维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究

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学校代码：１０２８５学２０１４４３４７０７１ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ硕士学位论文维生素Ｄ及其受体基因多态性在房颤发＾中变化及价值的研病ＶｉｔａｍｉｎＤａｎｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒｅｎｅｓｇｅｎｎｔｈｅａｔｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆａｔｒｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎｐｇ研究生姓名张明芝指导教师姓名公共卫生专业名称研究方向—医学部公共生学院所在院系２０１７年１０论文提交日期１０月日 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任Ｕ．论文作者签名：叫未曰期：＞７．ｎ＾ 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸一质论文的内容相致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本规定。＿非涉密论文口论文作者签名：叫象日期：（ｂｎ导师签名：３ｍｔ日期：糾１．丨丨，竑 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究中文摘要维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究中文摘要目的：分析房颤患者外周血25-羟基维生素D3（25OHVD3）的水平变化、维生素D基因rs2228570单核苷酸多态性变化，以了解维生素D缺乏和VDR基因多态性对房颤发病的影响。研究方法：选择泰州市人民医院心内科病房的173例房颤住院患者和173例体检中心体检指标正常作为健康对照人群，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测25OHVD3水平，分析其与肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、总胆固醇（TC）、（TG）、血糖（GLU）、C反应蛋白（CRP）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞百分比（N%）、单核细胞百分比（M%）、淋巴细胞百分比（L%）等实验室指标的相关性。从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库获取VDR基因的参考序列及单核苷酸多态信息。应用PCR-测序的方法对VDR基因rs2228570SNP进行基因分型，分析不同基因型CK、CK-MB、TC、TG、GLU、CRP、WBC、N%、M%、L%差异。采用SigmaPlot12.0统计软件进行处理。研究结果：①与正常对照组比较，房颤患者WBC、N%、TC、TG、CRP均显著升高（P<0.05），而L%显著降低（P<0.05）；②正常对照组、房颤组25OHVD3水平差异分析结果显示：与正常对照组比较，房颤患者25OHVD3显著降低[（38.28±8.07）μg/LVS（33.39±7.94）μg/L，P<0.001]。③正常对照组、房颤组VDR基因rs2228570的SNP的差异分析显示，房颤组VDR基因的CC型为20.2%(35/173)、TC型为68.8%(119/173)、TT型为11.0%(19/173)，与对照组[CC型31.2%(54/173)、TC型43.4%(75/173)、TT型25.4%(44/173)]比较，有统计学差异（P<0.001）。④房颤患者25OHVD3水平与实验室指标相关性分析结果显示：房颤患者25OHVD3水平与CRP、N%呈负相关（r=-0.209,P=0.00574；r=-0.155,P=0.0420），I 中文摘要维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究与L%呈正相关（r=0.164,P=0.0307）；与TG、TC、CK、CK-MB、WBC、M%均无相关性（P>0.05）。⑤房颤患者VDR基因rs2228570不同基因型患者实验室指标差异结果分析显示，VDR基因rs2228570的TC型房颤组WBC计数、N%显著高于CC组和TT组（P<0.001），而L%、M%显著低于CC型组和TT型组（P<0.001）。研究结论：房颤患者存在25OHVD3水平缺陷，25OHVD3水平与房颤炎症状态负相关。VDR基因rs2228570多态性与房颤的发病风险和患者的炎症状态有关联。本研究有助于进一步了解维生素D缺乏和VDR基因多态性对房颤发病的影响，从而为临床该疾病的治疗提供依据。关键词：房颤；维生素D；25-羟基维生素D；维生素D受体；基因多态性；作者：叶军指导老师：张明芝II 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究英文摘要VitaminDandPolymorphismofthereceptorgenesinthepathogenesisofatrialfibrillationAbstractObjective:Toinvestigatethelevelsof25OHVD3andtheSNPofrs2228570onthevitaminDreceptorgeneintheperipheralbloodofpatientswithatrialfibrillation(AF),inordertoanalyzetheeffectsofvitaminDdeficiencyandvitaminDreceptor(VDR)SNPontheAF.Methods:Onehundredandseventy-threeAFpatientsadmittedtotheDepartmentofCardiology,TaizhouPeople’sHospitalwereincludedinthisstudy,and173healthyindividualsreceivedphysicalexaminationsinthesamedepartmentwereenrolledasnormalcontrol.ELISAwasusedtodeterminethe25OHVD3level,andthencorrelationanalysiswasperformedtoanalyzethecorrelationbetween25OHVD3andCK,CK-MB,TC,TG,GLU,CRP,WBC,N%,M%andL%.BasedonthegenesequencesdownloadedfromtheNCBIdatabase,PCRamplificationwascarriedouttoanalyzethegenotypingofVDRrs2228570SNP.Meanwhile,thedifferencesbetweenCK,CK-MB,TC,TG,GLU,CRP,WBC,N%,M%andL%ofvariousgenotypeswerecompared.SigmaPlot12.0softwarewasusedforthedataanalysis.Results:Comparedwiththenormalcontrol,theWBC,N%,TC,TG,CRPintheAFpatientsshowedsignificantincrease(P<0.05),whiletheL%showedsignificantdecrease(P<0.05).The25OHVD3levelinAFpatientsshowedsignificantdecreasecomparedwiththatofthenormalcontrol(38.28±8.07μg/Lvs.33.39±7.94μg/L,P<0.001).Meanwhile,significantdifferenceswereobservedintheSNPsofVDRrs2228570oftheAFpatientscomparedwiththoseofthenormalcontrol(CC:20.2%vs.31.2%,P<0.001;TC:68.8%vs.43.4%,P<0.001;CC:11.0%vs.25.4%,P<0.001).Forthecorrelationbetween25OHVD3andlaboratoryindices,anegativecorrelationwasnoticedbetween25OHVD3andCRPandN%(r=-0.209,P=0.00574;r=-0.155,P=0.0420).Apositivecorrelationwasnoticedbetween25OHVD3andL%(r=0.164,P=0.0307).Nocorrelationwasnoticedbetween25OHVD3andTG,TC,CK,CK-MB,WBCandM%(P>0.05).TheWBCandN%intheAFpatientswithTCgenotypeweresignificantlyhigherthanthoseoftheCCphenotypeandTTphenotype(P<0.001),whileIII 英文摘要维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究theL%andM%inthesewithTCphenotypeweresignificantlylowerthanthatoftheCCphenotypeandTTphenotype(P<0.001).Conclusions:AFpatientsshowed25OHVD3deficiency,andthe25OHVD3levelwasnegativelycorrelatedwiththeAFsymptoms.TheSNPrs2228570onVDRwascorrelatedwiththeriskandsymptomsofAF.OurstudycontributestoourunderstandingontheeffectsofVitaminDdeficiencyandVDRonthepathogenesisofAF,whichcanprovidesolidbasisforthetreatmentinclinicalpractice.Keywords:Atrialfibrillation;vitaminD;25OHVD3;vitaminDreceptor;SNPWittenby:YeJunSupervisedby:ZhangMingzhiIV 