mthfr基因多态性与大肠癌易感性的关系

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中图分类号：R735.3编号：20090109承德医学院硕士研究生毕业论文MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系RelationshipbetweenpolymorphismofMTHFRgeneandsusceptibilityofcolorectalcarcinoma研究生：孙全昌导师：郑纪宁教授学科专业：病理学与病理生理学所在部系：基础部研究起止日期：2010年9月~2012年3月论文提交日期：2012年3月 承德医学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归承德医学院所有。承德医学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为承德医学院，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归承德医学院所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：导师签章：年月日承德医学院研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：导师签章：年月 MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系RelationshipbetweenpolymorphismofMTHFRgeneandsusceptibilityofcolorectalcarcinoma研究生：孙全昌学号：20090109年级：2009级导师：郑纪宁教授学科专业：病理学与病理生理学所在部系：基础部研究方向：大肠癌的病因机制及早期诊断的研究研究起止日期：2010年9月~2012年3月论文提交日期：2012年3月 目录中文摘要……………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………4英文缩写……………………………………………………………………8研究论文MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系前言……………………………………………………………………9材料与方法……………………………………………………………10结果……………………………………………………………………18附图……………………………………………………………………21附表……………………………………………………………………23讨论……………………………………………………………………30结论……………………………………………………………………36参考文献………………………………………………………………37综述……………………………………………………………………41致谢……………………………………………………………………48个人简历……………………………………………………………………49 中文摘要MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系摘要目的：大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率逐年上升，且发病年龄有年轻化趋势。大肠癌的发生发展是环境因素和遗传因素共同作用的结果，同一人群暴露于相同的环境致癌因素，并非全部个体都发生恶性肿瘤，表明个体间遗传易感性存在差异。当今，手术和化疗仍然是治疗大肠癌的主要手段，但是临床治疗效果仍不十分满意，给患者带来了巨大经济负担和痛苦；近年来研究证实：叶酸摄入过低或合成减少是大肠癌的危险因素之一。叶酸摄入后需经代谢转化才能发挥其生物学功能，而亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢通路中的限速酶。目前报道了几种MTHFR基因的单核苷酸多态性（SNP），其中两种分别是SNP存在于密码子677C→T，1298A→C，与大肠癌关系密切。我们试图通过研究确定MTHFR基因C677T和A1298C多态性与大肠癌易感性的关系，及MTHFR基因C677T和A1298C多态性与大肠癌临床病理特征（包括大肠癌的肿瘤大小、位置、组织学类型、分化程度、有无淋巴结转移，Duke’s分期）的关系，探讨MTHFR基因C677T和A1298C多态性在大肠癌发展中作用，进一步揭示大肠癌病因机制，对大肠癌进行早期诊断和判断预后，并以此作为特异的生物学指标用于筛选和保护易感人群。方法：采用病例对照研究方法，选择大肠癌组120例，对照组202例。同时收集大肠癌组和对照组一般情况如年龄、性别、吸烟和饮酒情况。抽取大肠癌患者术后、化疗前及对照者的外周静脉抗凝血2ml，-80℃保存，用TIANampGenomicDNA提取试剂盒提取外周静脉血白细胞DNA，然后用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析技术检测120例患者和202例对照者的MTHFR基因C677T和A1298C基因型分布情况。比较各基因型频率的观察值与预期值并进行卡方检验行Hardy-Weinberg平衡分析，大肠癌组与对照组的基因型分布比较采用卡方检验，以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别、吸烟和饮酒校正的相对风险度的比值1 中文摘要比（oddsratio，OR）及其95％可信区间（confidenceinterval，CI）。