维生素d受体基因多态性与晚期肺腺癌易感性及化疗疗效的关系

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中图分类号：R734.2编号：20100148承德医学院硕士研究生毕业论文维生素D受体基因多态性与晚期肺腺癌易感性及化疗疗效的关系RelationshipofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithadvancedadenocarcinomaoflungcancersusceptibilityandsensitivitytochemotherapy研究生：唐利娟导师：杨雁鸿主任医师学科专业：肿瘤学所在系部：秦皇岛市第一医院研究起止日期：2010年9月～2013年3月论文提交日期：2013年3月-1- 承德医学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归承德医学院所有。承德医学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为承德医学院，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归承德医学院所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：导师签章：年月日承德医学院研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：导师签章：年月日-2- 维生素D受体基因多态性与晚期肺腺癌易感性及化疗敏感性关系的研究RelationshipofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithadvancedadenocarcinomaoflungcancersusceptibilityandsensitivitytochemotherapy研究生：唐利娟学号：20100148年级：2010级导师：杨雁鸿主任医师学科专业：肿瘤学所在系部：秦皇岛市第一医院研究方向：肿瘤的综合治疗研究起止日期：2010年9月～2013年3月论文提交日期：2013年3月-3- 目录中文摘要.........................................................................................1英文摘要..........................................................................................4英文缩写..........................................................................................8研究论文维生素D受体基因多态性与晚期肺腺癌易感性及化疗疗效的关系前言............................................................................................9材料与方法..............................................................................10结果.........................................................................................16附图.........................................................................................20附表.........................................................................................24讨论..........................................................................................29结论..........................................................................................35参考文献..................................................................................36综述..........................................................................................40致谢..........................................................................................59个人简历...........................................................................................60-1- 中文摘要维生素D受体基因多态性与晚期肺腺癌易感性及化疗敏感性关系的研究摘要目的：肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，也是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤，据统计肺癌的总发病数占所有恶性肿瘤的20％，死亡率约为23.8％。非小细胞肺癌(Nosmall-celllungcancer,NSCLC)是肺癌研究的重点，占所有肺癌的80％-85％，而肺腺癌是NSCLC中最常见、预后最差的类型之一，一些研究资料表明，肺腺癌发病率呈明显上升趋势，在很多国家超过了鳞癌成为最常见的肺癌组织学类型。肺癌的发生与吸烟、大气污染和某些特殊职业暴露等因素密切相关，然而这些因素不能充分解释不同国家地区和不同人群间肺癌发病率的差异，其中必然存在某些肺癌发生的易感因素，而这一易感性正是由遗传因素决定的。本研究对VDR基因Bsm1、Fok1位点多态性与晚期肺腺癌的遗传易感性以及化疗敏感性的关系进行探讨，旨在寻找出肺癌潜在危险因素，为临床探索一条新的诊治途径提供理论依据。方法：采用基于医院的病例-对照研究方法，收集172例晚期肺腺癌患者和180例健康对照个体的静脉抗凝血5ml，同时记录其病史、个人相关资料。提取外周血白细胞DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)方法对VDR基因Bsm1、Fok1位点的基因型进行检测，分析并比较两组间的基因型频率、等位基因频率和单倍体型分布以及相关临床资料。其中52例患者完成GP/GC方案：吉西他滨（GEM）+顺铂(DDP)/卡铂(CBP)化疗2周期后复查CT，根据RECIST1.0标准判定疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)及疾病进展(PD)。计算CR+PR为有效率，SD+PD为无效率。对照组进行Hardy-Weinberg遗传平衡分析。统计分析采用SPSS13.0版软件包进行，P<0.05被认为有统计学意义。病例组与对照组的基因型、等位基因型分布比较以及不同基-2- 中文摘要2因型之间的化疗疗效的差异采用χ检验。VDR基因多态性位点连锁不平衡及单体型频率分析采用SHEsis软件。以比值比(oddsratio,OR)及95%可信区间(confidenceinterval,CI)表示相对危险程度。结果：1.健康对照组中的VDR基因2个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。2.晚期肺腺癌组VDR基因Bsm1位点基因型分布有统计学意义2(χ=8.111,P<0.05)及等位基因分布与健康对照组比较有统计学意义2(χ=6.492,P<0.05)。Fok1位点基因型分布与健康对照组比较有统计学意2义(χ=10.379,P<0.05)，其等位基因分布与健康对照组比较无统计学意义(P>0.05)。3.按是否吸烟分层分析：吸烟人群中，Bsm1、Fok1位点在病例组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。非吸烟人群中，Bsm1位点基因型2分布有统计学意义(χ=7.965,P<0.05)及等位基因分布与健康对照组比较2有统计学意义(χ=7.947,P<0.05)。Fok1位点基因型分布与健康对照组比较无统计学意义(P>0.05)，其等位基因分布与健康对照组比较无统计学意义(P>0.05)。4.多因素回归分析结果显示性别是晚期肺腺癌发生的主要危险因素。其中男性发生晚期肺腺癌的危险是女性的0.492倍(OR=0.492,95%CI:0.283-0.889)。5.晚期肺腺癌组的吸烟比例(49.4%)与健康对照组(47.8%)，无明显差异。6.VDR基因Bsm1和Fok1之间不存在明显的连锁不平衡。4种单倍体型出现在对照组与病例组无统计学意义(P>0.05)。7.VDR基因2个位点多态性与GP/GC方案化疗敏感性之间无相关(P>0.05)。结论：1.VDR基因Bsm1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险相关联。Bsm1位点B等位基因可能增加肺腺癌的发病风险。2.VDR基因Fok1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险可能关联。3.本研究显示女性比男性发生晚期肺腺癌的危险性高。-3- 中文摘要4.VDR基因Bsm1、Fok1之间不存在明显的连锁不平衡。5.VDR基因Bsm1、Fok1位点多态性与化疗敏感性之间无相关。6.本研究显示吸烟与晚期肺腺癌发病相关性不显著。