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究目录第一章序言..................................................................................................................11.1研究背景.............................................................................................................11.1.1房颤的相关研究背景..............................................................................11.1.2维生素D的相关研究背景.....................................................................11.1.3维生素D受体及其基因多态性的相关研究背景.................................21.2研究意义.............................................................................................................3第二章研究对象与方法..............................................................................................52.1研究对象.............................................................................................................52.2诊断标准.............................................................................................................52.3入选与剔除标准.................................................................................................52.4实验室检测.........................................................................................................62.4.125OHVD3的测定.....................................................................................62.4.2常规指标测定..........................................................................................62.4.3VDR基因rs2228570单核苷酸多态性检测...........................................62.5统计学方法.........................................................................................................9第三章研究结果........................................................................................................103.1一般资料...........................................................................................................103.2正常对照组、房颤患者组25OHVD3水平、VDR基因RS2228570多态性情况.......................................................................................................................103.3房颤患者25OHVD3水平与其它实验室指标相关性分析.............................113.4房颤患者VDR基因RS2228570不同基因型患者实验室指标差异分析.....13第四章讨论................................................................................................................144.125OHVD3水平与房颤发病的关系.................................................................144.2维生素D受体基因多态性与房颤发病的关系..............................................154.3维生素D与房颤发病关系可能的机制。......................................................164.3.1维生素D缺陷对心脏电生理的作用与房颤发病的关系....................16 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究4.3.2维生素D的抗炎症作用与房颤发病的关系.......................................174.3.3维生素D对心房结构重构的影响........................................................184.3.4维生素D对RAAS的作用...................................................................19第五章结论................................................................................................................20参考文献........................................................................................................................21综述............................................................................................................................28在攻读硕士学位期间公开发表的论文........................................................................40致谢............................................................................................................................41 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第一章序言第一章序言1.1研究背景1.1.1房颤的相关研究背景心房颤动（AtrialfibrillationAF,房颤）是临床上最常见的持续性快速心律失常之一，是危害人类健康的重要疾病，可产生严重临床事件。据估算，在2010年世界上有2090万男性房颤患者，1260万女性房颤患者；在欧洲，到2030年将会有1400万～1700万房颤患者，每年还将新增加12万～21.5万确诊房颤患者。在20岁以上人群中，房颤发生率大约为3%[1-2]。房颤是增加死亡风险的独立危险因素，女性房颤患者全因死亡率是无房颤人群的2倍，男性房颤患者的全因死亡率是无房颤人群的1.5倍[3-5]。在高龄、高血压病、心力衰竭、冠心病、瓣膜病、肥胖、糖尿病或慢性肾病患者人群中，房颤发病率明显增加，另外人口的老龄化也使房颤的发病率进一步升高。房颤常见的病因包括心力衰竭、心脏辨膜疾病、高血压、心脏局部缺血等。在苏格兰[6]和丹麦Denmark[7]大样本量人口研究表明，房颤的发病率和死亡率在冬季最高，在夏季最低，而且与室外的温度呈现负相关。另外空气大气压力、温度[8-9]，和季节变化引起的呼吸道感染也可能是房颤重要的致病因素[6]。目前，药物用于治疗房颤的疗效有限，对其导致的并发症疗效也不佳。1.1.2维生素D的相关研究背景维生素D是一种脂溶性维生素，促进钙和磷在肠道的吸收。人体内的维生素D80-90%来自紫外线B波段照射皮肤合成，另有10-20%是由食物中摄取而得的。维生素D以两种主要的形式存在：维生素D2（麦角钙化醇）是由紫外线B照射麦角甾醇产生，可以作为补充或强化食品中的维生素[10]。维生素D3（胆钙化醇）是胆固醇的衍生物，是由紫外线B照射皮肤内的7-脱氢胆固醇产生[10]。人类和动物的皮肤是合成维生素D3的场所。紫外线(290－315nm)的照射对这种合成起决定作用。维生素D3在皮肤内合成的步序如下：皮肤内的7-脱氢胆固醇，在紫外线作用下首先转变成前维生素D3(PrevitaminD3)，再在体温情况下经2－3天转变成维生素D3。到目前为止，人们并未发现有任何酶参与维生素D3的合成反应，故维1 第一章序言维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究生素D3生物合成是一个非酶促的光化学反应。对人的皮肤研究发现，紫外线照射后的10－15分钟，约15%的7－脱氢胆固醇转变成前维生素D3，若再延长紫外线的照射时间到1小时，则7－脱氢胆固醇被光解的量也相应增加到40%，但有意思的是前维生素D3的产量并没有明显升高，所增加的是不具生物活性的光固醇(LumisteroL)和速固醇(tachysteroL)。