结果：1MTHFR基因C677T多态性与大肠癌1.1MTHFR基因C677TC/C、C/T和T/T基因型分布频率在大肠癌组分别为45.0%，46.7%，8.3%，对照组分别为32.7%，47.5%，19.8%，两组之2间的基因型频率分布差异有显著性（x=9.46，P＜0.01）；MTHFR基因C677TC等位基因与T等位基因分布频率在大肠癌组分别为68.3%和31.7%，对照组分别为56.4%和43.6%，两组之间的等位基因频率分布差异2有显著性（x=8.95，P＜0.01）。1.2与C677TC等位基因相比，C677TT等位基因的大肠癌风险显著降低（aOR：0.57，95％CI：0.40-0.81，P＜0.01)；与C/C纯合子相比，T/T纯合子的大肠癌风险显著降低至0.28倍（95％CI：0.12-0.63，P＜0.01)，差异有统计学意义。1.3在不饮酒人群中，与C677TC等位基因相比，C677TT等位基因的大肠癌风险显著降低（aOR：0.44，95％CI：0.25-0.76，P＜0.01）；与C/C纯合子相比，C/T杂合子和T/T纯合子的大肠癌发病风险分别降低至0.41倍（95％CI：0.17-0.95，P＜0.05）和0.26倍（95％CI：0.09-0.78，P＜0.05），差异有统计学意义。在饮酒人群中，C/T杂合子和T/T纯合子的大肠癌风险均低于C/C纯合子，差异无统计学意义（C/T：aOR：0.86，95％CI：0.43-1.72，P＞0.05；T/T：aOR：0.29，95％CI：0.08-1.00，P＞0.05）。1.4在大肠癌组中，MTHFR基因C677T多态与肿瘤大小、位置、组织学类型、分化程度、淋巴结转移以及Duke's分期均无显著相关性（P＞0.05）。2MTHFR基因A1298C多态性与大肠癌2.1MTHFR基因A1298CA/A、A/C和C/C基因型分布频率在大肠癌组分别为64.2%，32.5%，3.3%，对照组分别为62.9%，31.2%，5.9%，两组2之间的基因型频率分布差异无显著性（x=1.09，P＞0.05）；MTHFR基因A1298CA等位基因与C等位基因分布频率在大肠癌组分别为80.4%和19.6%，对照组分别为78.5%和21.5%，两组之间的等位基因频率分布差异2无显著性（x=0.35，P＞0.05）。2.2与A1298CA等位基因相比，A1298CC等位基因的大肠癌风险降低至0.91倍（95％CI：0.60-1.39，P＞0.05)；与A/A纯合子相比，C/C纯合2 中文摘要子的大肠癌风险降低至0.63倍（95％CI：0.19-2.09，P＞0.05)，A/C杂合子的大肠癌风险升高至1.03倍（95％CI：0.61-1.73，P＞0.05），差异无统计学意义。2.3在不饮酒人群中，与A1298CA等位基因相比，A1298CC等位基因的大肠癌风险升高，差异无统计学意义；与A/A纯合子相比，A/C杂合子和C/C纯合子的大肠癌发病风险差异无统计学意义。在饮酒人群中，A/C杂合子的大肠癌风险高于A/A纯合子，差异无统计学意义。2.4在大肠癌组中，MTHFR基因A1298C多态与肿瘤大小、位置、分化程度、淋巴结转移以及Duke's分期均无显著相关性（P＞0.05）。3MTHFR基因C677T和A1298C多态性与大肠癌3.1同时携带MTHFR基因CC/AA(C677TC/C和A1298CA/A)和TT/AA(C677TT/T和A1298CA/A)基因型分布频率在大肠癌组分别为31.7%，6.7%，对照组分别为19.8%，18.3%，两组之间的基因型频率分布2差异有显著性（x=11.67，P＜0.01）。3.2与同时携带MTHFRC677TC/C和A1298CA/A基因型者相比，MTHFRC677TT/T和A1298CA/A基因型携带者发生大肠癌的危险性显著降低，其性别、年龄、吸烟、饮酒因素调整后的OR为0.22（95％CI：0.09-0.57，P＜0.01），差异有统计学意义。结论：1MTHFR基因C677T多态性与大肠癌的易感性有显著相关，C677TT/T基因型可降低大肠癌发病风险；饮酒可削弱C677TT/T基因型的大肠癌风险保护效应；MTHFR基因C677T多态与大肠癌临床病理特征无相关性。2MTHFR基因A1298C多态性与大肠癌的易感性无显著相关；MTHFR基因A1298C多态与大肠癌临床病理特征无相关性。3MTHFRC677TT/T和A1298CA/A在大肠癌易感性的影响中有协同作用。关键词：MTHFR；基因多态性；易感性；限制性片段长度多态性；大肠癌3 英文摘要RelationshipbetweenpolymorphismofMTHFRgeneandsusceptibilityofcolorectalcarcinomaAbstractObjective:Colorectalcarcinoma(CRC)isoneofthemostcommonmalignanttumorsofhuman.RecentlytheincidenceofCRChasanincreasedtrend.Theageofonsetisbecomingyoungerandyounger.CRCwasthoughttobetheresultsofacomplicatedmultistepprocessundergonetheimpactofenvironmentandgenes.However,notallthesubjectscametonewCRC,whenthetotalpeopleexposuredtothesamehigh-riskenvironment.Itindicatedthattherewassomedifferenceaboutsusceptibilityofsubjects.Theefficacyofthechemotherapyisnotsatisfied.ItbringsalotofsufferingandeconomicburdentopatientswithCRC.PresentlyreportedFolicacidintakewastooloworreducedsynthesiswasariskfactorforCRC.Folateintakeexertstheirbiologicalfunctionsaftermetabolicconversion,andmethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)istherate-limitingenzymeinthefolatemetabolicpathway.Inaddition,presentlyreportedseveralmethylenetetrahydrofolatereductasegene(MTHFR)singlenucleotidepolymorphism(SNP),twoofthoseresideincodon677C→T(677C→TSNP)and1298A→C(1298A→CSNP),haveacloserelationshipwithCRC.Wetrytoinvestigatethepossiblerelationshipbetweenthemethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)C677TandA1298CpolymorphismandsusceptibilityofCRC,andinvestigateitscorrelationtoclinicalpathologicalfeatures(suchastumorsize,location,histologicaltype,differentiation,metastasisoflymphnodeandDuke’sstage),inordertofurtherrevealtheetiologymechanismofCRC,andcontributetoearlydiagnosisofCRCandprognosis,andasaspecificbiologicalindicatorsforscreeningandprotectionofsusceptiblepopulation.Methods:4 英文摘要Thiscase-controlstudyincluded120casesofCRC,202casesofcontrols.Inthesameperiod,wecollectedthepatient’sage,gender,susceptivefactorssuchassmokinganddrinking.Twomillilitersoftheperipheralanticoagulantbloodwasharvestedfromthepatientsandcontrolsbeforechemotherapyandstoredat-80℃.GenemicDNAwasextractedfromperipheralbloodbyTIANampGenomicDNA.TheMTHFRgeneC677TandA1298Cpolymorphismofthe120patientsand202controlswereanalyzedbythePCR-basedrestrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)method.Hardy-WeinberganalysiswasperformedbycomparingtheobservedandexpectedgenotypefrequenciesinstudygroupsusingChi-squaretest.ComparisonoftheMTHFRC677TandA1298Cgenotypeandallelotypedistributioninthestudygroupswasperformedbymeansoftwo-sidedcontingencytablesusingChi-squaretest.TheassociationsofdifferentfactorswithCRCriskwereestimatedbycalculatingtheoddsratios(ORs)andtheir95%confidenceintervals(95%CIs)withunconditionallogisticregressionmodeladjustedbyage,genderandsoon.Results:1MTHFRgeneC677TpolymorphismandCRC1.1ThefrequenciesoftheMTHFRC677TC/C、C/TandT/Tgenotypeswere45.0%、46.7%and8.3%inCRCcases,and32.7%、47.5%and19.8%incontrols,thegenetypefrequencydistributionoftwogroupshavesignificant2variance(x=9.46，P＜0.01)；ThefrequenciesoftheMTHFRC677TCandTallelotypewere68.3%and31.7%inCRCcases,and56.4%and43.6%incontrols,theallelotypefrequencydistributionoftwogroupshavesignificant2variance(x=8.95，P＜0.01).1.2TheC677TTalleleshowedasignificantlydecreasedriskforCRC(aOR=0.57,95％CI=0.40-0.81,P＜0.01)whencomparedwiththeC677TCallele;ComparedwithC/Chomozygotes,T/Thomozygoteshada0.28-folddecreasedrisk(95％CI=0.12-0.63,P＜0.01).1.3TheC677TTallelealsoshowedasignificantlydecreasedriskforCRC(aOR=0.44,95％CI=0.25-0.80,P＜0.01)whencomparedwiththe5 