有免疫和获得性免疫都有密切的联系。的生物学效应是通过介导的现已证明存在于许多组织中。人的单核细胞、激活的细胞、细胞也有。在许多常见的癌症、高血压和心血管疾病的干预和治疗及在大脑发育过程中都有一定的作用，不仅如此，国外很多研究显示，许多自身免疫性疾病患者的血中水平是下降的，其中也包括炎性肌病。第一章中，我们已经在藤鼠成功建立了实验性免疫性肌炎动物模型。采用肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素共同免疫的藤鼠肌炎模型成功率能达到。膝鼠肌炎 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用模型的临床表现和病理改变都基本符合人类炎性肌病的特点。周免疫结束后，模型组膝鼠有皮肤破溃，出现明显的四肢无力，尤以后肢为甚，按压四肢出现挣扎，镜下可找到大量的炎性细胞浸润，肌纤维大小不一，出现大量小圆形肌纤维，肌纤维结构破坏。而对照组膝鼠四肢活动良好，没有按压时出现疼痛，镜下肌纤维大小均一，无肌纤维变性、坏死和吞趣现象，未见炎性细胞浸润。国外的研究专注于对组织中、、、细胞表达的影响，研究的相关疾病集中在炎性肠病、系统性红斑狼搭、多发性硬化等，而对炎性肌病的作用相关研究甚少。不过，近期发表的一篇关于炎’性肌病患者血清中水平的研究，发现炎性肌病的患者与正常健康对照组相比，血中的水平是下降的，且具有统计学意义，不过水平的下降与是否发病相关，但是的水平高低与疾病表现的严重程度并没有相关性。我们在成功建立肌炎模型的基础上，从分子水平去研究治疗组、生理盐水治疗组和对照组膝鼠肌肉组织中表达的变化，观察在没有其他外源干扰因素的情况下，尤其去除病程长短不一和经过激素治疗这些因素的条件下，探讨的表达与炎症反应的严重程度的关系。若是外源性的补充维生素，通过信号转导发挥作用，是否会影响到肌肉组织中表达的变化？另外，在许多常见的癌症、高血压和心血管疾病的干预和治疗及在大脑发育过程中都有一定的作用。还具有广泛的免疫调节作用，与固有免疫和获得性免疫都有密切的联系。早期研究显示的受体在细胞和细胞都有表达且只在有免疫活性并且增殖的细胞表达表明可能起到了抗细胞增殖的作用。同时，在体外能够影响细胞细胞因子的分泌，包括抑制，促进的分泌，，，，与细胞免疫相关，与体液免疫相关，考虑能够促进效应细胞向分化，从而减轻由介导的细胞免疫引起的组织损伤。减少分泌的的数量，通过上调和的转录来诱导的表达，还能抑制细胞介导的免疫反应。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用近年研究显示是另一类效应细胞，与与不同，以能合成而得名。与特定的病原体免疫反应相关，同时它也参与免疫损伤和炎症反应。在自身免疫相关的非糖尿病鼠模型中，外源性补充可以减少的表达，同时敲除基因后，血中会升高，还可能通过抑制和的分泌直接减少的表达。那么，在我们这个实验性免疫性肌炎模型中，外源性补充，会对肌肉组织中这些免疫相关因子造成什么影响，是否炎性肌病与其他自身免疫性疾病内这些炎性因子的改变相同呢？本研究希望通过的免疫调节作用治疗豚鼠的实验性免疫性肌炎模型，观察对肌肉组织表达的影响，并且观察藤鼠血清中抗炎因子和促炎因子的表达分析藤鼠肌肉组织中相应因子的表达的变化，再加上肌肉组织病理上的直观分析，从而探讨对多发性肌炎的作用和影响，为临床治疗该疾病提供一定的指导意义。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用第二节材料与方法实验动物选取和分组只健康的雌性英国短毛膝鼠（军事医学科学院动物中心提供），体重在之间，年龄为周。随机分为三组：组：豚鼠只，均在成功建立肌炎模型的基础上，给予治疗。生理盐水组：膝鼠只，均在成功建立肌炎模型的基础上，给予等体积的生理盐水治疗。对照组：膝鼠只，用等量的和生理盐水建立模型的过程中，不加用肌球蛋白。也不注射生理盐水和治疗。模型的建立见第一章内容。给药方法组：如第一章所述成功建立模型（周）后，开始用进行治疗，所用药物浓度为上海通用药业股份有限公司），每周一和周五注射药物，共周，治疗共次，每次药物剂量为约，注射方式为肌肉注射，四个肢体分别注射约。生理盐水组：如第一章所述成功建立模型（周）后，用生理盐水（与的药物体积相同），于每周一和周五注射，共周，治疗次，注射方式为肌肉注射，四个肢体分别注射约。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用对照组：用等量和等量生理盐水建立模型过程中，不加用肌球蛋白，周后不用生理盐水或肌注治疗。标本的获取与保存三组膝鼠在末次治疗周后，用戊巴比妥麻醉，在麻醉情况下心脏取血，血液经采血管收集后，共离心取上清，保存于低温冰箱，以备后面用于血清促炎因子、抑炎因子、调亡相关因子、和的测定。采血后再取四肢肌肉，四肢肌肉组织分别取一块均用黄蔑胶包埋、异戊院处理后，放入液氮，最后转入保存。需染色时，利用°恒温切片机切成冰冻切片，厚度为，染苏木素伊红染色（具体如第一章所述）》其余肌肉组织放入液氮瞬间冻住后再放入冻存管，最后置于低温冰箱保存，以备用于肌肉组织提取和蛋白裂解液的制备。临床观察与病理形态观察指标每周注射免疫原前称量膝鼠体重，记录体重数值，观察体重的变化趋势。观察实验动物的临床指标：①实验动物的活动度；②肢体肌无力程度；③皮毛色泽改变；④皮肤是否有破溃；⑤体重变化。病理观察指标：①肌纤维大小；②有无肌纤维坏变及程度；③炎性细胞的浸润；④肌纤维间隙是否增宽。肌肉组织各种生物活性因子的表达检测测定指标包括、、、、、、、、。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用肌肉组织总提取①大约每肌肉组织加入，室温下操作，用勻柴器高速振荡室温静置分钟。②每加入氯仿，剧烈振荡上下翻转管，于室温静置分钟。③在°离心机，转分，离心分钟。④将上层水相小心吸起，移入无酶的管中，移入时不要吸到下层，不要贴壁吸。⑤加入冰冷的异丙醇（，颠倒混匀，静置分钟。混匀需充分，但不宜剧烈。⑥在°离心机，转分，离心分钟。⑦加入酒精，颠倒混勾，悬浮沉淀。⑧在°离心机，转分，离心分钟。⑨弃上清，重复一次。⑩干燥。加入水，使溶解。溶解后可冻于°冰箱长期保存。浓度测定①样品溶于无菌注射用水中，倍稀释后检测，。②用无菌注射用水调零，测量样品的和。③的比值最好在之间，纯度最好。的反转录按照反转录试剂盒（，每个样品反应体系为：，样品，总反应体系为。反应条件为：°分钟，°分钟，分 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用钟实时定量每个样品反应体系为：，灭菌注射用水，每个样品的总反应体系为。所需的引物如表。。。。个循环°°个循环（溶解曲线）表膝鼠肌肉组织肌肉组织蛋白测定 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及啁亡因子的干预作用采用方法测定，步骤如下：⑴取液氮冻存的肌肉组织，在研钵内用液氮将肌肉组织捣碎成粉末状，将粉末转入管内，加入裂解液（加入蛋白酶抑制剂。⑵组织在冰上裂解半小时至一小时，其间用手指弹管，使组织充分裂解。：离心，转分，分钟，蛋白存在于上清中。⑷取蛋白上清测蛋白浓度。考马斯亮蓝，加入样品，在波长下测量值。以测出值在至之间为上样最适宜浓度。用裂解液将蛋白浓度调成一致然后取调整蛋白浓度后的样品管，加入管。电泳：上样后，每块胶电流，恒流。将蛋白跑开后可暂停。转印：每块胶电压，恒压，转印小时。牛奶封闭小时。⑶°条件下，一抗封闭过夜。第二天，洗膜，共分钟，每分钟换液一次。室温条件下，二抗封闭小时。洗膜，共分钟，每分钟换液一次。显影。血清促炎因子、抑炎因子、调亡相关因子、和含量测定采用方法分别测定血清促炎因子（，、抑炎因子（，、凋亡相关细胞因子（，，、和的浓度以上所需标准品、质控品、检测试剂盒均由北京凯诺春天公司提供）上述细胞因子检测的操作步骤如下：⑴从室温平衡分钟后的银涪袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用回。。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品。⑶样品孔加入用样本稀释液提前稀释好的待测样品（样本稀释液待测样品空白孔不加。⑷除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，°水浴锅或恒温箱温育分钟。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗漆液，静置分钟，甩去洗漆液，吸水纸上拍干，如此重复洗板次。每孔加入底物、各，°避光孵育分钟。每孔加入终止液，分钟内，在波长处测定各孔的值。统计学分析：本实验中计量资料均用分析，正态分布的数据用检验，对于非正态分布的数据，选用非参数检验法。两变量间相关性分析采用双侧检验法，检验水准，切被认为差异有统计学意义。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用第三节结果临床表现对照组：只豚鼠活动良好，无异常行为，毛色光泽，饮食情况良好，体重逐渐上升，注射局部均无破淸现象，皮下没有硬结。生理盐水组：只膝鼠运动不活跃，毛色暗淡，不整齐，但饮食情况均良好。只膝鼠出现明显四肢无力，其中只藤鼠后肢明显。平均体重有稍微下降趋势，注射部位没有破馈现象，但是每只膝鼠均有明显皮下硬结。组：只膝鼠运动不活跃，其中只藤鼠出现明显四肢肌力减退，毛色暗淡，不整齐，饮食情况均良好，体重上升不如对照组明显，注射免疫部位没有破淸现象，但是每只膝鼠均有明显皮下硬结。（图表棚一一一“一对照组一生理盐水治疗组治疗组‘‘‘’‘图各组藤鼠体重变化图（“”代表第一次注射免疫，“”代表第二次注射免疫，“”代表第三次注射免疫，“”代表第四次注射免疫治疗第一次，“”代表治疗第三次，“”代表取材时，即末次治疗一周后） 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用表膝鼠体重变化值“组别对照组生理盐水组组说明：“”代表第一次注射免疫’“”代表第二次注射免疫’”代表第三次注射免疫，“”代表第四次注射免疫治疗第一次，“”代表治疗第三次，“”代表取材时，即末次治疗一周后肌肉病理形态学改变（对照组：肌纤维大小均匀，无肌纤维变性、坏死。肌纤维间隙不宽。未见炎症细胞。（见图生理盐水组：肌纤维大小不均，萎缩肌纤维呈小圆形，伴有较多的灶性肌纤维变性、坏死，坏变肌纤维周围有大量炎性细胞浸润。（见图组：肌纤维大小不均，萎缩肌纤维呈小圆形，伴有较少的灶性肌纤维变性、坏死，坏变肌纤维周围有一些炎性细胞浸润。（见图 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用‘：二二‘■二纖歡■纖‘、：武‘☆：‘。翁簡务：：上通直瘦图对照组膝鼠肌肉染色“、，愈样夢、讀參，销簡！务：：靖”暮：场图生理盐水组豚鼠肌肉组织染色 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用趣職輪、气‘办；图治疗组豚鼠肌肉组织染色 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用对肌肉组织中蛋白表达的影响组的肌肉组织蛋白表达明显高于对照组和生理盐水组，生理盐水组的肌肉组织蛋白表达也高于比对照组。