同时，随着皮肤中黑色素的增加，欲得到相同产量的前维生素D3，紫外线照射的时间就要相应延长。但是，前V维生素D3的最大产量不因皮肤中所含黑色素多少而变化，都只相当于皮肤内贮存的7－脱氢胆固醇的15－20%。这表明肌体内存在某种调节机制，控制皮肤在接受过量紫外线照射时，维生素D3的产量能保持在一定的范围内，这样就不会出现接受过量紫外线而引起维生素D3中毒。维生素D3通过维生素结合蛋白（DBP）经血液运输至肝脏，在肝细胞内质网和线粒体中25－羟化酶的作用下，生成25羟维生素D3，再经血液运输至肾脏，在肾近曲小管1α-羟化酶的作用下生成活性作用最强的1,25-二羟维生素D3（1,25（OH）2D3）。转运至全身各处发挥作用1,25-（OH）2D3在体内具有多方面活性，如调节肾、肠道钙、磷代谢及组织生长分化等功能，研究证实补充维生素D有利于佝偻病、骨折等骨骼疾病的治疗作用和预后[11-12]，维生素D不仅在维护骨骼健康中起作用，而且在非骨骼疾病中起潜在作用，如自体免疫疾病、癌症、心理健康问题和心血管疾病等。虽然目前还没有对维生素D缺乏症（VitaminDdeficiency）的标准达成共识，但维生素D缺乏症在中国很常见，特别是在老年人中。由于意识到维生素D缺乏可能会使骨质疏松症进展、跌倒和骨折。近年来，越来越多的证据表明维生素D可以降低多种疾病的风险包括多发性硬化症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢和癌症预后[13-15]，这些研究显示维生素D除了在骨代谢中的作用，在其它系统仍也存在多种效能。近年来，有关维生素D缺陷与心血管疾病的相关研究越来越多[16-18]，然而，维生素D缺陷与房颤发病存在争议[19-24]。1.1.3维生素D受体及其基因多态性的相关研究背景维生素D受体（vitamindreceptor,VDR）为亲核蛋白，由427个氨基酸残基组成，属于类固醇激素/甲状腺受体超家族的成员，其与25OHVD3结合后，该复合物可与靶基因上游启动子区或调控区域上的特定DNA序列相结合，进而对靶基2 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第一章序言因的转录表达进行调控。VDR从N端到C端共有6个功能区（A～E），每个功能区分工不同但又相互协调，其中A/B区为N端短区，是不依赖于配体的具有组织细胞特异性的转录激活自主调节功能区。C区为DNA结合区（DNA-bindingdamain，DBD），由VDR外显子ⅱ、ⅲ编码，通过两个锌指结构选择性地识别靶基因上的维生素D反应元件（Vitamindresponsiveelement,VDRE），并以此改变局部DNA的构象，在其他协同转录激活/抑制因子和AF1、AF2两个亚区的共同参与下激活转录过程，进行基因表达和调控。D区为绞合区（Hingeregion），该区具有很高的免疫原性,但其确切的结构和功能还不清楚,也许和核定位有关。E区为配体结合区（Ligand-bindingdamain,LBD）,由VDR基因外显子v-ix编码。该区与1,25（OH）2D3有较高的亲和力。另外,该区还介导与类视黄醇X受体（retinoidxreceptor，RXR）形成异二聚体，增强其与VDRE的结合能力[25］。人类VDR基因位于常染色体12q12-14，是甾体类受体超家族中的一员，由14个外显子和数个内含子组成，总长度约75kb。5’端非编码区包括外显子1A、1B、1C、1D、1E、1F,另外8个外显子（外显子2-9）编码基因的蛋白产物。关于VDR基因多态性的研究,目前发现与个体生长发育及人类疾病相关的基因多态性分别对应限制性内切酶TaqⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ、FokI的酶切位点，依次位于第8内含子、第8内含子、第9外显子及第2外显子上。一般用t、b、a、f表示存在这4种内切酶的多态性位点，用T、B、A、F表示缺乏这4种内切酶多态性位点。根据近年来国内外有关VDR等位基因频率分布的研究报道表明，VDR等位基因分布因人种不同而有较大差异。如BsmI位点，在我国B等位基因频率不到10%，与韩国人相似（11%左右）,略低于日本人（15%～20%），而在高加索人群中B等位基因频率达35%以上。就基因型而言，我国以bb型较多，达90%以上，Bb型次之，而BB型不足2%；而在高加索人群中，则以Bb型居多，为45%～55%，而BB型达18%以上［26］。1.2研究意义目前有关维生素D缺陷与房颤发生、发展和预后之间的关系，尚存在争议。本研究通过分析房颤患者外周血25-羟基维生素D3(25OHVD3)的水平变化、维生素D基因rs2228570单核苷酸多态性变化，以了解维生素D缺乏和VDR基因多态3 第一章序言维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究性对房颤发病的影响。有助于进一步了解维生素D缺乏和VDR基因多态性对房颤发病的影响，从而为临床该疾病的治疗提供依据。尽管一些小样本量的实验性研究和观察性研究提示了结果较差，但大规模的前瞻性研究维生素D缺陷与房颤发生、发展和预后之间的关系，仍值得进一步研究。4 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第二章研究对象与方法第二章研究对象与方法2.1研究对象来源于泰州市人民医院2016年2月至2017年1月的住院患者，临床诊断的房颤患者193例，其中男104例，女69例，平均年龄(60.09±19.59)岁。另选择同期的泰州市人民医院体检中心健康体检者各项指标正常的193例作为对照组，其中男92例，女81例，平均年龄（54.50±15.01）岁。2.2诊断标准参照2016年欧洲心脏病学会年会（ESC）发布《2016年欧洲房颤管理指南》[27]。出现以快速、无序心房电活动为特征的室上性快速性心律失常。心电图上主要表现为：P波消失，代之以不规则的心房颤动波；RR间期绝对不规则(房室传导存在时)。心房因无序电活动而失去有效收缩，且房室结对快速心房激动呈现递减传导，造成极不规则心室律以及快速或缓慢心室率，导致心脏泵血功能下降，心房内附壁血栓形成。根据房颤发作的持续时间可将房颤分为阵发性房颤(paroxysmalAF)、持续性房颤(persistentAF)、长程持续性房颤(long-standingpersistentAF)和永久性房颤(permanentAF)。阵发性房颤：发作后7d内能够自行或干预后终止的房颤，其发作频率不固定。持续性房颤：持续时间超过7d的房颤。长程持续性房颤：持续时间超过12个月的房颤。永久性房颤：特指医生和患者共同决定放弃恢复或维持窦性心律(窦律)的一种房颤类型，主要反映了患者和医生对于房颤的一种治疗态度，而不是房颤自身的病理生理特征，可在患者和医生的治疗倾向性、治疗方法的有效性和患者症状发生变化时改变其分类。首诊房颤：首次检测到的房颤，不论其是否首次发作、有无症状、是何种类型、持续多长时间、有无并发症等。非瓣膜性房颤：指无风湿性二尖瓣狭窄、机械/生物瓣膜、二尖瓣修复情况下发生的房颤。2.3入选与剔除标准入选标准参考上述诊断标准，根据《指南》[27]对检索出临床诊断符合房颤的病例进行筛选，并剔除资料不完整的病例。排除标准：严重肝肾功能不全、感染5 第二章研究对象与方法维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究性疾病、血液系统疾病、风湿免疫性疾病和恶性肿瘤患者不纳入本研究。2.4实验室检测2.4.125OHVD3的测定将血清样本以1：40的比例进行稀释，取50μL,另加50μL的酶工作液，37℃孵育1h，洗板5次，加50μL底物A和50μL底物B，37℃孵育10min，加50μL终止液，5min内在酶标仪上450nm、630nm读取吸光度值，制作标准曲线，求出对应标本浓度。2.4.2常规指标测定患者入院24h内采清晨空腹静脉血，不抗凝，于4h内完成常规检测。检测肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、总胆固醇（TC）（酶法）、甘油三酯（TG）（酶法）、C反应蛋白（CRP）。同时采集外周血EDTA-K2抗凝血，进行白细胞计数（WBC）、中性粒细胞百分比（N%）、单核细胞百分比（M%）、淋巴细胞百分比（L%）分析，单核细胞计数（M）。2.4.3VDR基因rs2228570单核苷酸多态性检测2.4.3.1引物的设计与合成在NCBIGeneBank数据库中找出VDR的序列信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000376.2）如下ATGGAGGCAATGGCGGCCAGCACTTCCCTGCCTGACCCTGGAGACTTTGACCGGAACGTGCCCCGGATCTGTGGGGTGTGTGGAGACCGAGCCACTGGCTTTCACTTCAATGCTATGACCTGTGAAGGCTGCAAAGGCTTCTTCAGGCGAAGCATGAAGCGGAAGGCACTATTCACCTGCCCCTTCAACGGGGACTGCCGCATCACCAAGGACAACCGACGCCACTGCCAGGCCTGCCGGCTCAAACGCTGTGTGGACATCGGCATGATGAAGGAGTTCATTCTGACAGATGAGGAAGTGCAGAGGAAGCGGGAGATGATCCTGAAGCGGAAGGAGGAGGAGGCCTTGAAGGACAGTCTGCGGCCCAAGCTGTCTGAGGAGCAGCAGCGCATCATTGCCATACTGCTGGACGCCCACCATAAGACCTACGACCCCACCTACTCCGACTTCTGCCAGTTCCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATGGTGGAGGGAGCCATCCTTCCAGGCCCAACTCCAGACACACTCCCAGCTTCTCTGGGGACTCCTCCTCCTCCTGCTCAGATCACTGTATCACCTCTTCAGACATGATGGACTCGTCCAGCTTCTCCAATCTGGATCTGAGTGAAGAAGATTCAGATGACCCTTCTGTGACCCTAGAGCTGTCCCA6 