关键词：维生素D受体；肺腺癌；基因多态性；易感性；化疗敏感性-4- 英文摘要RelationshipbetweenofpolymorphismsofvitaminDreceptorgeneandsusceptibilityandsensitivitytochemotherapyofadvancedadenocarcinomaoflungABSTRACTObjective:Lungcancerisamalignanttumor,Itsmorbidityandmortalityshowingarisingtrend,inwhichnon-smallcelllungcancer(NSCLC)accountsfor80%to85%,itssurvivalrateislessthan15%.Lungcanceriscloselyrelatedtosmoking,airpollutionandsomeoccupationalexposurewhichcan'tfullyexplainthedifferencesofincidencebetweendifferentcountriesanddifferentgroups.Therearesomesusceptiblefactorsofsomeindividualstolungcancerresultfromgeneticmutation,deletion,genepolymorphismandothergeneticfactors.Thereisimportantsignificancetoinvestigatethemolecularmechanismsofthegeneticvariationonlungcancer.TheresearchistoinvestigatetherelationshipbetweenthepolymorphismofVDRgene(includedBsm1,Fok1)andgeneticsusceptibilityandchemotherapysensitivityofadvancedadenocarcinomaoflungtoprovideatheoreticalbasisfortheclinicaldiagnosisandtreatmentpathway.Methods：Thisisacase-controlresearch,collect5mlveinanticoagulantbloodof172patientswithadvancedadenocarcinomaoflung(Thecasegroup)and180healthycases(thecontrolgroup),andrecordtheirmedicalhistoryandpersonalinformation.ExtracttheperipheralbloodleukocyteDNA.ThegenotypeofVDRgeneBsm1,Fok1lociweredetectedusingpolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP).Comparethegenefrequency,allelefrequency,haplotypedistributionandotherrelevantclinicaldatabetweenthetwogroups.52casesofpatientsaccomplish2cyclesofGP/GCprogramchemotherapyandcheckCT,thenassesstheefficacyaccordingto-5- 英文摘要RECISTcriteriatodividetheminto：completeremission(CR),partialremission(PR),stabilitydisease(SD),andprogressionofdisease(PD).SetCR+PRfortheeffective,etSD+PDfortheineffective.UseHardy-Weinbergbalanceanalyzethedataincontrolgroup.UseSPSSversion13.0softwarepackage,thereissignificantdifferenceifP<0.05.Compareofdistributionofgenotypesandallelebetweenthecasegroupandcontrolgroupanddifferentgenetypebetweenthechemotherapyefficacyusingchi-squaretest,LinkagedisequilibriumanalysisandhaploidfrequencyusingtheSHEsissoftware.Therelativedegreeofriskwasexpressedby95%confidenceintervalindicate.Result:1.Theproportionofsmokinginadvancedadenocarcinomaoflunggroup(49.4%)andhealthycontrols(47.8%),nosignificantdifference.2.GenotypeofVDRgenein2healthycontrolgroupof2locidistributionwasinconsistentwithHardy-Weinbergequilibrium(P>0.05).3.ThereissignificantdifferenceingenotypedistributionadvancedlungadenocarcinomagroupVDRgeneBsm1genotypedistributionwas2statisticallysignificant(χ=8.111,P<0.05)andalleledistributioncompared2withthehealthycontrolgroupwasstatisticallysignificant(χ=6.492,P<0.05).TheFok1genotypedistributionincomparisonwithhealthycontrol2groupwasstatisticallysignificant(χ=10.379,P<0.05),anditsalleledistributioniscomparedwiththehealthycontrolgrouphadnostatisticalsignificance(P>0.05).4.Accordingtowhethersmokingstratifiedanalysis:smokinggroups,Bsm1,Fok1lociwerenotsignificantinthecasegroupandthecontrolgroup(P>0.05).Non-smokers,Bsm1genotypedistributionwasstatisticallysignificantandalleledistributioncomparedwiththehealthycontrolgroup2wasstatisticallysignificant(χ=7.947,P<0.05).TheFok1genotypedistributionincomparisonwithhealthycontrolgrouphadnostatisticalsignificance(P>0.05),anditsalleledistributioniscomparedwiththehealthycontrolgrouphadnostatisticalsignificance.-6- 英文摘要5.Multipleregressionanalysisshowedthatsexisamajorriskfactorfortheoccurrenceofadvancedlungadenocarcinoma.Theriskofmaleoccurrenceofadvancedlungadenocarcinomaisfeminine0.492times(OR=0.492,95%CI:0.283-0.889).6.AmongtheVDRgenesBsm1andFok1doesnotexistsignificantlinkagedisequilibrium.4kindsofhaplotypesinpatientgroupandcontrolgrouphadnostatisticalsignificance(P>0.05).7.BetweenVDRgene2polymorphismandthesensitivitytoGP/GCchemotherapywithoutcorrelation(P>0.05).Conclusion：1.TheVDRassociatedgeneBsm1polymorphismandadvancedlungadenocarcinomarisk.TheBsm1Ballelemayincreasetheriskoflungcancer.2.TheVDRgeneFok1polymorphismandadvancedlungadenocarcinomariskmaybeassociatedwith.3.Womenarethemainriskfactorsforadvancedlungadenocarcinoma.4.BetweentheVDRgeneBsm1,Fok1doesnotexistsignificantlinkagedisequilibrium.5.BetweentheVDRgeneBsm1,Fok1polymorphismandchemosensitivityofnocorrelation.6.Smokingmaynotincreasetheriskofadvancedlungadenocarcinoma.Keywords：VitaminDreceptor;Non-smallcelllungcancer;Genepolymorphism;Susceptibility;Chemotherapysensitivity-7- 英文缩略词表英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称NSCLCnon-smallcelllungcancer非小细胞肺癌VDRvitaminDreceptor维生素D受体PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应RFLPrestrietionfragmentlength限制性片段长度多态polymorphism性ORoddsratios比值比CIconfidenceIntervals可信区间SNPssinglenucleotidepolymorphisms单核苷酸多态性CRcompleteresponse完全缓解PRpartialresponse部分缓解SDstabledisease稳定PDprogressivedisease进展ECOGEasternCooperativeOncology美国东部肿瘤协作组GroupLDLinkagedisequilibrium连锁不平衡EDTAethylenediaminetetraaceticacid已二胺四乙酸SPSSSolutionsStatisticalPackagefor社会科学统计软件包theSocialSciencesTAETris/borateelectrophoresisTris/硼酸电泳缓冲液H-WHardy-WeinbergequilibriumHardy-Weinberg平衡RECISTResponseEvaluationCriteriain实体瘤疗效评价标准SolidTumors-8- 研究论文维生素D受体基因多态性与晚期非小细胞肺癌易感性及化疗敏感性的关系研究前言肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，据2012年美国癌症学会(AmericanCancerSociety)的统计结果显示，虽然肺癌的总死亡率略有下降，但仍旧是美国全国和各州所有癌症中死亡率最高的肿瘤，且不论性别，肺癌已成为男女共同的头号杀手。我国肺癌的发病率和死亡率近年来呈逐渐上升趋势，尤其是女性肺癌的发病率已超过部分欧洲国家。其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)在临床中占80%-85%，大部分患者确诊时已属晚期，无法手术切除，因此，化疗仍是晚期NSCLC重要的治疗手段。目前标准的一线化疗方案是以铂类药物为基础的两药联合方案，吉西他滨是一种脱氧嘧啶核苷的类似物，是细胞周期特异性药物，作用于S期，可阻止G1期向S期转化，使DNA断裂，细胞凋亡。