提示肌炎动物模型肌肉组织出现蛋白的表达，而更增强蛋白的表达。可能说明表达能够抑制病情的发展。（见图‘令…▲▲对丨生水治—治疗组组—图三组膝鼠肌肉组织蛋白的表达 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用对肌肉组织，，和表达的影响组肌肉组织的表达显著低于生理盐水组（，不过高于对照组，但不达到统计学差异（。而生理盐水组肌肉组织的表达显著高于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织的表达升高，而可以明显地抑制肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图组肌肉组织的表达高于对照组，但低于生理盐水组，不过均不达到统计学差异，；生理盐水组肌肉组织的表达与对照组无统计学差异。提示肌炎动物模型肌肉组织的与对照组间没有明显的表达差异。（见图组肌肉组织的表达显著低于生理盐水组（，但与对照组的表达没有显著性差别（。不过，生理盐水组肌肉组织的表达显著高于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织出现的明显表达而可以明显地抑制肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图组肌肉组织的表达显著低于生理盐水组（，但与对照组比较没有统计学差异（。不过，生理盐水组肌肉组织的表达显著高于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织出现的明显表达，而可以明显地抑制肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用「「—相相对对“⑦表表￠达棚达‘‘门’丨丨丨丨丨丨相想对对令‘表表达达‘‘‘‘图肌肉组织，，的表达（组：对照组；组：生理盐水组；组：组） 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用对肌肉组织、丨、和表达的影响组肌肉组织的表达显著高于生理盐水组（，而与对照组比较没有统计学差异（。不过，生理盐水组肌肉组织的表达显著低于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达明显降低，而可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织的表达。见图组肌肉组织的表达显著高于生理盐水组（而与对照组比较没有统计学差异（；生理盐水组肌肉组织的表达显著降低于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达明显降低，而可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织的表达。见图组肌肉组织的表达显著低于生理盐水组（，但与对照组比较没有统计学差异（。不过，与对照组比较，生理盐水组肌肉组织的表达显著增高（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达明显增高，而可以明显地抑制肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图组肌肉组织的表达显著高于生理盐水组（而与对照组比较没有统计学差异（。但，生理盐水组肌肉组织的表达显著降低于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达明显降低，而可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用—「相：门。「好对夹斧表‘达达‘―‘‘‘―‘‘「「相‘謹。。■」“‘‘‘‘达—」图肌肉组织、、、的表达（组：对照组；组：生理盐水组；组：组）对肌肉组织、的表达的影响组肌肉组织的表达显著高于生理盐水组（，也高于对照组，但达不到统计学差异（但生理盐水组肌肉组织的表达显著降低于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达明显降低，而可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织的表达。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用见图组肌肉组织的表达显著高于生理盐水组（，但与对照组比较没有统计学差异（而生理盐水组和对照组比较也没有统计学差异（。提示肌炎动物模型肌肉组织表达没有明显变化，但可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图…士相对对‘图肌肉组织、的表达（组：对照组；组：生理盐水组；组：组）对肌肉组织表达的影响组肌肉组织的表达显著低于生理盐水组（，但与对照组比较，无统计学差异（。不过，生理盐水组肌肉组织的表达显著高于对照组（。提示肌炎动物模型肌肉组织出现明显表达，而可以明显地抑制肌炎动物模型肌肉组织的表达。（见图 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用「相对表图肌肉组织的表达（组：对照组；组生理盐水组；组：组对血清丨、、、、含量的影响组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量高于生理盐水组，低于对照组，但是均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：。生理盐水组血清的表达显著低于对照组（。组血清的含量为，生理盐水组为对照组为。组的含量高于生理盐水组，低于对照组，但是各组间均没有达到统计学意义组生理盐水组组对照组生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，但是各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，但是各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，但是各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。上述结果提示肌炎动物模型，血清明显升高，但是干预对血清中影响较小。且各组间、、、差异不明显，的干预作用较小。（见图「；■；；丨。广‘‘图血清促炎因子、、、、的水平（组：对照组； 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用组：生理盐水组；组：组）对血清，含量的影响组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组，高于对照组，但是各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，且组与对照组间有统计学差异（组对照组：。组与生理盐水组，生理盐水组与对照组含量均没有达到统计学意义（组生理盐水组：；生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，且组与生理盐水组间有统计学差异（组生理盐水组：。组与对照组，生理盐水组与对照组含量均没有达到统计学意义组对照组：；生理盐水组对照组：。结果可能提示干预后，能够降低肌炎动物模型血清的含量。见图 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及潤亡因子的干预作用“门■‘“■‘‘「「“丄■「广“门“‘‘”‘图血清，水平（、、组：对照组；组：生理盐水组；组：组）对血清、、卜含量的影响组血清的含量为生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，生理盐水组含量低于对照组，但是各组间均没有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为对照组为。组的含量高于生理盐水组，低于对照组，但是各组间均没 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用有达到统计学意义（组生理盐水组：组对照组：；生理盐水组对照组：。组血清的含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量低于生理盐水组和对照组，组与对照组间不具有统计学差异组生理盐水组；组对照组：。生理盐水组含量低于对照组（生理盐水组对照组：见图■“—■“。■‘‘十‘““““‘图血清调亡相关细胞因子、、表达水平（，组：对照组；组：生理盐水组；组：组）对血清和含量影响及其相关性分析 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用组血清含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量高于生理盐水组，低于对照组，各组之间均没有达到统计学差异（组生理盐水组：组对照组：；生理盐水组对照组：。组血清含量为，生理盐水组为，对照组为。组的含量高于生理盐水组，低于对照组，各组之间均没有达到统计学差异（组生理盐水组：组对照组：生理盐水组对照组：。组、生理盐水组、对照组之间和的含量没有相关性（或上述结果说明的干预虽然提高了血清和的含量，但是没有达到统计学意义，且血清的升高和降低与血清含量没有明显关系。见图““。——‘—‘——‘‘“‘“‘“““‘图血清和水平（丨组：对照组；组：生理盐水组；组：组）肌肉组织与血清促炎因子、抑炎因子及调亡相关细胞因子的相关性分析 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用经统计学分析各因子的相关性，组血清中各种细胞因子的含量均没有显著相关性（或，而在肌肉组织、、两者之间均具有很好的相关性（；产且；：且；：且。肌肉组织其他之间没有相关性（或。肌肉组织、、和表达和血清的相应细胞因子含量之间没有显著的相关性（「或；同样，肌肉组织、、、表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性「或同样，肌肉组织和表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性（或。上述结果说明干预后，肌肉组织、、的表达之间可能相互影响，三种之间能够相互作用。生理盐水组血清各种细胞因子的含量均没有显著相关性（或，肌肉组织各种之间也没有相关性（或。肌肉组织、、和表达和血清的相应细胞因子含量之间没有显著的相关性或；同样，肌肉组织、、、表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性（或；同样，肌肉组织和表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性（「或。