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第二章研究对象与方法GCTCTCCATGCTGCCCCACCTGGCTGACCTGGTCAGTTACAGCATCCAAAAGGTCATTGGCTTTGCTAAGATGATACCAGGATTCAGAGACCTCACCTCTGAGGACCAGATCGTACTGCTGAAGTCAAGTGCCATTGAGGTCATCATGTTGCGCTCCAATGAGTCCTTCACCATGGACGACATGTCCTGGACCTGTGGCAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGACGTGACCAAAGCCGGACACAGCCTGGAGCTGATTGAGCCCCTCATCAAGTTCCAGGTGGGACTGAAGAAGCTGAACTTGCATGAGGAGGAGCATGTCCTGCTCATGGCCATCTGCATCGTCTCCCCAGATCGTCCTGGGGTGCAGGACGCCGCGCTGATTGAGGCCATCCAGGACCGCCTGTCCAACACACTGCAGACGTACATCCGCTGCCGCCACCCGCCCCCGGGCAGCCACCTGCTCTATGCCAAGATGATCCAGAAGCTAGCCGACCTGCGCAGCCTCAATGAGGAGCACTCCAAGCAGTACCGCTGCCTCTCCTTCCAGCCTGAGTGCAGCATGAAGCTAACGCCCCTTGTGCTCGAAGTGTTTGGCAATGAGATCTCCTGA再找出rs2228570部分的序列信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2228570）如下：GCACCAAGGATGCCAGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCTGACCGTGGCCTGCTTGCTGTTCTTACAGGGAA/C/G/TGGAGGCAATGGCGGCCAGCACTTCCCTGCCTGACCCTGGAGACTTTGACCGGAACGTGCCCCGGATCTGTGGGGTGTGTGGAGACCGAGCCACTGGCTTTCACTTCAATGCTATGACCTGTGAAGGCTGCAAAGGCTTCTTCAGGTGAGCCCTCCTCCCAGGCTCTCCCCAGTGGAAAGGGAGGGAGAAGAAGCAAGGTG根据基因序列及参考文献，设计扩增引物如下：表1VDR基因rs2228570位点引物序列引物名称序列（5’－3’）Forward:5’-GCACCAAGGATGCCAGCTGGCCCTGGCACTrs2228570-3’Reverse:5’-CACCTTGCTTCTTCTCCCTCCCTTTCCACT-3’2.4.3.2血液样本基因提取取清晨空腹采集EDTA-K2抗凝静脉血，混匀。使用BloodGenMiniKit血液基因组柱式提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），操作步骤如下：2.4.3.1在1.5ml离心管底部加入20μlProtease.7 第二章研究对象与方法维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究2.4.3.2.加入200μl样品，不足200μl加BufferGR补足至200μl。本样品中RNA和DNA同时存在，可以将DNA和RNA共纯化，RNA可能会抑制下游的一些酶促反应，但对PCR反应没有影响，在加入BufferGL之前加入4μlDNaseFree的RNaseA(100mg/ml)。2.4.3.3.向样品中加入200μlBufferGL，涡旋震荡15秒。不要直接将Protease.加入到BufferGL中；此步必须使样品和BufferGL充分混匀确保裂解效率。2.4.3.4.56℃孵育10分钟。孵育10分钟DNA的产量已经达到最大，继续延长孵育时间对DNA产量和纯度没有影响。2.4.3.5.加入200μl无水乙醇，涡旋震荡15秒，混合完毕短暂离心，使管壁和盖子上的液体集中到管底。2.4.3.6.将步骤5中得到的溶液小心转入SpinColumnDM中（SpinColumnDM请放入CollectionTube中），避免加入到SpinColumnDM边缘，盖好管盖，8,000rpm（6000xg）离心1分钟，将SpinColumnDM放入一个新的CollectionTube中，弃掉装有废液的CollectionTube。注意：盖好管盖，避免离心时产生气溶胶；用最大转速离心不会影响DNA的产量和纯度，如果溶解产物在离心后没有完全通过SpinColumnDM，用更高转速离心直到SpinColumnDM中没有液体；以最大转速进行离心，以免发生堵塞。2.4.3.7.小心打开管盖，向SpinColumnDM中加入500μlBufferGW1（使用前检查是否加入无水乙醇）,避免加入到SpinColumnDM边缘，盖好管盖，8,000rpm（6000xg）离心1分钟,将SpinColumnDM放入一个新的CollectionTube中，弃掉装有废液的CollectionTube。2.4.3.8.小心打开管盖，向SpinColumnDM中加入500μlBufferGW2（使用前检查是否加入无水乙醇），避免加入到SpinColumnDM边缘，盖好管盖，最大转速离心3分钟,弃废液。2.4.3.9.将SpinColumnDM放入一个新的离心管中，最大转速离心1分钟。这一步的目的是将吸附柱中残余的BufferGW2去除，BufferGW2中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。2.4.3.10.将SpinColumnDM转入新的离心管中，加入200μlBufferGE或灭菌水，室温（15-25℃）放置1分钟，8,000rpm（6000xg）离心1分钟，得到DNA8 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第二章研究对象与方法溶液。DNA产物置于-20℃保存。2.4.3.3VDR基因的PCR扩增及测序分别加基因组模板5µl、DEPC水37µl、10×TagBuffer5µl、2.5mMdNTP（江苏省弗泰生物科技有限公司，CatNo.：BS004）1µl、正向引物（50pM）0.5µl、反向引物（50pM）0.5µl、Taq酶（江苏省弗泰生物科技有限公司，CatNo.：RD003）1µl的反应体系。然后进行PCR：预变性:95℃5分钟，94℃30秒,55℃30秒,72℃30秒,35个循环;72℃5分钟。将PCR产物测序、分析，结果见图1。图1VDR基因rs2228570的多态性测序图2.5统计学方法本文数据采用SigmaPlot12.0统计软件进行处理，计量资料符合正态分布采用（xs）表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计量资料不符合正态分布用中位数(P25,P75)表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以2率（%）表示，采用检验比较两组或多组率。采用线性相关分析两组数值变量之间的相关性，以P<0.05作为有统计学意义。9 第三章研究结果维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第三章研究结果3.1一般资料正常对照组、房颤患者组相关资料见表2。分析结果显示：与正常对照组比较，房颤患者WBC计数、N%、TC、TG、CRP均显著升高（P<0.05），而L%显著降低（P<0.05）。表2正常对照组、房颤组一般资料比较正常对照组房颤组统计学分析2N(男/女)173(104/69)173（92/81）χ=1.424P=0.233年龄（岁）54.50±15.0160.09±19.59t=0.795P=0.4289#WBC(×10个/L)6.92±1.718.06±5.50t=2.606P=0.010#中性（%）55.63±7.6165.31±15.36t=7.435P<0.001#淋巴（%）34.52±6.9425.00±13.37t=8.310P<0.001单核（%）7.41±1.617.89±3.62t=1.578P=0.115CK（U/L）104.82±68.68102.01±105.93t=0.292P=0.770CK-MB（U/L）12.40±15.6813.34±12.62t=0.616P=0.538#TC（mmol/L）4.17±1.005.14±0.92t=9.354P<0.001#TG（mmol/L）1.49±0.931.97±1.49t=3.578P<0.001#CRP（mg/L）4.01±4.6035.47±50.64t=8.139P<0.0013.2正常对照组、房颤患者组25OHVD3水平、VDR基因rs2228570多态性情况正常对照组、房颤组25OHVD3水平差异分析(见图2)，结果显示：与正常对照组比较，房颤患者25OHVD3显著降低[（38.28±8.07）μg/LVS（33.39±7.94）μg/L，P<0.001]。正常对照组、房颤组VDR基因rs2228570的SNP的差异分析(见图2)，结果显示，房颤组VDR基因的CC型为20.2%(35/173)、TC型为68.8%(119/173)、TT型为11.0%(19/173)，与对照组[CC型31.2%(54/173)、TC型43.4%(75/173)、TT型25.4%(44/173)]比较，有统计学差异（P<0.001）。10 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第三章研究结果