它对多种实体肿瘤有良好的抗肿瘤活性，对NSCLC疗效尤为显著。然而不同个体对化疗药物敏感性差异很大，这可能与不同个体的遗传易感性相关。因此对晚期NSCLC化疗敏感性的研究可为化疗药物选择及个体化治疗提供理论依据。病因学研究已证实，吸烟、环境中的化学致癌物是肺癌发生的重要危险因素，然而并非这些因素暴露者都会罹患肺癌，这说明不同个体对肺癌的易感性不同，因此寻找易感基因，对于肺癌的早期诊治具有重要意义。VDR是介导维生素D发挥生物效应的核内生物大分子，属于类固醇激素/甲状腺受体超家族的成员。VDR在人体各组织细胞中广泛存在，它除了具有经典的钙磷代谢调节作用外，还能发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化成熟等抗肿瘤相关的生物学效应。许多研究表明VDR基因多态性与部分肿瘤的发生发展密切相关，但与肺癌的相关性研究还比较少。本课题从分子水平对VDR基因多态性与晚期非小细胞肺癌遗传易感性及化疗敏感性的关系进行研究，以期为晚期非小细胞肺癌的发病机制提供线索，为化疗方案的选择提供依据。-9- 研究论文材料与方法1.主要实验仪器及设备4℃离心机德国Thermo公司SK-1型快速混匀器（涡旋）国华仪器厂制造MastercyclergradientPCR仪德国Eppendorf公司Powerpac电泳仪美国BIO-RAD公司电泳槽北京六一仪器厂WD-9403F紫外分光光度仪北京六一仪器厂微量取液器德国Eppendorf公司SartoriusBT125D电子天平德国赛多利斯天平有限公司-70℃超低温冰箱日本Sanyo公司恒温水浴箱科伟永兴仪器有限公司2.主要实验试剂全血基因组DNA提取试剂盒天根生化科技有限公司异丙醇北京化工厂无水乙醇北京化工厂5×GreenGoTaq®ReactionBufferPromegaTaq-DNA聚合酶PromegaDntpPromegaTrisSolarbioEDTA天津天大化工实验厂硼酸天津天大化工实验厂琼脂糖西班牙Biowest溴化乙锭SigmaLodingBufferSolarbio-10- 研究论文MarkerⅠDNAladderSolarbioDL2000Marker天根生化科技有限公司限制性内切酶BiolabsBsm1BiolabsFok1Biolabs3.研究对象本研究病例组为晚期肺腺癌患者(均为ⅢB期/Ⅳ期)172例，对照组为健康个体180例。病例组来源于2010年10月至2012年10月，秦皇岛市第一医院肿瘤科住院患者，所有病例均有病理学诊断依据，除外其它癌症患者及合并糖尿病、心血管疾病等。对照组为同期随机在秦皇岛市第一医院体检中心进行体检的健康人群。病例组及健康对照组均来自秦皇岛市及周边的中国汉族人。获取研究对象的一般信息，包括年龄、性别和吸烟情况，定义为每天吸卷烟1支以上，连续或累计6个月为吸烟个体。4.外周血白细胞DNA的提取在所有研究对象知情同意下，采集清晨空腹外周肘静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，置于-70℃超低温冰箱保存。4.1实验采用全血基因组DNA提取试剂盒，具体提取方法如下：(1)从-70℃冰箱中取出冷冻抗凝血室温下自溶，取300μl置于1.5ml离心管中。(2)加入750μl细胞裂解液CL，颠倒混匀5次。(3)12,000rpm离心1min，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2min，确保沉淀在管中。(4)将缓冲液FG150μl与蛋白酶K1.5μl混合，备用。(5)向离心管中加入缓冲液FG与蛋白酶K混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。(6)65℃水浴10min，期间颠倒混匀数次。(7)加入150μl异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。(8)12,000rpm离心5min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水-11- 研究论文纸上，确保沉淀在管中。(9)加150μl70%乙醇，涡旋振荡5s，12,000rpm离心2min，倒弃上清。(10)重复步骤9。(11)将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5min，确保沉淀在管中。(12)空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净。(13)加入200μl缓冲液TB，低速涡旋5s，65℃加热40min溶解DNA，期间轻弹数次助溶。(14)室温过夜，置于-20℃下保存备用。4.2DNA提取产物检测配制5×TAE缓冲液:Tris27g，硼酸13.75g，0.5mol/LEDTA（PH=8）10ml，加去离子水至500ml，室温备用。配制2%琼脂糖:称取2.0g的琼脂糖，加入100ml5×TAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热2min，待溶液冷却至60℃时，加入10mg/ml溴化乙锭1.5μl，充分混匀后将琼脂糖倒入插有梳子的模具槽内，凝胶厚度约5mm。室温静置30min，待完全凝固后拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，取5μl样本DNA与5μlLoadingbuffer混合均匀，点样于2%的琼脂糖凝胶中，110v恒压下电泳分离20min，利用紫外分析仪观察有无特异性条带。5.维生素D受体基因多态性检测5.1引物序列引物设计参照文献由北京鼎国昌盛生物公司合成。维生素D受体基因Bsml位点、Fok1位点引物序列见表5-1表5-1Bsml位点、Fok1位点引物序列位点上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）大小Bsmlggcaacctgaagggagacgtactctttggacctcatcaccgac461bpFok1ctccgaaggcactgtgctcaggcctatggaaacaccttgcttcttctccctc265bp5.2PCR扩增5.2.1Bsml位点PCR反应体系和反应条件见表5-2-1-1、表5-2-1-2-12- 研究论文5.2.2Fok1位点反应体系和反应条件见表5-2-2-1、表5-2-2-2表5-2-1-1Bsml位点PCR反应体系混合物体积基因组DNA3μl5×GreenGoTaq®ReactionBuffer5μldNTP0.5μl上游引物1μl下游引物1μlTaqDNA聚合酶0.5μl去离子水9μl总计20μl表5-2-1-2Bsml位点PCR反应条件条件温度时间循环数预变性95℃5min变性94℃40s退火59℃40s30个延伸72℃40s再延伸72℃5min表5-2-2-1Fok1位点反应体系混合物体积基因组DNA2μl5×GreenGoTaq®ReactionBuffer5μldNTP0.5μl上游引物1μl下游引物1μlTaqDNA聚合酶0.5μl去离子水15μl总计25μl-13- 研究论文表5-2-2-2Fok1位点反应条件条件温度时间循环数预变性95℃5min变性94℃30s退火52℃30s30个延伸72℃1min再延伸72℃10min5.3PCR产物的电泳检测点样于2%的琼脂糖凝胶中，110v恒压下电泳分离30min，利用紫外分析仪观察PCR产物，参照正常标准DNA片段确定片段长度是否正确，及有无特异性条带。5.4对PCR反应产物进行RELP分型表5-4-1Bsm1位点酶切体系及条件PCR反应产物10μl10×buffer2μlBSA0.2μlBsm1限制性内切酶0.5μl补去离子水至20μl酶切条件：65℃恒温箱16小时表5-4-2Fok1位点酶切体系及条件PCR反应产物10μl10Xbuffer2μlBSA0.2μlFok1限制性内切酶0.5μl补去离子水至20μl-14- 研究论文酶切条件：37℃恒温箱16小时5.5酶切产物结果判定取酶切产物10μl于2%琼脂糖凝胶电泳分离，90v恒压电泳50min后置紫外分析仪下观察，照相，记录结果。5.6DNA序列测定根据酶切结果选取各个位点不同基因型的PCR产物进行测序(送北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，以验证扩增产物为目的片段并且确定基因型。6.化疗方案及疗效评价6.1化疗方案172例晚期肺腺癌患者，共52例接受并完成GP/GC方案化疗2周期，52例患者均经CT扫描证实具有可测量的肿瘤病灶，化疗前患者血常规肝肾功能均正常，心电图无明显异常，ECOG评分≤2，预期生存期≥3个月，排除有严重并发症不能完成规定治疗者。具体用药为：GEM221000mg/m，第1、8天；DDP75mg/m，第1天，或CBP曲线下面积(AUC)等于5～6，第1天；21天为1个周期，所有患者均为初治，均为单独接受化疗(排除同时放化联合治疗者)。6.2化疗疗效评价2个周期后复查CT，参照实体瘤RECIST1.0疗效评定标准进行近期疗效评价。完全缓解(completeresponse,CR)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常,至少维持4周。部分缓解(partialresponse,PR)：靶病灶最大径之和减少≥30％以上，至少维持4周。稳定(stabledisease,SD)：靶病灶最大径之和缩小未达到PR，或增大未达PD。进展(progressiondisease,PD)：靶病灶最大径之和至少增加≥20％及其绝对值增加5mm或出现新病灶。所有患者评估时间一致，计算CR+PR为有效率，为化疗敏感，SD+PD为无效率，则对化疗不敏感。7．统计学分析-15- 研究论文数据统计分析采用SPSS13.0版软件包进行，P<0.05认为有统计学2意义。比较各位点基因型频率的观察值与预期值并进行χ检验行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组与对照组的基因型、等位基因型分布2比较均采用χ检验，以比值比(oddsratio,OR)和95%可信区间(confidenceinterval,CI)表示相对危险度。连锁不平衡分析及单倍体型分析采用2SHEsis在线软件。用χ检验来检测不同临床特征患者间化疗有效率的差异及在不同基因型之间的差异。结果1.两组研究对象的一般特征(表1)1.1病例组共收集晚期肺腺癌患者172例，男性82例，女性90例，平均年龄为64.3±11.3岁；对照组180例，男性85例，女性95例，平均年龄为63.0±10.8岁；病例组与对照组间的性别、年龄构成比均无显著差异(P>0.05)。1.2晚期肺腺癌患者组中吸烟个体比例为49.4%；健康对照组为47.8%；病例组与健康对照组无显著性差异，无统计学意义（P=0.768，>0.05）。2.VDR基因2个位点基因分型结果2.1Bsm1位点基因分型结果VDR基因的第8内含子位点多态性对应Bsml限制性酶切位点，为碱基A→G突变。A等位基因纯合子表现为461bp一个条带，命名为BB基因型；G等位基因纯合子表现为258bp和203bp两个条带，命名为bb基因型；杂合子状显示为461bp，258bp，和203bp三个条带，命名为Bb基因型(图1)。A→G突变进一步经PCR产物测序证实(图2、图3、图4)。