上述结果说明在肌炎动物模型，其肌肉组织和血清的促炎因子、抑炎因子和调亡相关因子之间没有明显关系，而干预后，能够对肌肉组织、、的表达产生作用，使这三种之间的表达存在相互作用。对照组血清各种细胞因子的含量均没有显著相关性（或，肌肉组织各种之间也没有相关性（「或。肌肉组织、、和表达和血清的相应细胞因子含量之间没有显著的相关性或；同样，肌肉组织、、、表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性（或；同样， 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用肌肉组织和表达和血清的相应细胞因子含量之间也没有显著的相关性（或。上述结果说明在对照组动物，即正常非炎性条件下，其肌肉组织和血清的促炎因子、抑炎因子和调亡相关因子之间没有明显关系。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用第四节讨论目前发现，很多自身免疫性疾病与水平的降低有关，包括炎性肠病，炎性肌病，系统性红斑狼搭等，当血清中水平低于正常人群，则发病率提高，但是降低水平的差别与疾病的严重程度并没有相关性。血清中水平的降低在肌炎中的作用目前还不明确，也没有外源性补充后对肌炎病程的影响和对肌肉组织上表达变化的研究。在本研究中，膝鼠血清的水平显示出我们虽然外源性的补充了，但是仍旧没有达到正常水平，可能与我们选择每次注射的药量偏少或者治疗时间较短有关，同时的水平与血清中的变化趋势相同，但不具有相关性，表明外源性补充能够与血清中的表达并不具有明显的关系，而对于肌肉组织中，干预前，生理盐水组的蛋白表达只稍高于对照组，而干预后，所有膝鼠的肌肉组织内表达的蛋白水平上升，与对照组和生理盐水组形成鲜明对比，也证实了正常肌肉组织在没有炎症的情况下，表达极少，而出现肌肉炎症后，的表达会有所上升，而通过干预后，蛋白表达明显。那么，可能提示能够有抑制炎症的作用，经过千预后表达的升高，是因为通过提高了的表达来发挥的免疫调节的作用。细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞经活化后，合成和分泌的参与免疫应答，调节细胞生理功能，介导炎症反应的小分子多肽或糖蛋白。根据细胞因子在炎症中的作用，可以分为，促进炎症性因子和抗炎症性因子。其中本研究中、、、均属于促炎性因子。是一种由活化的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的有调节细胞生理功能，参与免疫应答的促炎症性细胞因子，主要由单核巨唾细胞，细胞和血管内皮细胞产生。目前也有报道称，再生的肌肉组织也会有的表达。可增强成肌细胞的增殖作用的分泌也与巨暖细胞分泌的有关，当和水平升高时，可以促使转录水平的升高。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用参与体内抗体的产生，能够促进疾病急性期蛋白的释放，对于肌炎模型来说，是一个比较重要的促炎因子，利用肌球蛋白在基因敲除的小鼠造模，发现没有典型的临床和组织病理上肌纤维损伤，考虑可能作为一个促炎因素，它的缺失使肌炎进程阻断，从而减轻了肌肉的炎症。另外还参与肌肉的再生过程。成肌细胞增殖是肌纤维再生的一个重要阶段，需要很多细胞因子信号的参与。当肌肉组织出现应激甚至损伤时，骨豁肌就会促使生成分泌，它能够很强的促进成肌细胞的增殖，使肌纤维再生。所以，无论对于肌肉炎症的进程，还是肌肉再生的过程，都是一个比较重要的细胞因子。本研究中，生理盐水组的肌肉组织的显著升高，说明作为促炎因子，在肌肉炎症中起到了一定的作用，另外，肌肉出现损伤后，血清中的并没有明显差异，而肌肉中生理盐水组与对照组有明显差异，说明肌肉中的主要靠肌肉组织分泌，而不是血清中来源。干预后，分泌减少，可能会减少对于肌肉的炎性损伤，说明能够减少肌肉组织中的含量。属于调节炎症的介质，在很多疾病的发生发展和预后中都有参与。它能促使血管的生成，趋化中性粒细胞，促进炎症反应。能够活化中性粒细胞并趋化其由外周血向组织内转移，同时，还能够对单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞产生作用，只是这种作用与对中性粒细胞的作用相比相对弱。在肿瘤组织中，与相同，具有促进血管生成和肿瘤转移的作用。体外培养人的成肌细胞，可以组成性表达，同时能够被和刺激后表达升高。可是本研究中，各组间的表达无论在肌肉组织中，还是在血清中并没有明显差异，考虑在我们肌炎模型中可能并不是主要因素。具有广谱的抗病毒功能，能够抵抗病毒对机体的感染。另外它还具有免疫调节功能，能够促进向分化，而抑制的生成。还能增强细胞的杀伤功能，活化巨睡细胞使其表达和蛋白。是一种有效的促进蛋白表达的细胞因子，主要由分泌。在特发 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用性肌炎患者的肌肉组织中，当炎性细胞浸润较明显的部位，促进了肌纤维上蛋白的表达，然后毒性淋巴细胞识别蛋白，损伤肌纤维。所以，当肌肉组织中出现表达量升高时，我们认为肌肉组织损伤会更严重。也是比较常见的一种促炎因子，能够调节机体的炎症和免疫反应，适量的能调节免疫系统，抵御病原菌的侵袭，肌肉损伤后肌肉功能恢复保护机体，过度的合成则可危害机体，造成肌肉组织损伤等。还可刺激人的骨豁肌释放。主要由单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞分泌它可以活化并趋化炎性细胞，放大其他细胞因子的促炎作用。而肌炎模型中，在炎性细胞浸润部位，肌肉组织在和蛋白水平都能表达。当肌肉组织出现损伤时，就会升高。是一把双刃剑，它既在肌损伤后的肌肉功能恢复过程中起到作用，又可以使肌组织进行性减少。至于是保护还是损伤，主要取决于肌肉损伤的类型，损伤程度，和损伤的阶段。本研究中，生理盐水组的和的表达量，与对照组和组相比明显升高，并且组间均有统计学差异，说明肌炎模型炎症反应、肌肉损伤比较严重，同时的干预可以降低这两种炎性因子的表达，使和的表达几乎降到正常水平，而血清中，除对照组和生理盐水组间的表达量有统计学差异，其余各组均没有差异，而对照组和生理盐水组的均值差别不是很大，不如肌肉组织中的差异明显，再加上肌肉促炎因子和血清促炎因子的表达量并不相关，考虑肌肉组织中的促进炎症反应与血清中细胞因子关系不大。另外，和的升高也会促进其他炎性因子的表达，所以的干预既降低了和本身的表达，又减少了其他炎性因子的表达。干预后，肌肉组织、和的较好相关性也提示，干预后，三者相互影响相互作用，共同降低从而减轻炎症反应。、都属于抑制炎症性因子，主要由细胞分泌可以抑制细胞的增殖，促进细胞的增殖，是单核巨嚼细胞分泌的炎性因子的减活剂，基因敲除的小鼠可以自发的形成慢性肠炎，类似人类炎 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用性肠病的表现，可见抑炎因子在体内起着重要的作用。是一种多功能蛋白，主要由活化的细胞、单核吞唆细胞等多种细胞合成分泌，它可以调节细胞生长和分化，在组织修复中也有重要的作用，同时，它还具有促发炎症，免疫调节和促进纤维化的特性。在肌肉组织中，它具有抗炎的作用，但是在过量的情况下，会引起肌内膜的纤维化。能够抑制活化巨睡细胞的的释放，能够在体外抑制对成肌细胞分泌的促进作用敲除的老鼠和的表达增加，从而加重免疫反应。在体外用刺激从基因敲除老鼠体内分离出来的成纤维细胞，发现分子表达减低。在患者中，的升高又与肌肉组织退化和结缔组织增生相关所以算是一个多功能蛋白。也是抑炎因子的一种，具有免疫调节作用，由多种免疫细胞分泌，细胞、细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、细胞、细胞都能分泌。与的功能相似，而且他们识别的抗体有部分相同，型只能与结合，型由和链组成，所以既能结合，也能结合。参与的免疫反应有很多，包括气道高反应性，过敏反应，组织重建，纤维化和肿瘤生长等，而在肌炎中的研究很少。在本研究中，肌肉组织中抑炎因子（、、的表达趋势相同，生理盐水组的表达量最低，且与对照组和组间有统计学差异，说明的干预对于肌炎模型，在抑炎因子、升高方面有一定的治疗作用，且治疗后抑炎因子的表达量高于对照组，但是组与对照组间没有统计学差异，可能干预后抑炎因子、的表达量只是升到正常水平。不过，相反的，的表达量则与和的趋势相反，生理盐水组最高，且与对照组和组间有统计学差异，可能与都具有抗炎作用，功能也有部分相似，但是在肌炎模型中，是否与的功能正好相反，在高水平的情况下，肌炎会较重，或者肌肉纤维化加重，而的作用就是通过降低的水平达到降低损伤和减少肌肉纤维化的作用，这点还需要未来进一步探讨与验证。血清 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用中，抑炎因子、各组间均没有统计学差异。而对照组和组间的表达量有统计学差异，对照组的表达量明显高于组。生理盐水组和组间的表达也有明显差异，为何肌肉组织中和血清中和的表达趋势不同呢？不过肯定的是经过干预后和的表达发生了明显改变。猜测在肌肉组织中可能起到加重肌炎的作用，而在血清中水平的降低促进炎症的发生，而在肌肉组织中表达增多，会减少和蛋白表达，减轻免疫反应，在血清中表达增多时，有一定的促进组织结缔组织增生的作用，所以在不同组织会呈现不同的结果，但是这种现象也还需进一步的探讨。、、都属于家族的蛋白。属于抑制细胞调亡的蛋白，可以在不引起细胞增殖的情况下，抑制细胞的凋亡，可以抑制氧化剂诱导的细胞调亡，通过影响内流的方式而延长细胞生存周期。能够保护为信号的细胞介导的细胞溶解，但是对于来自穿孔素信号来源的细胞损伤无效。和均属于促进细胞调亡的蛋白，异二聚体和同二聚体（的比值决定了细胞凋亡的易感性，当蛋白过度表达，与结合成异二聚体则可抑制细胞的凋亡，当表达较多，同二聚体生成较多时，则可促进细胞的调亡。是、异二聚体的负调节基因。当的浓度较高时，它可以替换出、异二聚体中的，而促进细胞的凋亡。与的表达不具有疾病特异性，主要与疾病的严重程度有关，近期研究表明，和不仅在坏死肌纤维中表达，在再生肌纤维和有线粒体异常的肌纤维中均有表达，所以这两种蛋白的免疫反应可能不光局限在坏死肌纤维中。在本研究中，在肌肉组织中的表达，以组最高，生理盐水组最低，而的表达也呈现同样的趋势，但是只有生理盐水组和组间的表达有统计学差异，血清中除了对照组和组间的表达量有统计学差异外，其余各组间、和的表达均没有统计学差异， 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及凋亡因子的干预作用考虑血清中与调亡相关的细胞因子的表达可能并不能反映肌肉组织上调亡的真实情况，而可能和相同，并不是只表达于坏死肌纤维，可能与再生过程也有一定的相关性，的增加是否代表着再生现象很明显，从而从另一个方面证明了的干预作用还有待进一步的研究。细胞能够释放穿孔素和颗粒酶，从而损伤细胞，肌肉组织中越高，可能说明肌肉组织中毒性细胞的数量越多。本研究中，肌肉组织中的表达以生理盐水组最高，而且与对照组和组间具有统计学差异，说明我们的肌炎模型中，有大量的细胞浸润，而的治疗可以减少这种细胞的浸润，干预后，基本降至正常水平，从而减少细胞对肌细胞的损伤。