CC型,35TC型,119TT型,19房颤组CC型,54TC型,75TT型,44正常对照组0%20%40%60%80%100%图2正常对照组、房颤患者组25OHVD3水平、VDRSNP的差异3.3房颤患者25OHVD3水平与其它实验室指标相关性分析房颤患者25OHVD3水平与实验室指标相关性分析（见图3）。结果显示：房颤患者25OHVD3水平与CRP、N%呈负相关（r=-0.209,P=0.00574；r=-0.155,P=0.0420），与L%呈正相关（r=0.164,P=0.0307）；与TG、TC、CK、CK-MB、WBC、M%均无相关性（P>0.05）。11 第三章研究结果维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究图325OHVD3水平与实验室指标结果的相关性12 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第三章研究结果3.4房颤患者VDR基因rs2228570不同基因型患者实验室指标差异分析：房颤患者VDR基因rs2228570不同基因型患者实验室指标差异（见表3，4）。结果显示，VDR基因rs2228570的TC型房颤组WBC计数、NEU%显著高于CC组和TT组（P<0.001），而LYM%、MON%显著低于CC型组和TT型组（P<0.001）。而不同基因型房颤组CK、CK-MB、TC、TG、CRP、25OHVD3均无统计学差异（P>0.05）表3房颤患者VDR基因rs2228570不同基因型患者实验室指标差异CC(n=35)TC(n=119)TT(n=19)统计学分析2N(男/女)20/1560/5912/7χ=1.344P=0.511年龄（岁）59.9±16.860.9±19.855.6±23.6F=0.583P=0.569#WBC(×10/L)5.68±1.418.75±3.67*5.12±1.91F=19.794P<0.001#中性（%）56.70±10.4370.05±13.88*51.52±17.09F=23.824P<0.001#淋巴（%）30.93±9.6521.44±12.15*36.32±16.69F=17.192P<0.001#单核（%）9.93±3.756.94±2.70*10.03±5.64F=15.123P<0.001CK（U/L）70(54,85)75(51,110)70(47,109)H=0.674P=0.674CK-MB（U/L）10(7,13)9(6,15)11(6,23)H=1.225P=0.542TC（mmol/L）4.05±1.084.27±0.973.79±0.98F=2.233P=0.110TG（mmol/L）1.424±0.741.55±1.021.24±0.51F=1.502P=0.351CRP（mg/L）8.3(3.2,76.1)7.6(3.1,47.9)8.3(3.3,64.4)H=0.937P=0.62625OHVD332.51±8.9931.19±7.6036.27±7.81F=1.510P=0.224（μg/L）备注：*各组与CC组比较，有统计学差异，P<0.05。#各组与TC组比较，有统计学差异，P<0.05。13 第四章讨论维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第四章讨论房颤是最常见的持续性心律失常，房颤发病机制非常复杂，心脏的电生理、炎症、心房重构、肾素-血管紧张素-醛固酮系统等在AF的发病机制中都起重要作用。维生素D受体（VDR）表达于心脏中的心肌细胞和成纤维细胞表面。25OHVD3会通过与VDR结合影响其生理功能。4.125OHVD3水平与房颤发病的关系近年来研究显示，维生素D缺乏与几种不同类型的心血管疾病相关，包括：高血压、冠心病、心梗和休克有关[28-30]。但其与房颤的发病关系存在争议：维生素D缺乏与房颤的发病关系存在争议：OzcanOU等对137例新发高血压房颤和90例无房颤患者进行研究，结果显示，维生素D缺陷是与高血压房颤相关[19]。ChenWR对162例中国非辨膜性顽固性房颤患者研究显示，患者维生素D水平显著低于对照组，而且与HS-CRP水平、左心房内径呈现负相关，Logistic回归分析显示，25OHVD3水平与AF相关[20]。DemirM对102例非辨膜性慢性房颤患者研究发现，25OHVD3水平显著低于辨膜性房颤组和对照组[21]。QayyumF等报道对258例AF患者研究显示，维生素D缺陷与AF的类型和并发症无关[22]。RienstraM等报道对2930例社区志愿者研究显示，随防9.9年，425例进展为AF,COX分析显示，维生素D状态与AF事件并不相关[23]。SmithMB等报道对初始无AF的人群来说，高水平的维生素D对AF的发病有风险，结论认为，25OHVD3水平超过100ng/dl，使AF的发病风险升高到2.5倍。作者认为可能的机理是，高水平的维生素D能致血钙水平升高，而高钙血症能导致心律失常[24]。这些研究中部分认为维生素D缺陷与房颤的发病有关[19-21]，另有部分研究显示无相关性[22-23]。还有1篇显示维生素D升高与房颤的发病相关[24]。通过对文献中研究的权重证据显示，维生素D缺陷与房颤的发病可能相关。我们研究显示，房颤患者25OHVD3水平显著低于正常对照，提示房颤患者25OHVD3水平下降可能是导致其发病的重要因素。免疫应答和炎症反应在房颤发病中起重要作用。研究显示，CRP可作用于房颤患者心房局部细胞，与心肌细胞膜结合，促进局部补体激活，放大了心房的炎14 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第四章讨论症反应，从而导致组织损伤[31]。CRP通过炎症作用导致心房细胞变性、坏死、纤维化，最终导致心房重构，从而导致房颤的持续存在。有文献报道，抗心律失常药物治疗无效的孤立性房颤患者的心房组织活检显示，存在炎症侵润、细胞坏死及心房肌纤维化[32]。我们研究显示，房颤患者25OHVD3水平与CRP、N%呈显著负相关。可能是维生素D水平下降导致患者体内抑制炎症能力下降，使炎症水平升高，导致房颤的发作。4.2维生素D受体基因多态性与房颤发病的关系研究显示,VDR基因多态性与多种疾病的发病相关，了Bell等[33]检测了39名成年黑人组及44名成年白人组,年龄在20～40岁之间,发现腰椎骨密度（bonemineraldensity，BMD）与ApaⅠ位点基因型在两组均相关,而TaqⅠ、BsmⅠ、FokⅠ位点基因型与腰椎BMD在两组均不相关；股骨颈处BMD与黑人相关；桡骨的BMD与白人相关。Strandberg等[34］检测了88例健康青春期男孩，平均年龄16.9岁,发现FokⅠ位点基因型与腰椎及全身BMD相关，与股骨颈BMD不相关。Lucotte等［35］检测了124例45～90岁绝经期后法国骨质疏松妇女，发现FokⅠ位点基因型在骨质疏松组与对照组无明显差异。但对98例75岁以下病人分析，ff型较FF型及Ff型个体在股骨颈处BMD值明显降低，表明绝经期后法国妇女ff基因型与股骨颈处较低BMD值相关。VDR基因多态性与身高的关系，在各位点的研究结果不同。LorentzonM等[36]在对90名健康高加索男性成人的研究中发现,BB基因型个体无论在出生时,还是在青春发育期及发育期后,身高都比Bb型和bb型个体低（p=0.005～0.008）。他们认为在高加索人群中,父母身高，个体出生时身高，个体出生时体重和其VDR等位基因多态性可以预测其最终身高的39%,其中VDR等位基因多态性就占8%。李慧敏等[37］的研究显示，VDR基因FokⅠ酶切位点各基因型在2型糖尿病组（DM）和正常对照组（N）中的分布差异具有显著性。两组间等位基因频率总体分布差异有显著性。DM组等位基因f和基因型ff频率明显高于N组。故等位基因f与2型糖尿病呈明显正关联。维生素D受体ApaⅠ、BsmⅠ基因座等位基因多态性与糖尿病视网膜病变（DR）有密切联系。孙京华等［38］研究维生素D受体TaqⅠ基因多态性与糖尿病视网膜病变的关系，在研究中发现,正常对照组的TT型高于DR组,而DR组的tt型高于正常对照组,并且两者之间15 第四章讨论维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究具有统计学差异。表明正常人和DR的患者中,维生素D受体TaqⅠ基因存在着多态性的差异。由此可以进一步推断,由于该基因多态性的差异,使得维生素D受体的表型发生改变,并通过上述途径,影响胰岛素的分泌和识别,从而对DR的发生以及发展造成一定的影响。我们研究显示，房颤组VDR基因rs2228570的TC型比例显著高于正常对照组人群，且TC型房颤组WBC计数、NEU%显著高于CC组和TT组（P<0.001），而LYM%、MON%显著低于CC型组和TT型组（P<0.001）。提示rs2228570位点的TC型是房颤发病的危险因素，可能是TC型与炎症的发生相关，从而导致房颤的发病。4.3维生素D与房颤发病关系可能的机制。4.3.1维生素D缺陷对心脏电生理的作用与房颤发病的关系心肌动作电位平台期主要依赖内向的L型钙电流和外向的延迟整流钾通道电流。流入心肌细胞的钙离子增加，激活纵行肌质网上的鱼尼丁受体。迅速释放纵行肌质网内钙离子入细胞质，进而促进肌钙蛋白与钙离子结合引发肌肉收缩。与此同时细胞质内升高的钙离子激活纵行肌质网上的钙泵，将细胞质中的钙离子回收人肌质网，细胞质内钙离子浓度降低，肌肉舒张。心肌肌小节收缩的频率和强度通过1,25(OH)2D进行调节，其主要通过作用于微管中的小窝蛋白3而起作用[39]。这种非基因组的进程作用主要通过膜结合VDR介导的作用，1,25(OH)2D能使心肌舒张加速，改善舒张期冠状血流[40]。1,25(OH)2D对通过调节β肾上腺素路径，促进细胞内钙离子内流进入心肌细胞[41]。研究发现体内活性氧/活性氮系统可增加鱼尼丁受体活性，导致细胞质内钙离子浓度升高，肌浆网内钙离子浓度下降[39]。Hanafy等人研究对兔左冠状动脉结扎术后心力衰竭（HF）的动物模型，1,25—二羟维生素D（1,25[OH]2D）对离体左心房心脏电生理的影响[42]。用触发动作电位（AP）对离体左心房进行电刺激，用0.1μM兰尼碱进行预处理（拮抗兰尼碱受体诱导钙释放，促进心肌收缩）。1,25[OH]2D注入组织在0.01，0.1和1nM的浓度，微电极用于测量静息膜电位（RMP），动作电位的幅度（APA），和AP持续时间（APD）。结果显示，当不使用兰尼碱时，1,25[OH]2D的APD呈现剂量依赖性增加，但不影响RMP或APA，电生理基质。相反，当使用兰尼碱16 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第四章讨论时，1,25[OH]2D不影响APD、RMP和APA，但没有减少收缩力。结果表明，1,25[OH]2D可能有影响在钙调节。无论是否存在或缺乏1,25[OH]2D的情况下，快速心房起搏和乙酰胆碱输液组合离体心房房颤的诱发。1,25[OH]2D处理后有64.3%心房发生房颤（n=14），而对照组为100%（n=14）（P<0.05），同时，1,25[OH]2D组延长APD。除此之外，在1,25[OH]2D治疗组心率均较慢。在HF兔（n=5），1,25[OH]2D对AF具有保护作用，AF只诱导RAP和输注乙酰胆碱11.9%，而对照组为100%（P<0.001）。此外，1,25[OH]2D组APD延长的（P<0.05）。影响心房与1,25[OH]2D对离体兔浦肯野纤维QT间期或APD没有影响。4.3.2维生素D的抗炎症作用与房颤发病的关系免疫应答和炎症反应在房颤发病中起重要作用。炎症作为一个潜在的因素促进许多因素的改变，氧化应激常常促进心房炎症，产生过量活性氧簇（ROS），房颤促进心房结构进一步改变，导致持久性的心律失常。炎性反应中间产物及炎性因子可以作用于L型钙通道、钙泵、钠－钙交换等，这些作用使得钙离子内流减少，细胞质内钙离子浓度升高(即钙超载)，肌质网内钙离子浓度下降，而外向钾电流并未受到明显影响，致使心肌收缩、舒张时间和幅度下降，从而使有效不应期和动作电位时程下降，诱发房颤发生。