2.2Fok1位点基因分型结果VDR基因的第2外显子位点多态性对应Fok1限制性酶切位点，为碱基T→C的突变。T等位基因纯合子表现为265bp一个条带，命名为FF基因型；C等位基因纯合子显示为207bp和60bp两个条带，命名为-16- 研究论文ff基因型；杂合子显示为265bp，207bp和60bp三个条带，命名为Ff基因型(图5)。T→C突变进一步经PCR产物测序证实(图6、图7、图8)。3.Hardy-Weinberg平衡检验2将对照组中2个位点基因型进行遗传平衡检验。χ检验结果实际值与理论值无显著性差异(P>0.05)，VDR基因Bsml、Fok1位点符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。表明研究对象的选择无遗传学偏差，具有群体代表性(表2)。4.不同人群病例组与对照组VDR基因2个位点基因型及等位基因的分布4.1病例组与对照组中VDR基因2个位点基因型及等位基因的频率分布(表3)Bsm1位点，172例晚期肺腺癌患者中，BB、Bb和bb基因型分别为5例、42例和125例，两种基因型分布频率分别为2.9%、24.4%和72.7%；180例健康对照中，Bb和bb基因型分别为32例、148例，两2种基因型分布频率分别为17.8%、82.2%。经χ检验BB、Bb和bb基因2型在对照组和病例组中分布有统计学意义(χ=8.111.,P<0.05)。b等位基因频率在病例组和对照组中分别是84.9%和91.1%；B等位基因频率在病例组和对照组中分别是15.1%和8.9%。B与b等位基因在两组间差异有2统计学意义(χ=6.492,P<0.05)。Fok1位点，172例患者中，FF、Ff、ff基因型分别为32例、105例、35例，3种基因型分布频率分别为18.6%、61.0%、20.4%；180例健康对照中，FF、Ff、ff基因型分别为48例、79例、53例，3种基因型分布频率分别为26.7%、43.9%、29.4%。三组间基因型分布有统计学意义2(χ=10.379,P<0.05)。f等位基因频率在病例组和对照组中分别是50.9%和51.4%；F等位基因频率在病例组和对照组中分别是49.1%和48.6%。2F与f等位基因在两组间的差异无统计学意义(χ=0.019,P>0.05)。4.2按照吸烟进行分层4.2.1吸烟人群中病例组与对照组VDR基因2个位点基因型及等位基因的频率分布(表4)Bsm1位点，BB、Bb和bb基因型在病例组中的频率分别为3.5%、-17- 研究论文223.5%和73.0%；在对照组中分别为0%、24.1%、75.9%。经χ检验后两2组基因型频率分布差异无统计学意义(χ=3.127,P>0.05)。两组的B、b等2位基因频率的差异无统计学意义(χ=0.758,P>0.05)。Fok1位点，FF、Ff和ff基因型在病例组中的频率分别为16.5%、264.7%、18.8%；在对照组中分别为23.0%、48.3%、28.7%。经χ检验后2两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ=4.754,P>0.05)。两组的F、f2等位基因频率比较差异无统计学意义(χ=0.099,P>0.05)。4.2.2非吸烟人群中病例组与对照组VDR基因2个位点基因型及等位基因频率分布(表5)Bsm1位点，BB、Bb、bb基因型在病例组中的频率分别为2.2%、225.3%、72.4%；在对照组中分别为0%、11.8%、88.2%。经χ检验后两2组基因型频率分布差异有统计学意义(χ=7.965,P<0.05)。两组的B、b等2位基因频率比较差异有统计学意义(χ=7.947,P<0.05)。Fok1位点，FF、Ff和ff基因型在病例组中的频率分别为20.7%、257.5%、21.8%；在对照组中分别为30.1%、39.8%、30.1%。经χ检验后2两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ=5.646,P>0.05)。两组的F、f2等位基因频率比较差异无统计学意义(χ=0.012,P>0.05)。5.晚期肺腺癌相关危险因素的多因素Logistic回归分析5.1晚期肺腺癌相关危险因素的多因素Logistic回归分析变量赋值(表6)为探讨晚期肺腺癌的危险因素，选用非条件Logistic回归，以是否发生肺癌为因变量，选择年龄、性别、吸烟、Bsm1、Fok1的基因型作为自变量，运用逐步法做Logistic回归分析。5.2晚期肺腺癌相关危险因素的多因素Logistic逐步回归分析结果(表7)通过建立多因素非条件Logistic回归模型，采用逐步回归的方法，筛选与肺癌有关的危险因素，P<0.10，有统计学意义。最后进入回归模型的危险因素是性别、吸烟。其中男性发生晚期肺腺癌的危险是女性的0.492倍(OR=0.492,95%CI:0.283-0.889)；吸烟者发生晚期肺腺癌的危险是非吸烟者的1.01倍(OR=1.01,95%CI:0.568-2.145)。提示女性是晚期肺腺癌发生的主要危险因素。-18- 研究论文6.VDR基因多态性的单倍体分析6.1VDR基因2个位点间连锁不平衡检验(表8)利用SHEsis软件通过对VDR基因2个位点多态性进行连锁不平衡分析，结果显示Bsm1、Fok1之间不存在明显的连锁不平衡。6.2VDR基因单体型与晚期肺腺癌发病的易感性(表9)对Bsm1及Fok12个位点进行单体型分析。从理论上讲，2个多态2位点可形成2=4种单体型，分别为:bf、bF、Bf、BF型。表10结果显示:4种单体型在病例组及对照组频率分布分别为0.432%、0.468%;0.417%、0.443%;0.077%、0.046%;0.074%、0.043%。各单倍体型在对照组与病例组，差异无统计学意义(P>0.05)。7.VDR基因多态性与化疗敏感性的关系7.1化疗效果(表10)52例患者接受并完成GP/GC方案化疗2个周期，其中17例(32.7%)PR；24例(46.2%)SD；10例(19.2%)PD；1例CR(1.9%)。总体化疗有效率(CR+PR)为34.6%；疾病控制率(CR+PR+SD)为80.8%。按WHO关于不良反应的评价标准，52例患者的化疗毒性主要表现为Ⅱ度以下的骨髓抑制、恶心/呕吐、脱发及轻度肝脏损害。根据不同性别、年龄、吸烟状况及临床分期化疗有效率无显著性差异(P>0.05)。7.2基因多态性与化疗结果(表11)化疗有效组Bsm1位点BB、Bb、bb基因型分布频率分别为0%、291.3%、8.7%；无效组分别为0%、94.7%、5.3%。经χ检验后两组基因2型频率分布差异无统计学意义(χ=0.569,P>0.05)。化疗有效组Fok1位点FF、Ff、ff基因型分布频率分别为43.0%、252.0%、5%；无效组分别为41.9%、50.0%，8.1%。经χ检验后两组基2因型频率分布差异无统计学意义(χ=0.232,P>0.05)。-19- 研究论文附图Fig.1ThegenotypeanalysisofSNPVDR-Bsm1byPCR-RFLPmethodLane1:PCRproduct;Lane2:BBhomozygote;Lane3:Bbheterozygote;Lane4:bbheterozygote;M:MarkerFig.2SequencingofVDR-Bsm1siteBBgenotype-20- 研究论文Fig.3SequencingofVDR-Bsm1siteBbgenotypeFig.4SequencingofVDR-Bsm1sitebbgenotype-21- 研究论文Fig.5ThegenotypeanalysisofSNPVDR-Fok1byPCR-RFLPmethodLane1:PCRproduct;Lane2:FFhomozygote;Lane3:Ffheterozygote;Lane4:ffhomozygote;M:MarkerFig.6SequencingofVDR-Fok1siteffgenotype-22- 研究论文Fig.7SequencingofVDR-Fok1siteFfgenotypeFig.8SequencingofVDR-Fok1siteFFgenotype-23- 研究论文附表Table1Basicinformationofreseachingobjects2GroupPatientsn(%)Controlsn(%)χPvalueGender0.0070.932Male82(47.7%)85(47.2%)Female90(52.3%)95(52.8%)Age0.9331.000≤60years69(40.1%)73(40.6%)>60years103(59.9%)107(59.4%)Smokingstatus0.0410.839Smoker85(49.4%)87(48.3%)Non-smoker87(50.6%)93(51.7%)Table2Hardy-Weinberganalysisofgenotype2observedvalueexpectedvalueχPvaluen(%)n(%)BB0(0%)0.5(0.3%)0.1330.677Bb32(17.8%)31.5(17.5%)Bsm1bb148(82.2%)148(82.2%)B32(8.9%)32.8(9.1%)b328(91.1%)327.2(90.9%)FF48(26.7%)45.4(25.2%)0.4520.917Ff79(43.9%)77.9(43.3%)Fok1ff53(29.4%)56.7(31.5%)F175(48.6%)88.0(48.9%)f185(51.4%)92.0(51.1%)-24- 研究论文Table3ThefrequenciesofVDRgenetypesandallelesinpatientgroupandcontrolgroup2Patientsn(%)Controlsn(%)χPvalueBB5(2.9%)0(0%)8.1110.017Bsm1Bb42(24.4%)32(17.8%)bb125(72.7%)148(82.2%)B52(15.1%)32(8.9%)6.4920.011b292(84.9%)328(91.1%)FF32(18.6%)48(26.7%)10.3790.006Fok1Ff105(61.0%)79(43.9%)ff35(20.4%)53(29.4%)F169(49.1%)175(48.6%)0.0190.891f175(50.9%)185(51.4%)Table4Thecomparisonofgenetypesandallelesbeweenpatientgroupandcontrolgroupinsmokers2Patientsn(%)ControlsχPOR95%CIn(%)BB3(3.5%)0(0%)3.1270.2090.2860.117-0.383Bsm1Bb20(23.5%)21(24,1%)1bb62(73%)66(75.9%)B26(15.3%)21(12.1%)0.7580.3840.2980.238-0.434b144(84.7%)153(87.9%)1FF14(16.5%)20(23.0%)4.7540.0930.3120.092-0.736Fok1Ff55(64.7%)42(48.3%)1ff16(18.8)25(28.7%)F83(48.8%)62(40.3%)2.3970.1220.1230.075-0.146f87(51.2%)92(59.7%)1-25- 