综上，能够提高肌肉组织的表达，从而抑制了肌肉组织的炎症反应，，通过减少促炎因子和升高抑炎因子的表达来抑制炎症的发展。在肌炎模型未被干预的条件下，蛋白升高代表了肌肉组织的炎症反应被机体抑制，而在干预后，可能通过提高肌肉中的表达来发挥抑制炎症的作用。从肌肉组织和血清中各项指标分析，我们可以发现，干预后肌肉中各种炎症相关和凋亡相关的因子的表达的确有了很大的变化，而血清中各组差异并不明显，说明的干预作用可能更针对于肌肉组织。我们的肌炎模型特点和人类的肌炎特点也是炎症比较局限于肌肉，而血清中的炎性改变并不明显。作为临床上一种比较廉价又副作用偏小的药物，由于近年被发现具有免疫调节的作用而开始被重视，但是在肌炎的作用还未有过报道，希望通过本研究，能为临床上的治疗提供一定的指导，并且本研究中未明确的一些问题也有待进一步的探讨与研究。 第三章维生素对免疫性肌炎动物模型肌肉组织和血清、促炎因子、抑炎因子及调亡因子的干预作用第五节小结、肌炎动物模型肌肉组织出现蛋白的表达，而更增强蛋白的表达。说明可能通过提高表达以减轻病情的发展。、能够降低肌肉组织中炎症性因子（、和的表达和升高肌肉组织中的抑炎因子（、和的表达，从而减轻肌肉组织中的炎症反应。、肌炎动物模型肌肉组织和的表达明显降低，而可以明显地提高肌炎动物模型肌肉组织和的表达。、除了能降低肌炎动物模型血清的含量外，对血清、、、、、、、、和含量的变化没有明显的影响。 ^结论、采用兔肌球蛋白、完全弗氏佐剂和百日咳毒素联合免疫藤鼠，可以模拟为较理想的实验性免疫性肌炎动物模型。、与、和参与人类炎性肌病的发病过程，但相互不存在依赖性。、可能通过提髙的表达，降低炎症性因子和升高抑炎因子，达到防治炎性肌病的作用。 参考文献参考文献】袁国强，吴以岭，王旭丹，周勇实验性自身免疫性肌炎动物模型制作的研究中医药实验研究，【徐宝林，江新梅，杨蕴天膝鼠实验变应性肌炎的药物干预治疗及肌肉病理研究中风与神经疾病杂志】；段讽实验性自身免疫性肌炎动物模型的制作■重庆医学赵红东，陈祖舜，沈鸣九实验性肌炎动物模型制作的研究临床神经病学杂志，】 参考文献； 参考文献；】 参考文献丨丨 参考文献 参考文献；丨刘陶文调亡调控基因家族研究的新进展生物化学与生物物理进展 M致谢三年如一曰，在本论文完成之际，由衷感谢我的导师蒲传强教授三年以来对我的关怀、照顾以及帮助。三年来，蒲教授在学术方面，从课题的选题、实验设计、数据分析以及论文撰写等各个方面都给予了我非常多的帮助。蒲教授在学术方面知识渊博、思维敏捷、见解独特，这些都让我在科研道路上受益匪浅。蒲教授在生活方面、学习方面以及为人处事也给予了我非常多的帮助和指导，在生活方面，蒲教授能体谅学生，尽自己最大的努力去帮助我们。在学习方面，蒲教授给了我很多学习和交流的机会，在这种机会中不断充实和提高自己。在为人处事方面，蒲教授胸怀宽广、为人谦和、平等民主，这些都让我从蒲教授身上学习了非常多，让我非常敬佩。‘‘师恩重如山”，在我即将完成博士学业之际，由衷的向我的人生导师蒲传强教授致以崇高敬意和衷心的感谢。感谢神经内科和神经肌肉研究室的刘洁晓老师和毛燕玲老师，感谢师妹陈婷、金朝、钱芸、许静和班端等，还有师弟尹西，在这三年里，大家和睦相处、互帮互助，给了我一个非常温馨和和谐的大家庭，感谢神经内科和神经肌肉研究室的每一位。感谢张纪岩老师和王庆阳老师对于科研工作以及平时生活中所给予的帮助、指导和鼓舞，感谢军事医学科学院免疫学研究组的师姐师弟师妹对我的帮助和实验上的指导。感谢我的母亲对我的关心、支持和鼓励，在这三年里，感谢母亲对我一如既往的支持和鼓励，才能让我在求学这条道路上钻研下去，自己只能愈加努力去报答母亲的恩情。谢谢大家。汪静洋二零一四年五月十曰于解放军总医院神经内科 附录维生素对免疫细胞的影响及其在多发性肌炎中的作用维生素是维持人体生命活动必需的营养成分，与体内的憐代谢相关，维生素不仅是一种维生素，也是一种激素前体。主要的天然维生素包括两种，即维生素胆骨化醇，和维生素队，（麦角骨化醇，。食物中的维生素队在肠道被吸收后和皮肤中的脱氧胆固醇在紫外线照射下生成的维生素进入血液，在肝、肾中经两次经化，生成，二轻维生素，即。在体内，血液中循环的维生素的主要形式是，在生理浓度下，没有活性，不能发挥信号分子传递信号的作用。必须在的作用下，转变成，后通过来进行信号传导。年前，肿瘤细胞表面首次被发现存在，二经基维生素受体，人类对于维生素的传统观念也发生了重大的改变。的生物学效应是通过，的受体介导的现已证明不仅存在于经典的紀组织小肠、骨、肾脏、甲状旁腺，还存在于视网膜、胰腺、垂体、肌肉、睾丸、乳腺、子宫、胎盘、卵巢、脾、骨骼、皮肤等许多组织中。人的单核细胞、激活的细胞、细胞也有。维生素在许多常见的癌症、高血压和心血管疾病的干预和治疗及在大脑发育过程中都有一定的作用。近年的研究显示，，还具有广泛的免疫调节作用，与固有免疫和获得性免疫都有密切的联系。，维生素的免疫调节作用维生素在固有免疫反应中的作用维生素与巨嚼细胞巨唆细胞和树突状细胞都受到，的调节。与自然杀伤细胞（细胞）和细胞毒性细胞一样，巨睡细胞和单核前体细胞在对病原体和组织损伤 1?的非特异免疫反应中都起到了重要作用，这些细胞通过吞唆作用来消除和吸收病原体和细胞碎片。另外，巨嗟细胞还可以将加工处理的病原体传递给辅助淋巴细胞来参与获得性免疫反应。促进单核前体细胞向成熟的巨唾细胞分化并使巨趣细胞产生有免疫抑制作用的前列腺素下调粒细胞巨暖细胞集落刺激因子的表达，减少巨唾细胞分泌细胞因子和趋化因子。队增强干扰素合成，干扰素又剌激巨嚼细胞产生羥化酶，生成，扣，结核杆菌的主要抗原识别受体一样受体活化后，和轻化酶的基因一的表达增强，—结合后抗菌肽的表达量增加，体内研究显示外源性的补充维生素可以使抗菌肽的表达增多，从而增强了巨睡细胞的抗菌作用。与维生素增加抗菌肽的表达相关但是这种增强作用的机制与轻化酶的转录调节和的敏感性增加无关。维生素同时减少巨睡细胞内吞睡的结核杆筒的增殖，并在的存在下加强。在多发性硬化易感人群中，日晒和外源性补充维生素会对该类人群起到一定的保护作用，但是缺乏会降低这种保护作用考虑可能因为维生素减轻巨睡细胞介导的炎症反应和细胞增殖的作用都必须在的共同存在下，才能发挥效应。维生素与树突状细胞（固有免疫中，巨嚼细胞不仅具有吞暖和消化病原体和细胞碎片的作用，同时还有抗原呈递作用来启动获得性免疫反应。但目前人体中主要起抗原呈递作用的细胞是树突状细胞，是一种专职的抗原呈递细胞。维生素及其类似物可以抑制单核细胞分化来源的成熟，还能降低其抗原呈递作用。一项胰岛细胞移植研究中，发现用维生素治疗的小鼠，其发生免疫排斥反应的机率降低，考虑可能与维生素减少的成熟，同时增强了的表达有关。当分化成熟，其表达经化酶也随之增加，外源性的补充维生素可以抑制成熟和细胞增殖，与巨睡细胞相同，维生素是通过与细胞的受体来发挥作用。成 熟的与非成熟及其他单核细胞相比，表达的水平明显降低，可能过高的表达不利于成熟的抗原呈递作用，成熟的对，不敏感。高浓度的，可以作用于表达的不成熟，并抑制其进一步的分化成熟。能够影响与细胞之间的相互作用，减少炎症前因子和细胞膜上类分子，和的表达，使和产生减少，和表达增多。，，的下调减弱了抗原呈递作用，减少了细胞活化而的表达增加。维生素在获得性免疫反应中的作用维生素与细胞早期研究显示维生素的受体在细胞和细胞都有表达，且只在有免疫活性并且增殖的细胞表达，表明，可能起到了抗细胞增殖的作用。同时，，在体外能够影响细胞细胞因子的分泌，包括抑制促进的分泌，，，与细胞免疫相关，与体液免疫相关，考虑，能够促进效应细胞向分化，从而减轻由介导的细胞免疫引起的组织损伤。，减少分泌的的数量通过上调和的转录来诱导的表达，维生素还能抑制细胞介导的免疫反应。近年研究显示是另一类效应细胞，与与不同，以能合成而得名。与特定的病原体免疫反应相关，同时它也参与免疫损伤和炎症反应。在自身免疫相关的非糖尿病鼠模型中，外源性补充维生素可以减少的表达，同时敲除基因后，血中会升高，还可能通过抑制和的分泌直接减少的表达。也属于细胞的一种，是一种调节性细胞。年’证明维生素和激素协同作用，可以诱导能分泌的产生。在单独存在下也可以诱导的产生。单用激素治疗过敏时， 1?虽然能够抑制免疫反应，但同时会降低体内的数量，若同时连用维生素治疗，可以逆转激素的不良作用，使维持在一个相对较高的水平。对肾病患者进行外源性补充维生素后，发现血中循环的的数量明显上升。和都是由细胞分化而来，两者的数量具有相关性，一些自身免疫疾病中，会出现的升高，同时伴有的下降，数量的不平衡参与了疾病的发展。维生素与细胞细胞表达和，说明细胞可以对维生素产生反应，对细胞的增殖、分化为装细胞和免疫球蛋白的产生起到了抑制的作用。很多研究显示许多自身免疫疾病患者血中维生素的水平与正常健康人相比都是下降的，外源性补充维生素能够避免自身免疫疾病的复发和疾病的严重程摩。维生素和多发性肌炎多发性肌炎（是一种慢性的弥漫性的非化脓性炎性骨豁肌疾病已明确其在病毒感染和遗传因素的背景下引起免疫介导而发病。本病临床上表现为对称的进行性的近端肌肉无力、肌肉压痛和血清酶升高；组织学上以显示肌纤维变性、坏死、吞嚼现象及较多的淋巴细胞浸润。许多研究发现肌肉组织中浸润的炎性细胞主要有细胞、巨唾细胞、树突状细胞和细胞；左右的患者可以在血中检测到多种自身抗体。国外的研究专注于维生素对组织中、、、细胞表达的影响，研究的相关疾病集中在炎性肠病、系统性红斑狼掩、多发性硬化等，而维生素对多发性肌炎的作用相关研究甚少。不过，近期发表的一篇关于特发性肌炎患者血清中维生素水平的研究，发现特发性肌炎的患者与正常健康对照组相比，血中维生素的水平是下降的，且具有统计学意义，表明维生素的水平变化与特发性肌炎的三种类型发病都有密切关系。小结 1?维生素是人体必不可少的营养物质，同时兼具免疫调节的功能，与固有免疫和获得性免疫都具有广泛的联系，可能通过影响各种免疫细胞的表达和功能来发挥作用。外源性的补充维生素能够治疗和预防自身免疫疾病的作用。目前维生素与多发性肌炎的研究甚少，但是随着这方面研究机制的深入研究和不断阐明，维生素对多发性肌炎的治疗具有更广阔的应用前景。，，，，，，，，，，，，，，’，，，， ^14.Penna,G.andL.Adorini，，，，，，，，，，，，，，，，， ^mycophenolatemofetiltreatmentmediatetransplantationtolerance.JImmunol,2001.167(4):p.1945-53.30.Majak,P.,B.RychlikandI.Stelmach,TheeffectoforalsteroidswithandwithoutvitaminD3onearlyefficacyofimmunotherapyinasthmaticchildren.ClinExpAllergy,2009.39(12):p.1830-41.31.Ardalan,M.R.