Levick等[43]在交感神经调节炎性反应和高血压状态下心脏重构的研究中发现，交感神经能够通过激活炎性反应促进心肌纤维化。推测在房颤状态下，交感神经过度分布诱导炎性细胞增殖和分化，进而分泌炎性因子促进心肌纤维化，导致房颤持续和复发。TNF-α是一种促炎细胞因子，由单核细胞和巨噬细胞合成，研究发现，持续房颤患者血清中TNF-a水平高于阵发性房颤患者，而在慢性房颤患者，血清和左心房TNF-α水平均升高[44-45]TNF-α通过转化生长因子a-Smad信号传导通路、促进MMP分泌和心肌纤维母细胞分化为心肌成纤维细胞等作用导致心房纤维化和缝隙连接蛋白40表达异常，诱发房颤[46]。白细胞介素6（IL-6）是一种具有多效生物学作用的细胞因子，可由多种细胞分泌。研究显示，IL-6与冠状动脉旁路移植术后房颤发生和房颤复律成功相关[47]。VDR表达于多种免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞和激活的T细胞。1,25(OH2)D和25(OH)D通过靶向作用于单核/巨噬细胞细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶1从而抑制TNF-α和IL-6[48]，其机制通过降低Toll样受体介导的炎症反应，下调巨噬细胞前炎症因子microRNA-15517 第四章讨论维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究的表达，从而抑制细胞因子信号通路[49]。4.3.3维生素D对心房结构重构的影响心房结构重构易诱导心肌电生理的紊乱，导致持续性或永久性房颤[50]。特定组织的功能总是与其结构相适应，组织结构的特点决定其相应功能；同样，心房肌的结构决定其心肌电表达，即心肌电的改变是继发于心房组织结构的变化而适应机体脏器的生理功能需要[51]。维生素D受体（VDR）表达于心脏中的心肌细胞和成纤维细胞表面[52]。1,25(OH)2D会通过与VDR结合影响其生理功能[53-54]。大量的动物实验证实，VDR是重要的调节心肌肥厚，介导心肌纤维化，其机制还不清楚[55-57]。实验证据显示，维生素D缺乏会促进心脏重构，其原因可能是心肌细胞进展性肥大。1,25(OH)2D抑制神经钙蛋白抑制蛋白1（一种抑制活化T细胞的calcineurin/NF的下游靶点）。然而在病毒性心肌炎的鼠模型中，维生素D能降低心肌的纤维化，通过抑制骨桥蛋白的表达[58]。1,25(OH)2D还能抑制前房尿钠肽，虽然对其在抗心肌肥大中是否有效尚不清楚[59]。但1,25(OH)2D能促进尿钠肽受体的升高，抑制RAS和心肌肥大。另有研究显示，在1-α羟化酶缺陷的小鼠中，因无法合成活性代谢产物1,25-二羟维生素D，出现高血压和左心室肥厚[4]。对高血压患者肾动脉研究显示，骨化三醇降低的内皮细胞的血管紧张素1受体的表达，改善内皮功能和防止活性氧生产过剩[60]。维生素D受体缺失小鼠继发性甲状旁腺也可能有助于肾素上调[61]，而PTH静脉输注增加血浆肾素活性和肾素释放[62-63]。在VDR敲除的小鼠出现心室肥厚和基质折叠增加[64-65]。在这种模型中同时出现高血压和甲状旁腺素升高，这两者都可引起心脏肥大[66-67]。使用选择性删除心肌细胞VDR基因的动物模型中，心肌细胞上的1,25(OH)2D直接影响体外的抗心肌肥大的效应，但很少影响其纤维化。维生素D受体缺失小鼠renin的表达的持续升高，维持血电解质的正常水平[61]。增加renin合成会导致了血管紧张素II的生产增加，这是一种强的血管收缩剂，可促进高血压和左心室肥大的发展[61]。临床研究也显示，妊娠妇女维生素D缺陷与新生儿心肌炎相关[68]。流行病学证实在成人中，低剂量维生素D与心衰发病、预后差相关，其作用通过介导激活RAS和炎症作用[69]。但也有两个临床试验显示，维生素D在心衰患者中未显示有益[70-71]。维生素D能调节血压，防止心肌肥厚，通过抑制renin激活，阻止血管钙化，通过降低MMP2和MMP9产生，提供glycemic控制，导致前炎症因子抑制的上调18 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第四章讨论IL-10水平，调节甲状腺素功能[72]。这些作用机制的表明维生素D可以预防房颤。4.3.4维生素D对RAAS的作用肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAA）维持血管阻力中起重要作用，通过血管紧张素II的合成，和细胞外液体积的平衡，以及醛固酮的释放发挥作用[61]。在对动物和人类的研究中证明，维生素D通过抑制renin基因表达[73]，降低RAA活性[74]。维生素D通过调节renin基因启动子的cis-DNA元件，调节包括renin在内的相关基因的表达[75-76]，从而下调了RAA系统。维生素D缺陷会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS），而RAS轴在房颤的病理生理机制中发挥重要作用，介导钙离子的稳定性。维生素D能结合心肌细胞，发挥抗氧化作用，降低心房ROS水平，其促进炎症，促进心律失常前结构的形成。由于维生素D具有抗氧化作用，据推测，维生素D水平可能对心房的活性氧簇（ROS）的产生的影响，并随后致心律失常基质的形成。除了这种直接的抗心率失常的机制，维生素D的负调节肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS），有助于维持血压水平，减少房颤的心房结构重构[76]。肾素表达维生素D调节是不依赖于钙代谢，骨化三醇能通过维生素D受体介导的机制抑制肾素转录[61]。Ferder等认为在维生素D和肾素-血管紧张素系统（RAS）之间可能存在反馈机制，考虑到维生素D和血管紧张素II受体分布于同一组织中，RAA活性变化和活化的维生素D受体似乎成负相关，维生素D缺乏可以通过RAA的系统诱导的细胞炎症反应的活性来解释。治疗时应考虑结合RAS阻断和VDR激活[77]。维生素D过多也会引起血管和软组织钙化，钙沉积于血管平滑肌细胞可导致RAA激活[78]。综上所述，目前有关维生素D缺陷与房颤发生、发展和预后之间的关系，尚存在争议。其原因是一些研究多针对住院患者，而房颤发生更多的是在社区和门诊患者。另外通过系统全面的测定术前和术后局部和系统的ROS、炎症细胞因子以及急性时相反应蛋白水平有例于了解房颤的发病机制、评估维生素D缺乏与房颤发病和预后的关系，另外对维生素D缺乏的房颤个体进行补充给药值得进一步研究。尽管一些小样本量的实验性研究和观察性研究提示了结果较差，但大规模的前瞻性研究维生素D缺陷与房颤发生、发展和预后之间的关系，仍值得进一步研究。19 第五章结论维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究第五章结论房颤患者存在25OHVD3水平缺陷，25OHVD3水平与房颤炎症状态负相关。VDR基因rs2228570多态性与房颤的发病风险和患者的炎症状态有关联，rs2228570位点的TC型是房颤发病的危险因素。研究进一步了解维生素D缺乏和VDR基因多态性对房颤发病的影响，从而为临床该疾病的治疗提供依据。20 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究参考文献参考文献[1]BjörckS,PalaszewskiB,FribergL,etal.Atrialfibrillation,strokerisk,andwarfarintherapyrevisit：Apopulation-basedstudy.Stroke,2013,44(11)：3103-3108.[2]HaimM,HoshenM,RegesO,etal.Prospectivenationalstudyoftheprevalence,incidence,managementandoutcomeofalargecontemporarycohortofpatientswithincidentnon-valvularatrialfibrillation.JAmHeartAssoc,2015,4(1)：e001486.[3]BenjaminEJ,WolfPA,D＇AgostinoRB,etal.Impactofatrialfibrillationontheriskofdeath：theFraminghamHeartStudy.Circulation,1998,98(10)：946-952.[4]StewartS,HartCL,HoleDJ,etal.Apopulation-basedstudyofthelong-termrisksassociatedwithatrialfibrillation：20-yearfollow-upoftheRenfrew/Paisleystudy.AmJMed,2002,113(5)：359-364.[5]AnderssonT,MagnusonA,BryngelssonIL,etal.All-causemortalityin272,186patientshospitalizedwithincidentatrialfibrillation1995-2008:aSwedishnationwidelong-termcase-controlstudy.EurHeartJ,2013,34(14)：1061-1067.[6]MurphyNF,StewartS,MacIntyreK,etal.Seasonalvariationinmorbidityandmortalityrelatedtoatrialfibrillation.IntJCardiol.2004Nov;97(2):283-288.[7]FrostL,JohnsenSP,PedersenL,etal.Seasonalvariationinhospitaldischargediagnosisofatrialfibrillation:apopulation-basedstudy.Epidemiology.2002,13(2):211-215.[8]ShobenAB,KestenbaumB,LevinG,etal.Seasonalvariationin25-hydroxyvitaminDconcentrationsinthecardiovascularhealthstudy.AmJEpidemiol.2011,174(12):1363-1372.[9]GłuszakA,KocońS,ZukK,etal.Episodesofatrialfibrillationandmeteorologicalconditions.KardiolPol.2008,66(9):958-963.