研究论文Table5Thecomparisonofgenetypesandallelesbeweenpatientgroupandcontrolgroupinnon-smokers2PatientsControlsχPOR95%CIn(%)n(%)BB2(2.3%)0(0%)7.9650.0190.2190.014-0.305Bsm1Bb22(25.3%)11(11.8%)1bb63(72.4%)82(88.2%)B26(14.9%)11(5.9%)7.9470.0050.1470.004-0.327b148(85.1%)175(94.1%)1FF18(20.7%)28(30.1%)5.6460.0590.4720.059-0.915Fok1Ff50(57.5%)37(39.8%)1ff19(21.8%)28(30.1%)F86(49.4%)93(50.0%)0.0120.9130.9010.499-0.916f88(50.6%)93(50.0%)1Table6AssignmentwayofthemainriskfactorsforadenocarcinomaoflungFactorsVariablenameAssignmentinstructionsAgeX1＜60=1＞60=2GenderX2Female=0Male=1SmokerX3Non-smoker=0Smoker=1Bsm1X4BB=0Bb=1bb=2Fok1X5FF=0Ff=1ff=2Table7Logisticregressionanalysisofriskfactorsforadenocarcinomaoflung2RegressionStandardWaldχPOR95%CIcoefficienterrorGender-0.4850.3954.5170.0250.4920.283-0.889Smoker0.5220.5747.6470.0501.010.568-2.145-26- 研究论文Table8PairwiselinkagedisequilibriumresultofVDR2D’rBsm1-Fok10.2310.000Table9Four-locushaplotypeanalysisfortransmissiondisequilibriumtest2HaplotylePatients(n%)Controls(n%)χPOR95%CIbf148.26(0.432)168.48(0.4680.1340.7160.9310.632-1.371)bF143.45(0.417)159.48(0.4430.3420.2140.4320.169-0.764)BF26.49(0.077)16.56(0.046)2.1570.1411.3130.913-1.888Bf25.46(0.074)15.48(0.043)8.2120.0610.1200.021-0.673Table11Distributionsofselectvariablesinsubjectsandtheirassociationswithchemotherapyresponse2VariableNumber(%)CR+PR(%)SD+PD(%)χPGender1.9200.266Male28(53.8%)10(55.6%)18(52.9%)Female24(46.2%)8(44.4%）16(47.1%）Age3.1910.339≤60years24(46.2%)10(55.6%)14(41.2%)>60years28(53.8%)8(44.4%)20(58.8%)Smokingstatus0.7870.407Smoker27(51.9%)12(66.7%)15(44.1%)Non-smoker25(48.1%)6(33.3%)19(55.9%)-27- 研究论文Table12FrequencydistributionsoftheBsm1、Fok1polymorphismsandtheirassociationswithchemotherapyresponse2GenotypeCR+PR(%)SD+PD(%)χPOR95%CIbb6(33.3%)5(14.7%)0.450.4980.4290.036-5.12Bsm196Bb12(66.7%)29(85.3%)1ff4(22.2%)9(26.5%)0.070.7891.1820.347-4.0129Fok1Ff6(33.3%)15(44.1%)1FF8(44.5%)10(29.4%)-28- 研究论文讨论肺癌是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，近年来，肺癌的发病率及死亡率呈逐年上升的趋势。晚期非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）患者失去手术机会，化疗在NSCLC的治疗中占重要地位。以铂类为基础的化疗方案是治疗NSCLC标准的一线化疗方案。[1]肺癌的发生与环境因素、遗传因素及它们的相互作用有关。肺癌患者中有10%～15%左右不能归因于吸烟的影响，非吸烟肺癌在病因与发病机制上不同于吸烟导致的肺癌，而且近年来研究亦发现女性肺癌不同于[2]男性肺癌，西方女性肺癌发病率明显上升；男性肺癌呈明显下降趋势。目前所知与女性或非吸烟肺癌发病密切相关的因素大多来自传统的宏观流行病学调查结果，如肿瘤家族史、职业暴露史、既往呼吸疾病史、室外空气污染、饮食、饮水以及室内环境污染，包括做饭油烟、中国北[3-5]方农村地区煤火取暖和氡暴露等，而在个体遗传易感性方面知之甚少。NSCLC在临床中占到80％-85％，大部分NSCLC患者就诊时已属晚期，即临床分期为ⅢB～Ⅳ期，失去了手术机会，中位生存期仅为8～10月，5年生存率低于15%，而化疗是治疗晚期NSCLC的主要方法。循证医学研究证实，NSCLC的化疗以吉西他滨、培美曲塞、紫杉类、[6]长春瑞滨或多西紫杉醇联合铂类。含铂方案优于不含铂方案，然而临床资料显示，即使是采用相同化疗方案和相同药物剂量，化疗效果也因人而异，这种对药物敏感性的差异在很大程度上是由个体遗传因素决定的。遗传变异导致了个体对化疗药物反应不一，研究肿瘤化疗敏感性可以为个体化治疗提供科学依据。1、维生素D、VDR与肺癌维生素D（VitD）是一种脂溶性开环甾类化合物。可由人体表皮和真皮内含有的7-脱氢胆固醇经日光中紫外线照射转变而成及饮食摄入。VitD存在两种主要形式：麦角骨化醇(ergocalcifeml,D2)与胆骨化醇(cholecalcifeml,D3)。D2可由强化乳制品中摄取，而D3需要紫外线β在表[7]皮经7-去氢胆固醇异构化。异构化的D3进入血液循环结合VitD结合蛋白或白蛋白后被转运至肝脏，经27羟化酶(cytochromeP450family27-29- 研究论文subfamilyApolypeptide1,CYP27AI)转化为骨化二醇[calcifedi0l,25(OH)D3]，之后25(OH)D3，再次进入血液循环,至肾脏近曲小管经1-ɑ羟化酶(cytochromeP450family27subfamilyBpolypeptidel,CYP27BI)转化为骨化三醇[calcitriol,1,25(OH),D3]——活化VitD。1,25(OH)2D3，通过结合VDR发挥生物活性。人类VDR蛋白是一种含有427个氨基酸的多肽，其中包含有DNA结合域、配体结合域及活化域：VDR蛋白含有两个锌指结构以结合DNA，同时位于C’端配体结合域同l,25(OH)2D3,结合后发生形变并同转录因子发生反应。活化VDR与维甲类x受体(retinoidXreceptor，RXR)形成异质二聚体,后者移入细胞核并且与VitD靶基因的启动子区域结合。1,25(OH)2D3在血浆中的半衰期为15h。24羟化酶(cytochromeP450family24subfamilyApolypeptide1,CYP24AI)可分别将25(OH)D3及1,25(OH)2D3分解为24,25(OH)2D3及1,24,25(OH)2D3。[8]后两者为水溶性且呈失活状态。研究发现VDR是一种激素依赖性转录调节因子，当游离的1,25(OH)2D3弥散进入细胞后，转移至细胞核内，与VDR结合引起VDR构象的改变和磷酸化，从而使VDR被活化。活化的VDR再通过与视黄醇X受体(retinoidXreceptor,RXR)结合形成VDR-RXR异二聚体，VDR-RXR异二聚体可促使VDR与靶基因启动子中的维生素D反应元件(vitaminDresponseelement,VDRE)结合，并在其他蛋白的参与下，调节靶基因的表达，进而实现其生物学功能。1,25(OH)2D3在体内具有多方面的活性，是维持钙、磷平衡和骨代谢的主要激素之一。除此之[9-11]外，1,25(OH)2D3在肿瘤的预防和治疗方面也具有重要作用。血清中[12][13]低水平的维生素D代谢活性形式1,25(OH)2D3可使结直肠癌、乳腺癌、[14]前列腺癌的危险性和病死率明显升高，且摄入低水平的维生素D与乳腺癌和结肠癌的发病呈负相关。维生素D与阳光照射有关，有研究表明，肺癌的发生发展与紫外线[15]照射具有密切关系。对美国人群的研究中，Grant发现居住在美国东南部的黑人比白种人肺癌的死亡率显著降低，这一发现提示紫外线照射与[16]肺癌死亡率成负相关。Grant对中国人群的研究也证实了纬度和热指数[17]与肿瘤死亡率有关系。在Mohr等的研究中的发现肺癌的发病与紫外线[18]照射量多少有关。在类似的研究中，Porojnicu等发现挪威肺癌患者夏秋季确诊的以及居住在高UV区的患者的死亡率明显降低。因为紫外线照-30- 研究论文射可影响维生素D在皮肤中的合成量，因此推测紫外线照射量多少和血中维生素D或其代谢物25(OH)D、1,25(OH)2D3与肺癌发病及预后有关。[19]2005年，Zhou等对456例早期非小细胞肺癌患者的总生存期(OS)、无疾病进展时间(PFS)、手术季节和维生素D摄入量之间的关系的研究中发现，冬季接受手术且维生素D摄入量低的患者比夏季接受手术并且摄入维生[20]素D多的患者5年生存率低，总生存期延长。2007年Zhou等对447例早期NSCLC患者血清25(OH)D浓度与预后的关系进行了研究，结果发现，血清25(OH)D的浓度以及维生素D的摄入量与早期NSCLC尤其是ⅠB-ⅡB期NSCLC患者的总生存期有关。除此之外，在芬兰的研究中Kilkkinen[21]等发现，女性和青年人血中维生素D水平较高，且该部分人群患肺癌的风险相对较低。目前有关维生素D对于肿瘤的抑制作用的研究很多[22-24]。其抗肿瘤作用机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性、抑制肿瘤转移、侵袭及血管生成。还可通过影响生长因子以及癌基因表达等抑制肿瘤。有研究表明1,25(OH)2D3在联合化疗、放疗和内分泌治疗时，不但可以增强这些治疗方法的疗效，还可以降低甚至逆转肿瘤细胞对放化疗的抵抗性或耐药性[25-27][28]。许多体内、体外实验都证实了1,25(OH)2D3有对肺癌的抑制作用。[29]Higashimoto等报道了关于1,25(OH)2D3可抑制肺癌细胞的增殖。1,25(OH)2D3也被报道了对肺癌小鼠模型的抑制肺肿瘤细胞生长和转移[30]的作用。由于肺脏有两组血液循环系统，所以肿瘤细胞易于转移，且[31]化疗药物很难控制。Sato等研究发现对同样移植Lewis肺癌细胞系的小鼠，不喂维生素D组较喂以维生素D组肺癌发生转移的概率高。通过对表达绿色荧光蛋白(GFP)的Lewis肺癌细胞系的研究，证实1,25(OH)2D3具有[32]很强的抑制肺癌生长和转移的作用。