，，，，，，，，， mm附录； ?Abstract:Background:VitaminDreceptor(VDR),Thl7relatedCCchemokinereceptor6(CCR6),TregrelatedFoxp3andCD8+TrelatedgranzymeB(GrB)contributedtothedevelopmentofmanyautoimmunediseases.However,therearenoavailabledataaddressingtheexpressionofthesemRNAoftheseproteinsinthemusclesinidiopathicinflammatorymyopathy(IIM)andlimb-girdlemusculardystrophytype2B(LGMD2B).Methods:Wehaveevaluatedthelevelsof4mRNAsincludingVDR,CCR6,Foxp3,GrBinthemuscleandmusclerelatedenzymesinthebloodof14patientswithidiopathicinflammatorymyopathy,4patientswithLGMD2Band7controlswhodidnothavehistopathologicalsignsofanymusclediseases.Results:TheexpressionsofallmeasuredmRNAsandmusclerelatedenzymeswerehighestinIIM.ThemRNAlevelsinLGMD2Bwerealsohigherthanthoseinthecontrols.AsignificantdifferenceofVDRmRNAexpressionwasobservedbetweenIIMandLGMD2B.Conclusions:Thl7,Treg； ?andinclusionbodymyositis(IBM)⑴；口 ^correlationswithbiochemicalmarkersMaterialsandMethods:Patientsandsamples:Atotalof25patients(Table1)undergoingmusclebiopsyforclinicalcoursesandmusclehistopathologyattheChinesePLAGeneralHospitalbetweenFeb.9*^2012andDec.5^^2012wereprocuredretrospectively.Venousbloodwasdrawntomeasurethelevelsofcreatininekinase(CK),lactatedehydrogenase(LDH),glutamicoxaloaceticacidtransaminase(GOT)andglutamicpyruvicacidtransaminase(GPT).Thepatientsweresubdividedinto3groupsaccordingtoimmunohistochemicalstaininganddiagnosticcriteria^^?'??^:Thefirstgroupwascomposedof14patientswhohadidiopathicinflammatorymyopathy(MM;12whohadpolymyositis(PM)and2whohadsporadicinclusionbodymyositis(sIBM)).Musclesamplesfrom7healthycontrolswhoonlyhadmuscleweaknessanddidnothaveanyobviousclinicalandhistopathologicalsignsofanymusclediseasewereincludedascontrols,and4specimensderivedfrompatientswhohadLGMD2Bservedasadditionalcontrols.Subjectsshowingnormalmuscletissuewereexcludedfromthecontrolgroupiftheyhadcharacteristicclinicalfeaturesofmyopathy.Biopsieswereonlyexecutedwithpatients'approval,andallpatientssignedInformedConsentauthorizingtheuseofmuscletissueandbloodandthestudyprotocolhadbeenapprovedbytheinstitute'scommitteeonhumanresearch.Manualmusclestrengthtesting(MMT)MuscleswereevaluatedusingmanualmusclestrengthtestingusingtheMedicalResearchCouncil(MRC)Scale,andmusclestrengthisgradedonascalefrom0to5.Pre-treatmentofmuscletissue:Muscletissuefromthequadricepsfemorisfrom12patients,bicepsbrachiifrom8patients,gastrocnemiusfrom4patientsanddeltoidmusclefrom1patient(one85 ^patientunderwentbiopsyfromonlyonemuscle.)wereobtainedatthetimeofsurgery,immediatelyfrozeninliquidnitrogen,andstoredat-80°，； Masindicatedinfigurelegends,usingGraphPadPrism5.0software.Results:Clinicalfeatures:Table2presentsthebackgroundsofthesesubjects.Inourstudy,thepatientswithLGMD2Bpresentedbetweentheageof9and30yearswhichmadethesepatientssignificantlyyoungerthanthoseintheIIMgroup(P=0.019forcomparisonofIIMvsLGMD2B).Thepatientsinvolvedinourstudyhadsignificantdifferencesingender(P=0.002)betweenIIMandLGMD2B.Inflammatorymyopathiesarefemale-pronediseaseswhilepatientswhohaveLGMD2Bareallmale.However,noeffectofageorgenderwasobservedonmusclemRNAexpressionortheenzymesintheblood.Basedongenderanddiseases,therewasnotendencyformyalgiainanyofthepatients.PatientswithIIMhadthehighestprevalenceofmuscleweaknessinproximalsitesoftheupperlimbs(P<0.05forcomparisonsofIIMvs.Control)whileoursamplesdemonstratedfewdifferencesofmusclestrengthinlowerlimbsanddistalupperlimbs.QuantitativeanalysisofVDR^CCR6,GRBandF0XP3expressionWemeasuredtheexpressionofVDR,CCR6,Foxp3andGRBinmuscletissue.AsshowninFig1,theIIMgrouphadsignificantlyhighermRNAlevelsforall4markerscomparedtocontrols,whiletheLGMD2Bgroupwasthesecondhighest.BetweentheIIMandLGMDgroup,themRNAlevelsofVDRwerehigherinIIMgroup(P<0.05),butthedifferenceswerelesssignificantfortheother3markers.Comparedwithcontrols,patientswithLGMDhadhighermRNAexpressionlevelsofthe4markers,butasignificantdifferencewasonlyobservedinVDRandGRBlevels.LaboratorydataofpatientsWecomparedthelaboratorydatafromeachgroup.ThemedianCKinpatientswithIIMwas4126.30U/L； 1?4207.6and314.75U/Urespectively(Table2).InIIMandLGMD2B,theCKconcentrationwassignificantlyelevatedcomparedtocontrols{P=0.012forIIMvs.ControlsandP=0.019forLGMD2Bvs.Controls,respectively).However,therewasnosignificantdifferencebetweenpatientswithIIMandLGMD2B.LDHlevelsweresignificantlyhigherintheIIMgroupthanintheothergroups;theLDHlevelsoftheIIMgroupwerefivetimeshigherthanthoseofthecontrolgroup{P=0.04).TheGOTlevelswerethehighestinIIMbutwereonlysignificantlydifferentfromthoseofthecontrolgroup(P=0.03).PatientswhohaveIIMandLGMD2BmaintainedalmostthesamelevelofGPT,andtherewasnotanysignificantdifferencebetweenthe3groups,whichmayindicateGPTwasnotasensitiveindexforIIMandLGMD2B(Figure2).RelationshipbetweenlaboratorydataandmRNAexpressionPearsonrankanalysisrevealedsignificantcorrelationsbetweenGRB,CCR6andFoxp3(r=0.711,PcO.OOl,r=0.934,P<0.001,r=0.827,P<0.001,respectively)(fig_3A-C),whileVDRwasnotsignificantlycorrelatedwiththese3mRNAlevels(VDRvs.CCR6:r=0.183,P=0.402;VDRvs.GRB:「「 