[10]HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed.2007,357(3):266-81.[11]Bischoff-FerrariHA,WillettWC,OravEJ,etal.ApooledanalysisofvitaminDdoserequirementsforfractureprevention.NEnglJMed.2012,367(1):40-49.[12]WinzenbergTM,PowellS,ShawKA,etal.VitaminDsupplementationforimprovingbonemineraldensityinchildren.CochraneDatabaseSystRev.2010,(10):CD006944.21 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综述维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究综述维生素D缺乏与心血管疾病关系的研究进展摘要：维生素D缺乏症与许多临床疾病的发生有着非常密切的关系：维生素D水平低下会导致动脉粥样硬化，使血管炎症，内皮功能障碍，促进泡沫细胞的形成和平滑肌细胞增殖。维生素D的抗高血压作用包括抑制肾素－血管紧张素－醛固酮系统，对肾脏具有保护作用，对血管内皮细胞和钙代谢具有直接的作用效果。可以抑制血管平滑肌细胞的生长，预防继发性甲状旁腺功能亢进，对心血管疾病的风险因素也具有保护作用。维生素D还参与了血糖控制、脂质代谢、胰岛素分泌等。研究显示，维生素D缺乏影响的冠状动脉梗塞后的并发症、炎性细胞因子和心肌梗死发展，影响炎症在房颤发生后心肌重构的效果。在周边动脉疾病里，维生素D的状态影响动脉粥样硬化的发展和炎症标记物的产生，从而会导致动脉硬化，血管钙化和老化。补充维生素D应进一步考虑其他因素的影响，如磷酸盐、甲状旁腺素、肾素以及成纤维细胞生长因子23等因子的水平。本文综述了近年来维生素D缺陷对心血管疾病的发生、发展影响的研究进展。关键词：维生素D；1.维生素D的代谢和生理功能维生素D是一种脂溶性维生素，促进钙和磷在肠道的吸收。人体内的维生素D80-90%来自紫外线B波段照射皮肤合成，另有10-20%是由食物中摄取而得的。维生素D以两种主要的形式存在：维生素D2（麦角钙化醇）是由紫外线B照射麦角甾醇产生，可以作为补充或强化食品中的维生素[1]。维生素D3（胆钙化醇）是胆固醇的衍生物，是由紫外线B照射皮肤内的7-脱氢胆固醇产生[1]。维生素D3通过维生素结合蛋白（DBP）经血液运输至肝脏，在肝细胞内质网和线粒体中25－羟化酶的作用下，生成25羟维生素D3，再经血液运输至肾脏，在肾近曲小管1α-羟化酶的作用下生成活性作用最强的1,25-二羟维生素D3（1,25（OH）2D3），转运至全身各处发挥作用。维生素D受体在许多组织中都有表达包括脑、心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、胰脏β细胞、骨骼肌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、巨噬细胞和皮肤，其在这些组织中发挥多重效果，并且随着年龄的增长其表达降低。维生28 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究综述素D受体与甲状腺、类视黄醇和过氧化物酶体增殖物激活受体密切相关[2]。VitaminD是经典的钙磷调节剂，活化维生素D可影响细胞生长，增殖和凋亡，氧化应激，膜转运，基质动态平衡，细胞粘附，和免疫系统的功能，并且可以调节大量基因的和健康的衰老[3-4]。维生素D具有多种生物学效应，包括对胰岛B细胞的保护作用、缓解炎性反应、减少动脉内皮损伤等[5-7]。研究表明，VitaminD的受体（VitaminDReceptor，VDR）在人体组织内广泛表达，包括单核细胞。在糖尿病患者中，VitaminD的活化形式1,25(OH)2D3通过作用于免疫单核细胞，促进单核细胞、巨噬细胞分化，减少促炎细胞因子的释放，进而减少单核细胞浸润血管及巨噬细胞胆固醇在血管壁的沉积[8-10]。1,25(OH)2D3可以促进免疫反应从Th1(具有促进粥样硬化形成的因子分泌功能)的类型向Th2（具有抑制动脉粥样硬化形成的因子的分泌功能）的类型转换[11]。同时，1,25(OH)2D3可以改变巨噬细胞的基因表达情况，对于许多影响硬化发生过程的因子，如I型胶原，血管内皮生长因子，基质金属蛋白酶及弹性蛋白的表达具有一定的影响[12]。另外，1,25(OH)2D3作为天然的内质网应激的舒缓剂，可以诱导具有增加胆固醇摄取和储存作用的M2型巨噬细胞向具有抗硬化形成作用的M1型巨噬细胞转化，抑制构成斑块重要成分的泡沫细胞的生成[13-15]。2.维生素D与肾素-血管紧张素-醛固酮系统肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAA）维持血管阻力中起重要作用，通过血管紧张素II的合成，和细胞外液体积的平衡，以及醛固酮的释放发挥作用[16]。在对动物和人类的研究中证明，维生素D通过抑制renin基因表达[17]，降低RAA活性[18]。维生素D通过调节renin基因启动子的cis-DNA元件，调节包括renin在内的相关基因的表达[19-20]，从而下调了RAA系统。维生素D缺陷会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS），而RAS轴在房颤的病理生理机制中发挥重要作用，介导钙离子的稳定性。维生素D能结合心肌细胞，发挥抗氧化作用，降低心房ROS水平，其促进炎症，促进心律失常前结构的形成。由于维生素D具有抗氧化作用，据推测，维生素D水平可能对心房的活性氧簇（ROS）的产生的影响，并随后致心律失常基质的形成。除了这种直接的抗心率失常的机制，维生素D的负调节肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS），有助于维持血压水平，减少房颤的心房结构重构[20]。肾素表达维生素D调节是不依赖于钙代谢，骨化三醇能通过维生素D受体介导29 综述维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究的机制抑制肾素转录[16]。Ferder等认为在维生素D和肾素-血管紧张素系统（RAS）之间可能存在反馈机制，考虑到维生素D和血管紧张素II受体分布于同一组织中，RAA活性变化和活化的维生素D受体似乎成负相关，维生素D缺乏可以通过RAA的系统诱导的细胞炎症反应的活性来解释。治疗时应考虑结合RAS阻断和VDR激活[21]。维生素D过多也会引起血管和软组织钙化，钙沉积于血管平滑肌细胞可导致RAA激活[22]。3.维生素D缺乏与动脉粥样硬化维生素D经由若干途径，如抑制前列腺素和环加氧酶途径、抗炎细胞因子的上调，减少粘附分子的细胞因子诱导的表达，减少基质金属蛋白酶9，和下调RAA的[21，23]抑制炎症。维生素D缺乏刺激全身和血管炎症，使动脉粥样硬化[21]。另一方面，高血压也与维生素D缺乏有关，由于激活RAA的系统，使内皮功能障碍，在斑块形成的第一步。促炎性核因子介导KB部分血管内皮功能障碍和低维生素D水平[23]之间的关联。大量流行病学研究表明维生素D缺乏作为心血管疾病的危险[29]的标志物，促进加速动脉粥样硬化[22，24]和随后的心血管事件[23]。慢性维生素D缺乏会导致继发性甲状旁腺功能亢进，胰岛素抵抗增加，损害的β-胰细胞功能，并加重代谢综合征和糖尿病[21]的发展。维生素D调节参与胰岛素生产在胰腺的相关基因表达。维生素D也具有一些抗动脉硬化作用，抑制泡沫细胞，胆固醇摄取的形成由巨噬细胞，并且使HDL转运[25]，血清25-羟基维生素D低水平与代谢综合征高密度脂蛋白胆固醇浓度相关[26]。血管平滑肌细胞和内皮细胞表达维生素D的受体，使骨化二醇转换成骨化三醇[27]，维生素还是参与平滑肌细胞和心肌细胞的生长和增殖的调控[22，27]。维生素D抑制血管平滑肌细胞升高的钙离子转入细胞内，并增加平滑肌细胞的钙化[26]。研究表明，维生素D缺乏症与血管硬度有关，这是导致心血管发病率升高[23]和亚临床动脉粥样硬化的进展。4.维生素D缺乏与高血压维生素D水平降低会增加高血压[28]或舒张压升高的发病率[29]。临床研究证明，1,25（OH）2D3浓度和血压相关[30]。Wang等人报道高血压的发病风险和血浆25-羟基维生素D和维生素受体的基因多态性有关[31]。大鼠实验证明，诱发维生素D缺乏会导致高血压的发生和心脏扩大[43，50]。小鼠缺乏维生素D受体会增加30 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究综述肾素表达和血管紧张素II的生产，从而导致高血压和心脏肥大[32]。紫外线灯照射使维生素D的合成并具有降血压的作用[33－34]，高血压患者暴露在紫外线的照射下能显著提高了他们后3个月的25-羟基维生素D浓度水平，并维持正常血压[34]。维生素D3的补充降低高血压患者的血压水平[35]，也降低了血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ水平的甲状旁腺功能亢进的患者[36]。紫外线照射降低血管阻力，有弥漫性皮肤血管扩张和一氧化氮的释放[37]。维生素D的代谢产物降低内皮依赖性血管平滑肌收缩，影响高血压大鼠血管张力，使内皮细胞钙离子内流[38]。在体外，维生素D受体活化诱导浓度依赖性一氧化氮的产生，使血管内皮细胞的增加和提高内皮祖细胞的血管生成[39]。高血压患者的维生素D缺乏是心血管事件的双重风险，包括心肌梗塞、心绞痛，延长胸部疼痛和心电图的改变、中风、短暂脑缺血发作和心力衰竭[22]。5.维生素D缺乏与代谢综合征心血管危险因素包括高脂血症、腹部肥胖、高血压以及糖尿病等，它们常常在同一个体中出现。Asmall横断面研究[40]，包括中年男子，发现，维生素D代谢物与脂质和糖代谢和尿酸血清。血清维生素D水平与血液压力、甘油三酯和呈负相关。他汀类药物发挥有益的作用，不仅在于降低胆固醇，而且对糖尿病、骨代谢、炎症状态有作用，可能与维生素D的合成有关[41]。用于急性冠脉综合征阿托伐他汀能降低胆固醇水平，并显著增加维生素D水平，由于胆固醇和维生素D有共同的代谢途径[42]。肥胖是高血压的风险因素，高胆固醇血症、糖尿病和维生素D缺乏。除了在维生素D影响皮下脂肪，使存储较少可用成为生物活性，肥胖者可能与久坐的生活方式、户外活动不太积极等习惯有关[43]，其原因可能是维生素D合成减少。许多细胞实验和观察性研究支持维生素D在1型和2型糖尿病发病机制中的作用[44]。1型和2型糖尿病患者中出现维生素D缺乏[44]的比例较高。