同时也证实了1,25(OH)2D3对肿瘤的抑制作用是其对肿瘤细胞直接作用的结果，而血中1,25(OH)2D3浓度水[33]平与肿瘤抑制效应密切相关。大量体内及体外研究显示，维生素D可抑制癌细胞的分化与增殖，低维生素D水平与肺癌的发生发展有关。最[34]近，Srinivasan等对73例未治疗的肺癌患者VDR表达与存活率的关系进行了研究，结果发现胞核VDR高表达组的存活率较低表达组明显改善(P=0.077)，5年的存活率分别为59%(95%CI0.39~0.80)和27%(95%CI0.12~0.41)，并提出胞核VDR表达与肺癌存活率有关，VDR-31- 研究论文对肺癌的预后可能起重要作用，值得更深入的研究。1,25(OH)2D3通过VDR介导发挥生物学效应，VDR表达具有普遍性，而且研究表明肺癌细[35]胞核中VDR高表达与良好预后及提高生存率相关。有关肺癌组织和肺癌前病变VDR表达的报道中，VDR在60%肺正常组织和6l%肺化生组织中呈中-高度核表达。在肺癌组织中，VDR核表达为79%，62%的细胞质缺[36]乏表达。另外，一项关于人类癌症的初步研究，应用免疫荧光技术测量VDR的表达，发现当正常细胞发生恶变时，VDR的表达数量也在发生[37]改变，由此推测这一变化可以作为预测疾病发生的标志。2.VDR基因多态性与肺癌人类VDR基因位于12号染色体长臂1区3带上，全长约100kb，共由9[38]个外显子和8内含子组成。任何不相关个体的DNA序列有约99.9%是一致的，而剩下的0.1%差异是影响了人们罹患各种疾病的不同风险和对药[39]物的不同反应的主要原因，其中将发生率大于1%的变异称为单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)。SNPs是人类基因组中最丰富的遗传变异形式，通过发现这些与疾病相关的DNA多态性位点，可揭示个体对疾病易感性不同的原因之一。VDR基因存在SNP，可以通过多聚酶链反应-限制性内切酶进行识别，即为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。目前研究较多的VDR多态性有：rs7975232对应限制性内切酶Apa1酶切位点；rs731236对应限制性内切酶Taq1酶切位点；rs10735810对应限制性内切酶Fok1酶切位点；rs1544410对应限制性内切酶Bsm1酶切位点；rs11568820对应Cdx-2结合位点。本实验研究的多态性位点Bsml、Fok1主要位于VDR基因的3’端。Bsml的位点位于8号和9号外显子之间的内含子内，Fok1位点位于2号外显子，具体碱基变化为Bsm1位点为A→G，Fok1位点为T→C。目前认为3’端非翻译区掌控着mRNA的稳定性，这些多态性可能影响了VDRmRNA的表达水平，在转录水平上影响VDR蛋白的表达，使VDR蛋白在数量和[40-42]活力上均有所改变，从而影响了维生素D效应的发挥。VDR的多态性与多种肿瘤的发生及预后有关。目前大量研究所得结果存在争议。Kostner等总结了PubMed上关于VDR基因多态性与多种癌症发病风险及预后之间的关系，发现VDR的Fokl位点多态性与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、黑色素瘤相关；Bsml位点多态性与乳腺癌和黑色素瘤相关；Taql-32- 研究论文[43]与乳腺癌和肾细胞癌相关。对于VDR基因多态性与癌症风险所做的Meta分析结果表明，VDR-Fok1位点ff基因型相对FF基因型能显著增加乳腺癌和皮肤癌的发病风险；Bsm1位点的Bb基因型相比bb基因型能降低前列腺癌的发病风[44]险。Zhou等对Bsm1、Cdx-2、Fok1这3个位点多态性在373例早期非小细胞肺癌患者(Ⅰ-Ⅱ期)中进行了研究，通过对不同基因型患者总生存期(overallsurviva,OS)与无复发生存期(recurrence-freesurvival,RFS)的区别的分析，发现其中的Cdx-2的A等位基因(G/A和A/A基因型)与早期肺鳞癌[45]患者更好的OS与RFS相关。Heist等收集了294例病例，也对上述3个位点多态性基因与进展期肺癌患者(Ⅲ-Ⅳ期)的生存率之间的关系进行了研究。结果表明，能提高VDR活性的Fok1的C/C基因型，不仅可以提高进展期肺癌患者的生存率，而且还会降低VDR活性的GTC(Cdx-2─Fok1─[46]Bsm1)单倍体型与更差的预后相关。Dogan等也对VDR的3个位点多态性基因Taq1、Bsm1和Apa1进行了研究。研究收集了137例不同分期各种病理类型的肺癌患者和156名对照者，研究发现降低VDR活性的Taq1多态性可能是患肺癌的危险因素，而年龄、性别、吸烟可能加重这一因素的[47]影响。而Liu等对非小细胞肺癌患者与VDR基因多态性的关系研究表明，Bsm1位点与Bgll位点可作为非小细胞肺癌生存率的独立影响因素。本实验研究的VDR基因Bsm1、Fok1位点多态性与晚期肺腺癌患者间发现可能有相关性。而通过多因素非条件Logistic回归分析得出性别是肺癌发生的主要危险因素。其中在172例健康对照组中，Bsm1位点BB、Bb和bb基因型分别为5例、42例和125例，三种基因型分布频率分别为2.9%、24.4%和72.7%；b等位基因频率在病例组是84.9%；B等位基因频率在病例组中是15.1%。Fok1位点，172例患者中，FF、Ff、ff基因型分别为32例、105例、35例，3种基因型分布频率分别为18.6%、61.0%、20.4%；f等位基因频率在病例组中是50.9%；F等位基因频率在病例组中是49.1%。近年国内外有大量关于VDR基因的研究报道，显示VDR基因位点的基因型及等位基因的分布因人种不同而差异较大。如Bsm1位点，我国人群中等位基因B频率约10%，略低于日本人(15%-20%)，与韩国人近似(约11%)。而在高加索人群中，等位基因B频率可达35%以上。就基因型比例，我国人群以bb型较多，达90%以上，Bb型次之，而BB型低于2%。而在高加-33- 研究论文索人群中，则以Bb型居多，约45%-55%，BB型为18%以上。3.VDR基因多态性与晚期NSCLC患者化疗敏感性的关系晚期NSCLC的患者主要治疗手段为化疗。然而并非每位患者都会从中获益，提示我们因个体之间的遗传素质不同可能导致对化疗敏感性的差异。肿瘤耐药是化疗失败的重要原因，其中多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药蛋白(LRP)在NSCLC中高表达，可反映肿瘤细胞的多药耐药性。[45]王英田等经实验研究证实，全反式维甲酸(ATRA)或维生素D能下调肺腺癌MRP、LRP基因的表达水平，两药合用有协同的作用，可以提高肺[48、49]腺癌的化疗敏感性。国内也有相似报道。有研究显示，维生素D可以增强化疗、放疗和内分泌治疗肿瘤的效果，还可以降低甚至逆转肿瘤细胞对放化疗的抵抗性。VDR是维生素D发挥生物学作用的介导，VDR基因的多态性影响了维生素D效应的发挥。研究维生素D基因多态性与肺腺癌化疗敏感性的关系可为肺腺癌患者的个体化治疗提供依据。本课题对VDR基因Bsm1、Fok1位点多态性与GP/GC方案化疗敏感性之间的关系进行研究，结果显示，VDR基因多态性与化疗敏感性之间无明显关联。由于本课题选取样本量较少，需扩大样本重复研究以进一步证实二者间的关联。4.VDR基因单倍体型与NSCLC易感性的关系连锁不平衡(LinkageDisequilibrium,LD)即等位基因关联(allelicassociation)，是群体内不同位点上，等位基因间的非随机组合形式，即不同位点等位基因之间存在连锁关系，而不是自由组合关系，研究连锁不平衡是寻找疾病相关基因的易感位点的目的之一，其中单倍体型分析是其必要的工具。在探讨基因与疾病的关系时，对单倍体型的分析可获得更多信息，可利于更准确和客观地分析疾病的遗传易感性。虽然本研究在分析2个单位点与肺腺癌的关系时未得出Bsm1、Fok1与肺腺癌发生有关联，但这并不能否定2个位点以联合作用方式参与肺癌的发生、发展过程，因此，我们进一步对这2个单核苷酸位点的连锁关系进行了分析，并采用单倍体型的分析方法探讨VDR基因2个位点对肺腺癌的联合作用。本研究结果显示，Bsm1、Fok12个多态性位点不存在显著连锁不平衡，由于基因之间的相互作用关系复杂，而且样本量的大小都会对结果产生很大影响，所以这一结果仍需进一步的研究验证。-34- 研究论文综上所述，遗传因素在肺癌发病中是否起着更为重要的作用，目前尚未有明确结论。但该多态性位点的重要性不容忽视。在进一步的研究中，尚需进行大样本、多区域、多种族广泛深入的协同研究基因背景与环境因素的交互作用以及多基因的连锁关系及单倍体型为肺癌发病机制、风险预测及个体化治疗的完善提供新的线索。结论1.VDR基因Bsm1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险相关联。Bsm1位点B等位基因可能增加肺腺癌的发病风险。2.VDR基因Fok1位点多态性与晚期肺腺癌发病风险可能关联。3.本研究显示女性比男性发生晚期肺腺癌的危险性高。4.VDR基因Bsm1、Fok1之间不存在明显的连锁不平衡。5.VDR基因Bsm1、Fok1位点多态性与化疗敏感性之间无相关。6.本研究显示吸烟与晚期肺腺癌发病相关性不显著。参考文献[1]ShahPP.SinghAP,SinghM,etal.InteractionofcytochronmeP4501A1genotypeswithotherriskfactorsandsusceptibilitylungcancer[J].MutatRes,2008,639(1-2):1-10.[2]ThunMJ,DeLanceyJO,CenterMM,etal.Theglobalburdenofcancer:prioritiesforprevention[J].Carcinogenesis,2010,31(1):100-110.[3]RudinCM,Avila-TangE,HarrisCC,etal.Lungcancerinneversmokers:molecularprofilesandtherapeuticimplications[J].ClinCancerRes,2009,15(18):5646-5661.[4]MetayerC,WangZ,KleinermanRA,etal.CookingoilfumesandriskoflungcancerinwomeninruralGansu,China[J].LungCancer,2002,35(2):111-117.-35- 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综述综述维生素D受体基因多态性与肿瘤关系的研究进展维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)为亲核蛋白，属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员。维生素D的细胞作用通过结合VDR在体内发挥生物学作用。维生素D除了经典的调节钙、磷代谢外，还具有[1]调节免疫、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及促进凋亡等作用。VDR基因结构的变异将影响维生素D的生物学功能的发挥，进而对肿瘤的发生发展产生影响。本文针对近年来VDR基因多态性与肿瘤关系研究的进展作一综述。