mtheidentificationofmyopathy(Table3).Discussion:Inthepresentstudy,VDRmRNAexpressionwashighestinIIM,andexpressionofVDRmRNAwasalsoincreasedinLGMD2Bpatientscomparedtocontrols；判 1?IntracellularexpressionofForkheadboxP3(Foxp3)isconsideredtobethemostspecificmarkerforTregcells[i8].Jregcellshavebeenidentifiedashavinganti-inflammatoryandimmunomodulatoryeffects^^^lCCR6isatypeofThl7-specificmarker[i°°刘，【皿々三】 ^CD8+Tcellsareinvolvedinthepathogenesisofthesetwodiseases.PMandIBMaredefiniteautoimmunediseasescausedmainlybyCD8+Tcellsinfiltrates【】，叫 ^1.AfzaliB,LombardiG,LechierRi,LordGM.TheroleofThelper17(Thl7)andregulatoryTceils(Treg)inhumanorgantransplantationandautoimmunedisease.ClinExpImmunol.2007;148:32-46.2.AnnunziatoF,CosmiL,SantariasciV,MaggiL,LiottaF,MazzinghiB,etal.PhenotypicandfunctionalfeaturesofhumanThl7cells.JournalofExperimentalMedicine.2007;204:1849-61.3.AzaliP,BarbassoHelmersS,KockumI,OlssonT,AlfredssonL,CharlesPJ,etal.LowserumlevelsofvitaminDinidiopathicinflammatorymyopathies.AnnRheumDis.2013;72:512-6.4.BischoffHA,BorchersM,GudatF,DuermuellerU,TheilerR,StahelinHB,etal.Insitudetectionof1,25-dihydroxyvitaminD3receptorinhumanskeletalmuscletissue.HistochemJ.2001;33:19-24.5.BohanA,PeterJB.Polymyositisanddermatomyositis.NEnglJMed.1975;292:344-7.6.BosseY'MaghniK,HudsonTJ.lalpha,25-dihydroxy-vitaminD3stimulationofbronchialsmoothmusclecellsinducesautocrine,contractility,andremodelingprocesses.PhysiolGenomics.2007;29:161-8.7.BushbyK.Diagnosisandmanagementofthelimbgirdlemusculardystrophies.PractNeurol.2009;9:314-23.8.CegliaL.VitaminDandskeletalmuscletissueandfunction.MolAspectsMed.2008;29:407-14.9.ChangJH,ChaHR,LeeDS,SeoKY,KweonMN.1,25-DihydroxyvitaminD3inhibitsthedifferentiationandmigrationofT(H)17cellstoprotectagainstexperimentalautoimmuneencephalomyelitis.PLoSOne.2010;5;el2925.10.ChenZ,LinF,GaoY,LiZ,ZhangJ,XingY,etal.F0XP3andRORgammat:transcriptionalregulationofTregandThl7.IntImmunopharmacol.2011;11:536-42.11.ChuS,ZhongX,ZhangJ,LaoQ,HeZ,BaiJ.TheexpressionofFoxp3andRORgammatinlungtissuesfromnormalsmokersandchronicobstructivepulmonarydiseasepatients.IntImmunopharmacol.2011;11:1780-8.12.DalakasMC.Sporadicinclusionbodymyositis-diagnosis,pathogenesisandtherapeuticstrategies.NatClinPractNeurol.2006;2:437-47.13.HewisonM.VitaminDandtheimmunesystem:newperspectivesonanoldtheme.EndocrinolMetabClinNorthAm.2010;39:365-79,tableofcontents.14.LeonAJ,GomezE,GarroteJA,BernardoD,BarreraA；儿，； 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^referencegene)丨门土 Table1PCRprimersusedforreal-timePCRGenesOligonucleotidesVDRF5'-CTGACCCTGGAGACTTTGA-3'R5'-TTCCTCTGCACTTCCTCAC-3'GAPDHF5'-AGCCCACATCGCTCAGACA-3'R5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'CCR6F5'-CTCTCCCATTCTGGGCAGT-3'R5'-ACGTGGCATTGCTGAAAAC-3'GranzymeBF5'-AAGACGACTTCGTGCTGACA-3'R5'-CCCCAAGGTGACATTTATGG-3'Foxp3F5'-CTGCCCCTAGTCATGGTGG-3'R5'-CTGGAGGAGTGCCTGTAAGTG-3'95 ?Table2Demographicandclinicalfeaturesin25patientsVariableIIMLGMD2BControlPvalueAgeatonset37.93(14-59)16(9-30)28.14(11-51)0.033median(range)ySexM/FNo.0.002Clinicalfeature:%Myalgia502557.10.740Muscleweakness(average)Upperlimbsproximal3.614.254.790.016distal4.254.004.930.114Lowerlimbsproximal3.613.754.570.083distal4.294.004.710.406Laboratoryfindings,mean(SEM)CK(U/L)4126.30(792.49)4207.60(1051.10)314.75(194.12)0.024LDH(U/L)871.99(139.33)457.88(98.79)171.38(19.98)0.004GPT(U/L)176.42(29.47)154.57(51.99)68.40(30.97)0.146GOT(U/L)250.03(83.49)86.13(18.49)38.97(9.98)0.041Table3ROCcurveanalysisoftheaccuracyofbiomarkersforidentificationofidiopathicinflammatorymyopathy(IIM).BiomarkerCut-offvalue(U/L)Sensitivity,%Specificity,%AUCPCK1607.2071.499.90.8570.013LDH252.9585.799.90.9290.003GOT107.3071.499.90.7980.039GPT77.150.7500.08396 1?Figure1ABVDR^CCR6S—■‘‘‘響丁，§。■幽否華舊、‘■丁■‘§‘‘—丁。‘醒，妾甲、、。令。。。。議。義丁一——、分、少旁令、‘。、。。。。 Figure3ABMr=0.711P<0.001r=0.934P<0.0018,0.10^6.0⑴■。■■。…、‘ 1?附录、 1?AbstractIsoproterenol,asyntheticnon-selectivep-adrenergicagonist,isoftenusedduringtheimmediatepostoperativeperiodafteropenheartsurgeryforitschronotropicandvasodilatoryeffects.IthasbeendemonstratedthatisoproterenolpretreatmentfollowedbyimmediateLPSadministrationleadstoreducedTNF-aresponseinvivo.However,sepsisneverhappensimmediatelyafterthesurgery,butrathersevereimmunedysfunctionoccursatleast24hourslater.Itremainselusivewhateffectsisoproterenolmightexerttoinnateimmunityduringtheperiod.Inthisscenario,weinvestigatedtheeffectsof24hour-isoproterenolpretreatmentonsepticshockinducedbyexperimentalendotoxemiaandbacterialperitonitis,withcholeratoxinasanothercyclicadenosinemonophosphate(cAMP)elevator.Unexpectedly,wefoundisoproterenolandcholeratoxinexhibiteddistincteffectsinacutelethalsystemicinflammatoryresponse.IsoproterenolworsenedliverinjurywithoutenhancingNK/NKTactivity.Meanwhile,choleratoxinbutnotisoproterenolshoweddramaticallyreducedTNF-aresponseinLPSinducedsepticshock.OurdataprovideacautionfortheclinicaluseofisoproterenolandsuggestthatisoproterenolhascAMP-independentfunctions.KEYWORDS:isoproterenol;TNF-a;inflammatoryresponse;liverinjuryIntroductionIsoproterenol,asyntheticnon-selectivep-adrenergicagonist,isoftenusedduringtheimmediatepostoperativeperiodafteropenheartsurgeryforitschronotropicandvasodilatoryeffects[1],IsoproterenolelicitsItspharmacologicalactionsbystimulationoftheG-protein(Gs)-coupledmembranereceptors,whichleadstotheactivationoftheintracellularadenylatecyclase-cyclicadenosinemonophosphate(cAMP)system[1].cAMPelevatorssuchascholeratoxin,which100 ^causesconstitutiveactivationofGsbystimulatingADP-ribosylationofitsa-subunit,aswellasisoproterenolsuppressproinflammatorycytokineproductionfrommonocyticcellsinresponsetoLPSchallengeinvitro[2-5].Furthermore,isoproterenolpretreatment(30min)followedbyimmediateLPSadministrationleadstoreducedTNF-aresponseinvivo[5】；；； theperiod.Inthisscenario,weinvestigatedtheeffectsof24hour-isoproterenolpretreatmentonsepticshockinducedbyexperimentalendotoxemiaandbacterialperitonitis,withcholeratoxinasanothercAMPelevator.Unexpectedly,wefoundisoproterenolandcholeratoxinexhibiteddistincteffectsinacutelethalsystemicinflammatoryresponse.IsoproterenolworsenedliverinjurywithoutenhancingNK/NKTactivity.Ourdataprovideacautionfortheclinicaluseofisoproterenol.ResultsIsoproterenolandcholeratoxinexertdistinctefectsonsepticshockundertheconditionof24hour-pretreatment.Toexaminetheroleof24hourpretreatmentwithcAMPelevationagentsinthesystemicinflammatoryresponseinvivo,weusedtwowell-examinedclinicallyrelevantmurinemodelsofsepticshock:experimentalendotoxemiaandbacterialperitonitis.Asingleintraperitonealinjectionofcholeratoxin24hoursbeforetheinjetionofheat-killedEscherichiacolipotentlypreventedmicefrombacterialperitonitis-inducedlethality(Fig.lA).However,24hour-isoproterenolpretreatmentrenderedmicediefasterunderthesameconditions(Fig.lA).Similarly,24hour-isoproterenolpretreatmentshowednoprotectionagainstLPS-inducedlethalitywhereas24hour-choleratoxinpretreatmentshowedsignificantprotection{Fig.IB).Thesedatasuggestthatisoproterenolandcholeratoxinexertdistincteffectsonsepticshockundertheconditionof24hour-pretreatment.Isoproterenolandcholeratoxinexertdistincteffectsonliverinjuryinsepticmiceundertheconditionof24hour-pretreatmentLiverdysfunctionandfailurecontributetothehighmortalityrateofsepsis[16].ThehepatocyteinjurywasevaluatedbymeasuringtheserumlevelsofAST/ALT.LPS102 ^injectionledtotheelevationofserumAST/ALTat20hoursafterchallenge(Fig.2A,B).ELISArevealedthatisoproterenolenhanced,whereascholeratoxinsuppressed,LPS-inducedelevationofserumAST/ALTundertheconditionof24hour-pretreatment(Fig.2A,B).Thesedatasuggestthatisoproterenolandcholeratoxinexertdistincteffectsonliverinjuryinsepticmiceundertheconditionof24hour-pretreatment.BothisoproterenolandcholeratoxininhibitNK/NKTactivityinsepticmiceundertheconditionof24hour-pretreatmentThesensitivityofhepatocytestocytotoxicitydependsonIFN-ylevelsandNK/NKTcellsarethemajorsourceofIFN-yduringsepsis[11-13].Inthisscenario,wecheckedcirculatingIFN-ylevelsinsepticmicewithELISA.BothisoproterenolandcholeratoxinsuppressedLPS-inducedelevationofserumIFN-yundertheconditionof24hour-pretreatment(Rg.3A).Thesedataareconsistentwiththeobservationsofothergroups[17,18]andfurthersupportaninhibitoryroleofcAMPontheoverallNK/NKTactivity.ToelucidatewhetheralocalaccumulationofNK/NKTcellsinthelivercontributestotheexacerbationofLPS-inducedhepatocyteinjuryby24hour-isoproterenolpretreatment,weevaluatedlivermononuclearsubsetswithflowcytometricanalysis.Neitherisoproterenolnorcholeratoxinpretreatmentfor24hoursledtoincreasedpercentagesornumbersofNK/NKTcells(Fig.3B,Canddatanotshown).Collectively,ourdatasuggestthat24hour-isoproterenolpretreatmentexacerbatesliverinjuryinsepticmicewithoutenhancingNK/NKTactivity.IsoproterenolandcholeratoxinexertdistincteffectsoncirculatingTNF-alevelsinsepticmiceundertheconditionof24hour-pretreatmentBesidesNK/NKTactivity,anotherkeyfactorinvolvedinLPS-inducedliverinjury103 issolubleTNF-a.Inthisscenario,wemeasuredseveralcirculatingcytokinesincludingTNF-ainsepticmiceandfoundthatTNF-a； Manalysis(Fig.5E,F).Thus,isoproterenolandcholeratoxinexertdistincteffectsontheproductionofTNF-afrommacrophagesundertheconditionof24hour-pretreatment.BothisoproterenolandcholeratoxininducedcellularcAMPaccumulationinvarioustypesofcellsincludingmacrophage.Weisolatemicebonemarrow-derivedmacrophagesandtreatedwithPBS,choleratoxinorisoproterenol.WemeasuredtheintracellularcAMPconcentrationofthemacrophagesafterLPSchallenge.However； administrationaftersurgeryortraumaandthemortalityofthepatientsinsepsis.TNF-a,apro-inflammatoryfactorabundantlyexpressedinsepsis,ispredominantlyproducedbymonocytesandphagocytes[21].Inourstudy,weshowedthattheabilityofbonemarrow-derivedmacrophagestoreleaseTNF-awasnotenhancedundertheconditionof24hoursisoproterenolpretreatment,but24hourscholeratoxinpretreatmentleadtodramaticallyreducedTNF-aproductionofbonemarrow-derivedmacrophages.ItseemedthatcontinuoushighlevelofcAMPbycholeratoxin24hourspretreatmentmaybethereasonofprotectingmicefromLPSinducedendotoxicshock(Fig.5G),becausecAMPcouldsuppressinflammatorycytokinessuchasTNF-a.Unexpectedly,thismechanismwasnotenoughtoexplaintheworseliverinjurycausedby24hoursisoproterenolpretreatmentbecausenoenhancedTNF-aproductionwasobservedcomparedwithPBSpretreatment.p-adrenergicagonistswerereportedtoaffecthepatocyteinmanyofscenarios；； wmfixation/permeabilizationkitandcytokineELISAkitswerepurchasedfromeBioscience(SanDiego；；；。