维生素D缺乏的2型糖尿病患者补充维生素D后，可以有效防止型2型糖尿病的发生[45]。非肥胖因素引起的1型糖尿病小鼠，可通过免疫调节，直接影响β细胞的功能[44]。包括前瞻性研究和系统回顾和荟萃分析均显示，维生素D水平与2型糖尿病事件负相关[46]。合理的机制解释是维生素D受体影响胰岛素的胰腺β细胞对胰岛素敏感性和维生素D分泌的影响，或通过维生素D对钙代谢的影响，但其因果关系尚缺乏明显的证据[46]。31 综述维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究6.维生素D缺乏与冠心病、心力衰竭对动脉冠状动脉造影正常或接近正常的患者研究显示，维生素D缺乏与冠状动脉血流变慢、内皮功能障碍和亚临床动脉粥样硬化相关[47]。维生素D水平下降与炎症、较高的冠状动脉钙化积分、血小板平均量增加、并血管硬度增加相关[48]。平均血小板体积异常升高与心血管疾病有关，其原因可能与胶原、血栓素A2的水平升高和血小板Ib和IIb/IIIa受体表达升高，使更更多的糖蛋白受体迅速聚集[48]。促炎症细胞因子释放增加的患者，维生素D缺乏增加氧化应激和使未成熟和活化的血小板从骨髓中释放出来，从而增加的平均血小板体积[48]。维生素D状态影响心梗预后，如心脏衰竭住院，反复急性心肌梗死导致死亡[49]，或经皮冠状动脉介入的再狭窄[23]。维生素D水平与冠状动脉病变患者的ST段抬高的心肌梗塞的严重程度有关[50]。另一方面，根据Gensini积分评估得分评估冠状动脉狭窄轻重与维生素D缺乏相关联[51]。多数充血性心脏衰竭的患者存在维生素D缺乏，由于减少日光照晒、不适宜户外活动、营养吸收不良和维生素D缺乏，从而导致肠道水肿、严重右心脏衰竭、肥胖和肾和肝功能衰竭等合并症的发生[52]。维生素D缺乏会导致低钙血症和继发性甲状旁腺功能亢进。血清甲状旁腺（PTH）的升高的患者更易出现性充血性心脏衰竭，其原因可能是维生素D缺乏导致局部缺血或扩张性心肌病[53]。骨质疏松症和心血管病理有着共同的背景，包括骨和受体激活剂核因子kappa-B的配体，参与破骨细胞激活和血管钙化和动脉粥样硬化;骨形态发生蛋白，参与成骨细胞分化和动脉粥样硬化病变，与年龄相关的雌激素缺乏[54]。PTH和维生素D的水平呈负相关，低钙血症骨质减少。尽管维生素D缺乏症和心脏衰竭之间的联系有争议，但在心脏衰竭的患者中，骨软化症可以补充维生素D。7.维生素D缺乏与心房颤动维生素D与房颤的发病关系一直存在争议：OzcanOU等对137例新发高血压房颤和90例无房颤患者进行研究，结果显示，维生素D缺陷是与高血压房颤相关[OR,1.68;95%CI,1.18-2.64;P=0.03][55]。ChenWR对162例中国非辨膜性顽固性房颤患者研究显示，患者维生素D水平显著低于对照组，而且与HS-CRP水平、左心房内径呈现负相关，Logistic回归分析显示，25(OH)D水平与AF相关[56]。DemirM对102例非辨膜性慢性房颤患者研究发现，25-OHD水平显著低于辨膜性房颤组和32 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究综述对照组[57]。QayyumF等报道对258例AF患者研究显示，维生素D缺陷与AF的类型和并发症无关[58]。RienstraM等报道对2930例社区志愿者研究显示，随防9.9年，425例进展为AF,COX分析显示，维生素D状态与AF事件并不相关[59]。Smith等报道对初始无AF的人群来说，高水平的维生素D对AF的发病有风险，结论认为，25[OH]D水平超过100ng/dl，使AF的发病风险升高到2.5倍。作者认为可能的机理是，高水平的维生素D能致血钙水平升高，而高钙血症能导致心律失常[60]。在这些研究中，部分研究认为维生素D缺陷与房颤的发病有关[55-57]，另有部分研究显示无相关性[58-59]。还有1篇显示维生素D升高与房颤的发病相关[60]。文献中研究的权重证据显示，维生素D缺陷与房颤的发病可能相关。引起这种结果差异的原因有一个重要的因素可能与季节相关，在苏格兰[61]和丹麦Denmark[62]大样本量人口研究表明，房颤的发病率和死亡率在冬季最高，在夏季最低，而且与室外的温度呈现负相关。而一项研究对2298例基于社区的心血管病老年人研究发现，25羟维生素D（25[OH]D）水平与日光的照射有关，它随着季节呈现正弦变化，在不同的季节，25[OH]D水平存在较大的差异，一年内25(OH)D平均浓度为25.1ng/mL(95%CI:24.7,25.5)，其中浓度峰谷差异达到9.6ng/mL(95%CI:8.5,10.7)[63]。的这种关联背后的机制尚不清楚，而阳光照射和维生素D的水平可能可能是引起维生素D缺陷与AF发病结果差异的重要因素，另外空气大气压力、温度[63-64]，和季节变化引起的呼吸道感染也可能是AF重要的致病因素[61]。8.小结与展望维持血清中维生素D的最佳水平不仅对钙稳态有重要意义，而且对心血管疾病的发病风险、血压控制、中风、代谢综合征和外周动脉疾病的发生也有重要意义。先前的研究数据支持维生素D状态与心血管疾病之间存在重要的联系，维生素D缺乏可被认为是心血管疾病的危险标志物。维生素D对心血管的影响通过降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性，降低血压值，并具有抗炎、抗增殖、抗心肌肥厚、纤维化、抗糖尿病、抗栓作用和传统心血管危险因素有利于调节。考虑到维生素D缺乏、人口老龄化和室内生活方式的等因素的存在，可能对公共卫生的影响非常重要。维生素D缺乏症是可以治疗的，而且补充是非常经济的。为了控制血压，特别是在老年人中，可以考虑维生素D与抗高血压药物联合使用，作为预防心血管疾病33 综述维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究的一种简单、廉价和重要的预防方法。从公共卫生角度看，即使是预防方面的收益微小，也非常重要。进一步的蛋白质组学和基础研究是为了确定在维生素D在心血管疾病发病中的机制研究尚深入。大型随机对照试验证实维生素D在心血管疾病中的治疗前景，但考虑内皮功能、动脉硬度程度和接受经皮冠状动脉介入治疗等因素的影响，如何建立最佳的维生素D水平与摄入量，保持心血管病患者合适的维生素D水平也具有非常重要的意义。参考文献：[1]HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed.2007Jul19;357(3):266-281.[2]AlMheidI,PatelRS,TangprichaV,etal.VitaminDandcardiovasculardisease:istheevidencesolid?EuropeanHeartJournal.2013,34(48):3691-3698.[3]ChowdhuryR,KunutsorS,VitezovaA,etal.VitaminDandriskofcausespecificdeath:systematicreviewandmeta-analysisofobservationalcohortandrandomisedinterventionstudies.BritishMedicalJournal.2014;348[4]NormanPE,PowellJT.VitaminDandcardiovasculardisease.CirculationResearch.2014,114(2):379-393[5]CHIUKC,CHUA,GOVL,etal.HypovitaminosisDisassociatedwithinsulinresistanceandbetacelldysfunction[J].AmericanJournalofClinicalNutrition,2004,79(5):820.[6]KASSIE,ADAMOPOULOSC,BASDRAEK,etal.RoleofvitaminDinatherosclerosis[J].Circulation,2013,128(23):2517.[7]ZEHNDERD,BLANDR,CHANARS,etal.Synthesisof1,25-dihydroxyvitaminD(3)byhumanendothelialcellsisregulatedbyinflammatorycytokines:anovelautocrinedeterminantofvascularcelladhesion[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN,2002,13(3):621-629.[8]KOEFFLERHP,AMATRUDAT,IKEKAWAN,etal.Inductionofmacrophagedifferentiationofhumannormalandleukemicmyeloidstemcellsby1,25-dihydroxyvitaminD3anditsfluorinatedanalogues[J].CancerResearch,1984,44(12Pt1):5624.[9]GIULIETTIA,VANETTENE,OVERBERGHL,etal.Monocytesfromtype2diabeticpatientshaveapro-inflammatoryprofile.1,25-DihydroxyvitaminD(3)worksasanti-inflammatory[J].Diabetesresearchandclinicalpractice,2007,77(1):47-57.34 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在攻读硕士学位期间公开发表的论文维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究在攻读硕士学位期间公开发表的论文在国内外刊物上发表的论文叶军,张明芝,栾正云,等.房颤患者血清25-羟基维生素D3的水平变化及临床意义.江苏医药,2017,43(9):626-628.40 维生素D及其受体基因多态性在房颤发病中变化及价值的研究致谢致谢首先向我的导师张明芝教授表示衷心的感谢，感谢张老师对本人在攻读硕士期间的的精心指导以及帮助。张老师渊博的专业知识，精益求精的工作作风，严谨的治学态度，诲人不倦的高尚师德，朴实无华的人格魅力对我影响深远，他的言传身教将使我终生受益！在此，向恩师张老师表示最真挚的谢意和祝福。感谢泰州市人民医院心内科、体检中心全体老师对我的帮助！感谢师兄师姐师弟师妹及好友们在学习和生活上对我的关心！感谢苏州大学的老师和同学们的支持！感谢所有帮助过我的人们！41 －苏州大硕士学说＾业位、丨专）！－糾？｜親Ｉ制．Ｉ