1.维生素D与VDR维生素D（VitD）是一种脂溶性开环甾类化合物。可由人体表皮和真皮内含有的7-脱氢胆固醇经日光中紫外线照射转变而成及饮食摄入。VitD存在两种主要形式：麦角骨化醇(ergocalcifeml,D2)与胆骨化醇(cholecalcifeml,D3)。D2可由强化乳制品中摄取，而D3需要紫外线β在[2]表皮经7-去氢胆固醇异构化。异构化的D3进入血液循环结合VitD结合蛋白或白蛋白后被转运至肝脏,经27羟化酶(cytochromeP450family27subfamilyApolypeptide1,CYP27AI)转化为骨化二醇[calcifedi01,25(OH)D3]。之后25(OH)D3,再次进入血液循环,至肾脏近曲小管经1-ɑ羟化酶(cytochromeP450family27subfamilyBpolypeptidel,CYP27BI)转化为骨化三醇[calcitriol,1,25(OH)，D3]——活化VitD。1,25(OH)2D3，通过结合VDR发挥生物活性。维生素D是维持生命活动所必须的物质，它可以降低一些慢性疾病的发生。如果缺乏维生素D将会增加一些疾病如骨骼、肌肉疾病、糖尿病、心血管疾病、自身免疫性[3-7]疾病、传染性疾病及肿瘤的发病风险。目前许多体内和体外实验都证[8-9]实了维生素D对于肿瘤的抑制作用。其抗肿瘤作用机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性、抑制肿瘤转移、侵袭及血管生成，还可通过影响生长因子以及调[10-14]节癌基因表达等抑制肿瘤。近年有研究表明，1,25(OH)2D3在联合-40- 综述化疗、放疗和内分泌治疗肿瘤时，不但可以增强这些治疗方法的疗效，[15-19]还可以降低甚至逆转肿瘤细胞对放化疗的抵抗性。血清中高水平的[20、21][22、23]维生素D代谢活性形式1,25(OH)2D3可使结直肠癌、乳腺癌、[24]前列腺癌的危险性和病死率明显降低。且摄入高水平的维生素D与乳腺癌和结肠癌的发生呈正相关。以上研究提示，维生素D与肿瘤的发生有密切关系。人类VDR蛋白是一种含有427个氨基酸的多肽，其中包含有DNA结合域、配体结合域及活化域：VDR蛋白含有两个锌指结构以结合DNA，同时位于C’端配体结合域同l,25(OH)2D3，结合后发生形变并同转录因子发生反应。活化VDR与维甲类x受体(retinoidXreceptor，RXR)形成异质二聚体，后者移入细胞核并且与VitD靶基因的启动子区域结合。1,25(OH)2D3在血浆中的半衰期为15h。24羟化酶(cytochromeP450family24subfamilyApolypeptide1,CYP24AI)可分别将25(OH)D3及1,25(OH)2D3分解为24,25(OH)2D3及1,24,25(OH)2D3。后两者为水溶性且[25]呈失活状态。研究发现VDR是一种激素依赖性转录调节因子，当游离的1,25(OH)2D3弥散进入细胞后，转移至细胞核内，与VDR结合引起VDR构象的改变和磷酸化，从而使VDR被活化。活化的VDR再通过与视黄醇X受体(retinoidXreceptor,RXR)结合形成VDR-RXR异二聚体，VDR-RXR异二聚体可促使VDR与靶基因启动子中的维生素D反应元件(vitaminDresponseelement,VDRE)结合，并在其他蛋白的参与下，调节靶基因的表达，进而实现其生物学功能。1,25(OH)2D3在体内具有多方面的活性，是维持钙、磷平衡和骨代谢的主要激素之一。除此之外，[25-27]1,25(OH)2D3在肿瘤的预防和治疗方面也具有重要作用。维生素D通过介导VDR发挥其生物效应。VDR广泛存在于人体各种组织细胞中，几乎所有的有核细胞均可表达VDR。结肠、肾上腺皮质、[28、29]肺等部位的细胞中表达量较高。VDR蛋白质分为6个功能区(A-F)。A/B区为N端短区，是由24个氨基酸残基组成的，不依赖配体，具有细胞特异性的转录激活自主调节功能区，也称AF-l区域；C区为DNA结合区(DNA-bindingdomain,DBD)，是核受体家族的特异性蛋白质组成。人、大鼠、鸡之间，结合区的同源性为98.5%。由VDR外显子Ⅱ、Ⅲ编码。功能主要为识别靶基因上的维生素D反应元件(vitaminD-41- 综述[30]responsiveelement,VDRE),含有2个直接介导受体与靶基因相互作用的富含半胱氨酸残基的“锌指”结构。另外，DNA结合区也部分参与VDR异二聚体的形成；D区为铰链区，该区具有很高的免疫原性，即抗原决定区。该区可能与核定位有关；E／F区为配体结合区(ligand-bindingdomain,LBD)，由VDR基因外显子Ⅴ-Ⅸ编码。该区和1,25(OH)2D3有较高的亲和力，还参与同类视黄醇X受体(retinoidXreceptor,RXR)形成二聚体，增强其与VDRE的结合能力。此外，在该区近C端处还有一个转录激活区(activationfunction-2,AF-2)。AF-2可促进VDR与协同激活因子[31、32]/协同抑制因子相结合，从而使VDR发挥调控靶基因的转录活性。2.VDR基因多态性人类VDR基因位于12号染色体长臂1区3带上，全长约100kb，[33]共由9个外显子和8个内含子组成。5’端非编码区包括外显子IA，IB，IC，另外8个外显子(Ⅱ-Ⅸ)编码VDR的结构部分。VDR基因存在单个碱基突变，这种突变在人群中有一定的分布频率，这种单个核苷酸突变称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorhism,SNP)。可分为基因组非编码区的变异和基因编码区的变异。可以通过多聚酶链反应-限制性内切酶进行识别，即为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。目前研究较多的VDR多态性有，rs10735810对应限制性内切酶Fok1酶切位点；rs1544410对应限制性内切酶Bsm1酶切位点;rs731236对应限制性内切酶Taq1酶切位点;rs7975232对应限制性内切酶Apa1酶切位点;rs11568820对应Cdx-2结合位点。其中几个多态性位点如Bsml、Apal与Taql主要位于VDR基因的3’端。Bsm1、Apa1位点位于第8和第9外显子之间的内含子上，具体碱基变化为Apa1位点为G→T；Bsm1位点为A→G，其多态性不影响VDR的氨基酸序列。Taq1位于第9外显子上，由T→C的突变使密码子ATT变为ATC，其多态性是由同义突变造成的，也不会造成VDR的氨基酸序列改变。而Fokl位点位于5’端第2外显子上的翻译起始密码子区域，该位点多态性是由ATG中的T被C替换成为ACG，产生两种不同长度的VDR蛋白。F等位基因编码424个氨基酸的蛋白质，而f等位基因编码427个氨基[34-35]酸的蛋白质，f基因型的蛋白质转录活性显著弱于F基因型。Cdx2结合位点在VDR基因启动子5’末端，具体定位于启动子区外显子-42- 综述1e(1e-G1739A)，作为VDR表达的主要元件，在肠细胞VDR基因启动子的结合位点是决定VDR表达的关键，其多态性是G→A的单碱基的改变所产生。VDR基因多态性可能是通过影响VDR的mRNA的表达与稳定，从而造成VDR数量或活性的变化，从而改变了它与维生素D的[36]亲和力、结合DNA的能力以及转录激活能力。3.VDR基因多态性与肿瘤的关系3.1基因多态性与乳腺癌乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，居女性恶性肿瘤发病率第[37、38]一位。有关维生素D与乳腺癌的关系一直受到关注。美国国家癌症研究所关于VDR基因多态性与乳腺癌发病风险的前瞻性病例对照研究表明，VDR-Fok1位点ff基因型相对FF基因型具有统计学差异(OR=[39][40]1.16,95%CI:1.04-1.28)。同样Tang等的Meta分析也表明Fok1可能[41]是乳腺癌发病的易感基因。尤其是在欧洲人群中。Anderson等对加拿大安大略省白种妇女的1777例乳腺癌患者与1839例正常人病例对照研究也证实VDR-Fok1位点ff基因型与患乳腺癌的风险呈负相关。Guy等[42][43]报道了Bsm1位点的基因型bb与乳腺癌的高发风险有关。Ingles对[44]拉丁裔美国人的研究则有相反的报道。Trabert等对1631例乳腺癌患者组与1435例对照组分析发现，在白种人中bb基因型是绝经后妇女患乳腺癌的危险因素，而在他们研究的黑人妇女中这种联系则不明显。[45]McCullough等观察到Bsm1多态性具有B等位基因的妇女乳腺癌风险[46]减少20%。Lundin等在111名乳腺癌患者和130名健康妇女的病例对照研究中，发现两者Taq1基因型频率无显著差异。但在乳腺癌患者中，携带tt基因型患者的死亡率(22%)远低于TT基因型(41%)和Tt基因型(44%)，且携带TT基因型的患者发生淋巴转移的风险较携带t等位基因[47]的患者明显增加。Sillanpää等研究了芬兰人群483例乳腺癌患者与482例健康妇女的VDR基因Taq1位点多态性。发现Taq1位点TT和Tt基因型能降低乳腺癌的发生。同时，他们发现VDR基因Apa1位点aa基[46]因型患乳腺癌的风险明显低于AA基因型者。而Curran等则有相反的[47]报道，具有AA基因型者比aa基因型者患病率低。HuangJ等Meta分析8186例肿瘤患者与8685例正常人病例对照研究显示VDR的基因[48]多态性与前列腺癌、乳腺癌无关。国内崔静等研究了酶切位点Apa1-43- 综述及Taq1的多态分布，证实Tt、tt基因型和tA单体型与乳腺癌相关。Hou[49]等对中国台湾人的研究发现，Bsm1多态性的等位基因与乳腺癌相关，AA基因型预示乳腺癌风险提高，而Aa基因型乳腺癌风险较小,Taq1多态性与乳腺癌风险无关。但也有研究认为，VDR基因多态性与乳腺癌的[50]发生发展无关。Dunning等实验了英国951名乳腺癌患者和627名健康妇女的VDRTaql多态性，结果并未发现与乳腺癌患病风险相关。同[51]样Bretherton等在英国高加索人群中未发现VDRFokl基因的多态性[52]与乳腺癌相关。Chen等在1180例患者与1547例对照组的研究中亦[53]未发现VDRBsml基因型与乳腺癌的关系。Buyru等也未发现土耳其乳腺癌患者与正常人群的VDR基因Taq1和Bsm1多态性存在差别。与[54][55]Dorjgochoo、刘德权等对中国人群研究结论基本一致。这种差异可能是由不同地域及种族间的差异所致。3.2VDR基因多态性与前列腺癌前列腺癌是男性泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高且存在显著的种族差异。近年的研究发现，VDR基因和某些参与雄激素合成调节的关键酶的基因多态性与前列腺癌发病危险相关，但大多[56]研究都集中在高发病的欧美人群。Yin等应用Meta分析Apa1、Taql、Bsm1、Fokl和Cdx-2单核苷酸多态性与前列腺癌的风险。结果显示，Taqlt和Bsm1B等位基因与前列腺癌的风险减少有关。进一步按种族分层分析显示，Apa1A等位基因仅在亚洲人群中显示与前列腺癌风险降低有关，而Foklf等位基因只在高加索人群中提示有前列腺癌的风险增加[57]的趋势。刘多等关于VDR基因Taq1位点多态性与亚洲男性前列腺癌易感性的Meta分析显示VDR基因Taq1位点变异可能会降低亚洲男[58]性个体患前列腺癌的危险性。