；； IsolationofperitonealmacrophagesCellswerecollectedfromnormal,unstimulatedmicebyrepeatedlyinjecting3mloftissueculturemediumintraperitoneallyandaspiratingthefluidcontentswithasyringe.Harvestsfrom10to24micewerepooled,pelletedbycentrifugation(2,000rpmfor5min)at4。。】° 1?incubatedwithspecificantibodiesfor30minoniceinthepresenceof2.4G2mAbtoblockFcyRbinding.Isotypeantibodieswereincludedasnegativecontrols.Forintracellularcytokinestaining,single-cellsuspensionswerestimulatedwith1pg/mlLPSinthepresenceofbrefeldinAsolutionfor4h.Afterstimulation,cellswerestainedwithFITC-anti-F4/80antibody,fixedandpermeabilizedusingafixation/permeabilizationkitandstainedwithPE-anti-TNF-aantibodyinaccordancewiththemanufacturer'sinstructions.FlowcytometrywasperformedonaBectonDickinsonFACSCaliburmachine.MeasurementofintracellularcAMPCellswerewashedtwicewithcoldPBSandlysedin250^ilcelllysisbufferprovidedbyaParametercAMPassaykitwiththreecyclesoffreeze-thaw.ThecelllysateswereusedtomeasureintracellularcAMPaccordingtothemanufacturer'sinstructions.IsolationoflivermononuclearcellsIsolationoflivermononuclearcellswasperformedaspreviouslydescribed[26].Briefly,liverswereremovedandmincedintosmallpieces,whichwereshakeninthedigestionbuffer(0.05%collagenaseinHBSSwith0.01%trypsininhibitor)at37。 1?StatisticalanalysisThesurvivalcurveswerecomparedbyKaplan-Meieranalysis.OtherstatisticalanalysiswasperformedusingtheStudent'st-test.Thedifferencewasconsideredstatisticallysignificantwhenp<0.05.AcknowledgmentsThisworkwassupportedbygrantsfromNationalNaturalScienceFoundationofChina(30973547,31100544),NationalKeyBasicResearchProgramofChina(2010CB911904).References1.SalpeterSR,OrmistonTM,SalpeterEE.Cardiovasculareffectsofbeta-agonistsinpatientswithasthmaandCOPD:ameta-analysis.Chest2004;125:2309-21.2.BurkartV,KimYE,HartmannB,GhieaI,SyldathU,KauerM,FingbergW,Hanifi-MoghaddamP,etal.CholeratoxinBpretreatmentofmacrophagesandmonocytesdiminishestheirproinflammatoryresponsivenesstolipopolysaccharide.JImmunol2002;168:1730-7.3.LavelleEC,McNeelaE,ArmstrongME,LeavyO,HigginsSC,MillsKH.CholeratoxinpromotestheinductionofregulatoryTcellsspecificforbystanderantigensbymodulatingdendriticcellactivation.JImmunol2003;171:2384-92.4.SevernA,RapsonNT,HunterCA,LiewFY.Regulationoftumornecrosisfactorproductionbyadrenalineandbeta-adrenergicagonists.JImmunol1992;148:3441-5.5.SzaboC,HaskoG,ZingarelliB,NemethZH,SalzmanAL,KvetanV,PastoresSM,ViziES.Isoproterenolregulatestumournecrosisfactor,interleukin-10,interleukin-6andnitricoxideproductionandprotectsagainstthedevelopmentofvascularhyporeactivityinendotoxaemia.Immunology1997;90:95-100.6.KogaK,TakaesuG,YoshidaR,NakayaM,KobayashiT,KinjyoI,YoshimuraA.Cyclic110 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3:70-8.FigurelegendsFigure1.SurvivalratesofmicepretreatedwithPBS,choleratoxin,orisoproterenolduringsepticshock.(A)ThemicewerepretreatedwithPBS,choleratoxinorisoproterenol,andthen24hlater,septicshockwasinducedbyadministeringi.p.with5xl08heat-killedE.coli.DH5a.Thesurvivalratesofthethreegroupsofmicewereassessedinthetimeof24h,48h,and72h.(B)Septicshockwasinducedbyadministeringi.p.with25mg/kgLPSandthesurvivalrateswereassessedinthetimeof24h,48h,and72h.Figure2.Isoproterenolleadstoheavierliverinjuryincontrasttocholeratoxin.MicewerepretreatedwithPBS,choleratoxinorisoproterenol,andsepticshockwasinducedbyadministeringi.p.with25mg/kgLPSafter24h.4hlater,thebloodsampleswereobtained.SerumALT(A)andAST(B)wereassessedbyELISA.Resultsweremean±士 1?comparethedifferencebetweenthetwogroups.Figure4.choleratoxinbutnotisoproterenolreducescirculatingTNF-alevels.MicewerepretreatedwithPBS,choleratoxinorisoproterenolfor24h,followedbyLPSchallengedfor4h.ThenserumcytokinesweremeasuredbyELISA.Resultsweremean± ?Figure1AB~o—口口一—碎■卢■■。。圖”屋厂兮—’々；■■色‘丨“；。！￡ mmFigure320r200r2.0-**,TI一“‘门±丨「「丄±。。彻‘■■°■丨“■丄…一！二“驗旧各旧■『隱。二二」旧霄和°■二口？兰““、 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果姓名：汪静洋籍贯：山东出生年月：年月专业：内科学英语水平：六级学习经历：年月年月南开大学医学院七年制年月年月中国人民解放军总医院神经内科（南开大学医学院）在学期间发表的论文和学术成果：刘静，梁丽，汪静洋，王慧娟，王晓峰，倪虹，口服髙渗氯化钠维生素液对腹腔感染大鼠肠屏障的保护作用。现代生物医学进展，汪静洋，邱怀雨，黄厚斌，李艽，赵朔，魏世辉，误诊为双眼视神经炎的多颅神经炎一例。中华眼视光学与视觉科学杂志，，汪静洋，杨飞，杨光，魏世辉，儿童多发性硬化的临床特点与眼部表现分析。中国中医眼科杂志，，，，，共同一作，，