GuoYJ等的Meta分析1141例前列腺患者与1185例正常人病例对照，显示TaqIt等位基因增加前列腺癌的[59]发病风险。Medeiros等的研究显示，与携带VDRtt型基因者相比，[60]携带VDRTT基因型者患前列腺癌的危险性显著增加。而Gsur等在奥地利高加索人群中的研究显示，VDRTaql基因的多态性与发生前列腺[61]癌的危险性无关。Onen等探讨在土耳其人口的VDR基因和散发前列腺癌之间的关系，结果表明VDR的Apa1多态性可能在散发前列腺癌的[62]发病中发挥着作用。Kelsey等对372名前列腺癌患者和591名健康人-44- 综述群进行分析后发现，携带VDR基因BB基因型老年个体的前列腺癌患病率比bb基因型者降低了57%，而在青年人和1,25(OH)2D3水平在平[63]均值以上的人群中却未发现此种联系。Bai等对中国南方汉族人的研[64]究显示Bsm1位点与前列腺癌有关联。Habuchi等的研究也发现Bsm1[65]的多态性在预防前列腺癌中有重要的作用。Xu等调查了191例前列腺癌根治术后患者VDR基因多态性，发现F等位基因的存在和肿瘤恶性程度呈正比，ff基因型和肿瘤的分级呈负相关，预示ff基因型对前列腺癌发展有保护机制，但也有研究认为VDR多态性与前列腺癌无关。[66]Berndt等将患者按人种分类研究发现VDR基因多态性Bsml、Fokl、[67]Taql、Apal、PolyA都与前列腺癌无关。Blazer等也认为VDRTaql[68]和PolyA多态性未必与前列腺癌有关。相似的结论还有Hayes在澳大[69][70]利亚的人群中的研究。Cheteri在美国白种人的研究。以及Aimuangraj[71]对泰国人群的研究。而在相对发病率低的我国，Chokkalingam等在上海地区的研究表明，VDR基因多态性与前列腺癌发病风险无明显相关[72][73]性。杨奕等对湖北地区汉族人群研究，以及白永恒研究浙江地区人群Cdx-2、Fok1位点多态性，均未发现与前列腺癌发病的关系。刘建河[74]等对VDRBsm1位点单核苷酸多态性与前列腺癌关系的研究，显示Bsm1多态性在低发病的中国汉族人群与前列腺癌无相关。这种不一致的结果提示VDR基因型分布具有种族差异。3.3VDR基因多态性与皮肤癌皮肤癌是白种人常见的恶性肿瘤之一。在我国发病率较低，常见的有基细胞癌(BCC)，鳞状细胞癌(SCC)，恶性黑素瘤(MM)等。近年来有[75][76]关VDR基因多态性与皮肤癌的关系开始受到关注。Gandini等关于VDR基因多态性与皮肤癌的Meta分析，显示VDR-Fok1位点f等位基因与皮肤恶性黑色素留(CMM)及基底细胞和鳞状细胞皮肤癌(NMSC)正[77]相关，而Bsm1B等位基因与CMM负相关。Köstner等的研究结果表明VDR基因多态性在BCC和SCC发病起到非常重要的作用。[78]Hutchinson等在316例多发性骨髓瘤(MM)患者与108例健康者间的对照研究中，发现Fok1位点多态性与MM的发病相关，而且，ttff基[79]因型与肿瘤的厚度有显著关联。Li等发现VDRf等位基因的基因型是MM的易感因素，而携带VDRt等位基因的人群患MM的风险低。-45- 综述[80]Mocellin等研究表明VDR基因Bsm1位点多态性与黑色素瘤发病风险[81]相关(OR=1.30,95%CI:1.11-1.53)。Mandelcorn等调查了VDR基因位点多态性在1138例多发性原发黑色素瘤患者和2151例单一原发黑色素瘤患者之间的关系，发现只有Bsm1多态性与多发性原发黑色素瘤相关。3.4VDR基因多态性与结直肠癌很多研究证实，饮食中如果摄入较多的维生素D可降低结直肠癌发病率。而维生素D主要是通过与VDR结合发挥作用，故VDR基因的[82]遗传变异可能与结直肠癌的易感性相关。Wong等研究了VDR的Fokl基因多态性在890例对照与217例病例中分布，发现具有FF基因型者[83]发病风险显著升高。Ingles等的研究发现钙的摄入会影响不同基因型[84]与结肠癌发病风险间的作用。王果等对中国人群VDR基因Fok1位点多态性的研究发现，携带Ff和ff基因型的人群比携带FF基因型的人群结直肠癌的患病风险明显增高，f等位基因可能是易感基因之一。国内[85][86]李宝群对北方满族人的研究也有相似的报道。而Li等对中国人群的研究发现VDR的Bsm1位点BB基因型可降低结直肠癌发病风险，与[87]VDR的Fok1位点无相关。Touvier等的Meta分析研究结果显示支持Bsm1位点多态性与结直肠癌的关系。同时也证实了维生素D摄入及25(OH)D水平与发病呈负相关。另有在欧洲人群的研究显示，VDR的[88]Bsm1位点多态性是结肠癌的发病风险，但与直肠癌无关。Yaylim等[89]研究显示，结直肠癌患者携带TT基因型相比Tt和tt基因型的患者血中25(OH)D3水平低，而VDR基因TtFf、TTFf基因型可能是结直肠癌[90]的保护基因型。Mahmoudi等在伊朗人Apa1、Taq1位点的160例结直肠患者与180例对照的研究，结果显示，VDR的Apa1位点aa基因型可增加结直肠癌的发病风险。该作者关于VDR的Fok1、Bsm1位点的[91][92]研究则表明与结直肠癌无关。同样Kupfer等在美国黑种人与白种人间的研究也未发现相关。3.5VDR基因多态性与肺癌肺癌是全球最常见的肿瘤，目前的许多体内和体外实验都证实维生素D与肺癌的发病及预后相关。促进高维生素D水平的各种因素都对肺癌患者的预后和肺癌的预防有益。而促进VDR活性的VDR多态性基[93-96][97]因对部分肺癌患者的预后及肺癌的预防有利。Zhou等对Cdx-2、-46- 综述Fok1、Bsm1这3个位点多态性在373例早期非小细胞肺癌患者(I-II期)中进行了研究。通过对不同基因型患者总生存期(OS)与无复发生存(RFS)的区别的分析，发现其中的Cdx-2的A等位基因(G/A和A/A基因型)[98]与早期肺鳞癌患者更好的OS与RFS相关。Heist也对上述3个位点多态性位点与进展期肺癌患者(Ⅲ-IV期)的生存率之间的关系进行了研究，研究收集了294例病例，最终发现能提高VDR活性的Fok1的C/C基因[99]型，可提高进展期肺癌患者的生存率。Dogan等也研究了VDR的3个多态性位点Taq1、Bsm1和Apa1，收集了137例不同分期各种病理类型的肺癌患者和156名对照者，研究这3个位点基因多态性与肺癌发病风险之间的关系。结果发现降低VDR活性的Taq1多态性基因可能与肺癌的发病相关，而年龄、性别、吸烟可能加重这一因素的影响。而Liu[100]等对我国非小细胞肺癌患者与VDR基因多态性的关系研究显示，Bsm1位点与Bgll位点是影响非小细胞肺癌生存率的独立因素。3.6VDR基因多态性与其他恶性肿瘤[101]Mittal等研究了VDR基因多态性与膀胱癌的发病风险，提示携带Fok1位点FF基因型的人群较ff基因型者明显提高患膀胱癌的风险。然而国内类似报道却显示VDR基因Fok1位点ff型基因可能是患膀胱癌[102][103]的高危基因型。黄克锋等对92例食管癌患者及115例健康者为对照的研究中显示，Taq1位点等位基因分布在两组间差异有统计学意义，与Tt、tt基因型者相比，携带TT基因型者患食管癌的风险明显增加。[104]Lurie等在对VDR基因与卵巢癌的研究中发现，高加索人群中Apa1A等位基因携带者较a等位基因携带者增加了患卵巢癌的风险，同样Fok1f等位基因也提示了增加患卵巢癌的风险性。该作者进一步研究证[105]实了VDR基因Fok1位点多态性可增加50岁以下女性患卵巢癌风险。[106]Bektas等的研究证实，VDR基因的Taq1位点多态性与口腔鳞状细胞[107]癌存在相关性。Tt基因型具有更高的发病风险。Tworoger等在新英格兰对大样本的卵巢癌患者和对照组进行基因多态性分析的回归性研究，发现Fok1位点f等位基因与卵巢癌发病具有相关性。携带ff基因型可增加卵巢癌的发病风险(OR=1.26,95%CI:1.01–1.57)。但Clendenen[108]等的研究结果与之不同，VDR基因多态性与卵巢癌的发病风险无明[109]显相关。Obara等对日本人群的研究发现，Apa1位点AA基因型在-47- 综述肾癌患者组明显不同于对照组，多元回归分析显示AA基因型可作为独立的预后因素影响生存，而Bsm1位点与Taq1位点多态性同肾癌发病无相关。在对北印第安人群的VDR基因多态性的研究显示，携带VDR的Fok1位点ff基因型和VDR的Bsm1位点bb基因型发生肾癌的风险增加[110]1.87倍，FF基因型和肿瘤的病理分期及组织学分级成负相关。6.结语目前，主要采用病例-对照的分子流行病学方法来研究VDR单核苷酸多态性与肿瘤易感性关系，虽然结果存在争议，但是人们已经认识到了该基因在肿瘤发生、发展和预后中起到非常重要的作用。然而在肿瘤发生发展的过程中是多基因多因素参与的，单个基因的变化很难充分解释某些肿瘤发生发展的原因。并且由于地区种族间的差异、样本例数不足以及研究方法的不同，可能导致了某些研究结果的不一致。今后的研究重点，应在已有研究的基础上，进行VDR基因多态性与环境交互作用分析，VDR基因多态性位点与其它基因多态性位点的联合分析，以及在多地区多种族间进一步验证。对肿瘤易感基因不断深入的研究以及更多易感基因的发现，将会在评估肿瘤易感个体和预测高危人群方面提供重要依据，为个体化治疗提供理论依据。-48- 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致谢致谢首先向我的导师杨雁鸿主任医师献上我最诚挚的感谢和敬意！杨老师不仅在我的实验过程中倾注了大量的心血和精力，更有对我学习和生活的关心和鼓励。导师崇高的敬业精神，严于律己、宽以待人的为人处事风格将成为我一生学习的楷模。衷心感谢秦皇岛市第一医院肿瘤科付占昭主任在我三年学习和生活中给予的支持、帮助和教导，付主任渊博的知识、宽厚的品格给了我至深的影响，他的言传身教让我受益终身。衷心感谢秦皇岛市第一医院中心实验室齐曦明老师在实验和学习中给予的悉心指导和无私帮助。衷心感谢秦皇岛市第一医院检验科李洪臣主任及体检中心刘丽主任在实验标本收集中给予的热情帮助。衷心感谢秦皇岛市第一医院肿瘤科全体老师在我学习和生活中给予的无微不至的关心和照顾。衷心感谢承德医学院研究生部各位领导和老师以及秦皇岛市第一医院科教科所有老师三年来的培养和帮助。感谢我的家人，同学和朋友们在这三年求学期间给予我的关爱和鼎力支持。谢谢！-59- 简历个人简历一．一般情况姓名唐利娟性别女民族汉出生年月1986年12月25日籍贯河北省邢台市二．个人经历2005.9~2010.7承德医学院中西医结合临床医学学士学位2010.9~2013.7承德医学院肿瘤学硕士学位三．发表论文1.《维生素D受体基因多态性与非小细胞肺癌易感性的关系》发表于《山东医药》，2012年52卷43期40-41页。2.《维生素D受体基因多态性与吸烟因素交互作用影响肺癌发生的病例对照研究》现《中国老年学杂志》拟于2013年8月刊登。3.《维生素D受体基因多态性与晚期非小细胞肺癌化疗敏感性关系》现《重庆医学》审稿中。四．承担或主研课题情况1.参与《维生素D受体基因多态性与晚期NSCLC易感性及化疗疗效关系》研究--秦皇岛市2011年科学技术研究与发展计划(201101A259)项目。2.参与《曲妥珠单抗联合尼妥珠单抗对肺癌A549细胞作用的研究》--秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（2012023A130)。-60-