英文摘要C677TCalleleamongnon-drinkers;AndasignificantreductionoftheMTHFRgenotypeswithCRCriskwasobserved,withanaORof0.41(95％CI=0.17-1.95,P＜0.05)forC/Theterozygotesand0.26(95％CI=0.09-0.78,P＜0.05)forT/ThomozygoteswhencomparedwithC/Chomozygotes.AmongdrinkerscomparedwithC/Chomozygotes,C/TheterozygotesandT/ThomozygoteswerenotsignificantlydifferentwithCRCrisk(C/T:aOR=0.86,95％CI=0.43-1.72,P＞0.05;T/T:aOR=0.29,95％CI=0.08-1.00,P＞0.05).1.4NocorrelationwasfoundbetweenMTHFRC677Tpolymorphismandtumorsize,location,differentiation,histologicalgrade,lymphnodemetastases,orDuke'sstage(P＞0.05).2MTHFRgeneA1298CpolymorphismandCRC2.1ThefrequenciesoftheMTHFRA1298CA/A、A/CandC/Cgenotypeswere64.2%、32.5%and3.3%inCRCcases,and62.9%、31.2%and5.9%incontrols,thegenetypefrequencydistributionoftwogroupshavenot2significantvariance(x=1.09，P＞0.05)；ThefrequenciesoftheMTHFRA1298CAandCallelotypewere80.4%and19.6%inCRCcases,and78.5%and21.5%incontrols,theallelotypefrequencydistributionoftwogroups2havenotsignificantvariance(x=0.35，P＞0.05).2.2TheA1298CCalleleshowedasignificantlydecreasedriskforCRC(aOR=0.91,95％CI=0.60-1.39,P＞0.05)whencomparedwiththeA1298CAallele.ComparedwithA1298CA/Ahomozygotes,A1298CC/Chomozygoteshada0.63-folddecreasedrisk(95％CI=0.19-2.09,P＞0.05),whereasA1298CA/Cheterozygoteshada1.03-foldincreasedrisk(95％CI=0.61-1.73,P＞0.05)ofCRC.2.3TheA1298CCalleleshowedasignificantlyincreasedriskforCRC(aOR=1.01,95％CI=0.25-0.76,P＞0.05)whencomparedwiththeA1298CAalleleamongnon-drinkers;comparedwithA/Ahomozygotes,A/CheterozygotesandC/ChomozygoteswerenotsignificantlydifferentwithCRCrisk(P＞0.05).AmongdrinkerscomparedwithAAhomozygotes,A/CheterozygoteswasnotsignificantlydifferentwithCRCrisk(P＞0.05).2.4NocorrelationwasfoundbetweenMTHFRA1298Cpolymorphism6 英文摘要andtumorsize,location,differentiation,lymphnodemetastases,orDuke'sstage(P＞0.05).3.MTHFRgeneC677TandA1298CpolymorphismandCRC3.1CombinedMTHFRC677TandA1298Cgenotypes,ThefrequenciesofMTHFRCC/AA(677CC+1298AA)genotypeis31.7％forthecasesand19.8％forthecontrols,thefrequenciesofMTHFRTT/AA(677TT+1298AA)genotypeis6.7％forthecasesand18.3％forthecontrols,thedifferencebetweenthecasesandcontrolswasstatisticallysignificant(P＜0.01).3.2ComparedwithMTHFRC677TC/ChomozygotesandA1298CA/Ahomozygotes,MTHFRC677TT/ThomozygotesandA1298CA/Ahomozygoteshada0.22-folddecreasedrisk(95％CI=0.09-0.57,P＜0.01).Conclusions:1TheMTHFRC677TT/ThomozygotesisassociatedwithadecreasedriskofCRC;AlcoholdrinkingnegatestheprotectiveeffectofC677TT/Thomozygotes.TheC677TpolymorphismhasnorelationswithclinicalpathologicalfeaturesofCRC.2TheMTHFRA1298CpolymorphismhasnorelationswithsusceptibilityofCRC;TheA1298CpolymorphismhasnorelationswithclinicalpathologicalfeaturesofCRC.3ThereisasynergiceffectbetweenMTHFRC677TT/TandA1298CA/AgenotypeswithCRCrisk.Keywords:methylenetetrahydrofolatereductase;genepolymorphism;susceptibility;restrictionfragmentlengthpolymorphism;colorectalcarcinoma.7 英文缩写英文缩写MTHFRmethylenetetrahydrofolatereductase亚甲基四氢叶酸还原酶PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液RFLPRestrictionfragmentlength限制性片段长度多态性polymorphismPCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核苷酸bpbasepair碱基对dNTPDeoxyribonucleotidetriphosphate脱氧三磷酸核苷酸EBethidiumbromide溴化乙锭AGEAgarosegelelectrophoresis琼脂糖凝胶RERestrictionendonucleases限制性内切酶TaqThermusaquaticus水生耐热菌SNPsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性ssecond秒minminutes分钟hhour小时EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸CRCColorectalcarcinoma大肠癌OROddsratio比值比CIConfidenceinterval可信区间8 研究论文MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系前言大肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率约居第四位。在我国居恶性肿瘤的3-5位，近年来，随着国民生活水平的提高，生活节奏的加［1］快，饮食结构和饮食习惯的改变，大肠癌的发病率逐年升高，仅次于胃癌和食管癌，而且发病年龄有年轻化趋势。大肠癌的发生是一个多因素多步骤的过程，是机体的内因与环境的外因交互作用的结果。环境的外因主要与高脂肪、高热量、低纤维素饮食及少体力活动有关；机体的内因主要与遗传背景有关。但是，并非所有暴露于上述危险因素的个体均患大肠癌，说明个体之间存在遗传易感性的差异。尽管目前在外科手术治疗、放疗、化疗及生物治疗方面取得了一定的进展，但由于其发生与发展涉及多方面因素，其病因及发病机理尚未完全阐明。自1994年Goyette将MTHFR基因定位以来，对MTHFR的研究不断深入。现已发现MTHFR基因有多种突变类型，不同的基因突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响，表现出各种不同的酶活性和热稳定性，提示MTHFR基因具有复杂的遗传异质性。叶酸摄入不足或叶酸代谢通路上酶的活性改变均可导致DNA甲基化异常或影响DNA的合成，从而影响基因组的稳定性以及癌基因和肿瘤抑癌基因的表达，而基因组不稳定性和癌基因、肿瘤抑癌基因的异常时肿瘤，包括大肠癌发生和发展的重要特征。在叶酸的代谢过程中，叶酸摄入后需经代谢转化才能发挥其生物学功能，而亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR）是叶酸代谢通路中的限速酶，可介导5，10-亚甲基四氢叶酸转变成5-甲基四氢叶酸，这个反应是不可逆的。5-甲基四氢叶酸提供甲基参与S-腺苷蛋氨酸（SAM）的合成，而SAM是体内生化反应中主要的甲基供体，其中包括DNA的甲基化反应。叶酸缺乏可导致SAM缺乏，引起基因组DNA低甲基化及抑癌基因启动子区高甲基化，从而引起肿瘤的发生。同型半胱氨酸是蛋氨酸循环的中间产物，叶酸缺乏引起S-腺苷同型半胱氨[2]酸升高，抑制DNA甲基转移酶的活性，引起DNA低甲基化。另一方面，9 研究论文MTHFR催化反应的底物5，10-亚甲基四氢叶酸与多个代谢通路如胸腺嘧啶及嘌呤合成有关，在DNA的合成过程中起着重要的作用。5，10-亚甲基四氢叶酸可被转化为10-甲酰四氢叶酸，后者为合成嘌呤所必需。同时它也可与胸腺嘧啶合成酶（thymidylatesynthase，TS）结合，为脱氧尿苷转化为脱氧胸苷提供甲基基团。脱氧尿苷转变成胸苷酸是DNA合成的限速步骤，对于DNA的动态平衡进而保持DNA合成的忠实性起着关键作用。目前已发现编码MTHFR的基因存在单核苷酸多态。MTHFR基因C677T是一个常见的不耐热错义突变。MTHFR基因第677位密码子胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置换，从而使一个高度保守的丙氨酸（Ala）变成了缬氨酸（Val），导致酶的耐热性下降，并降低酶的活性。在MTHFR基因上另一个多态性位点在第7外显子上，1298位点上的一个腺嘌呤（A）变异成为一个胞嘧啶（C），导致一个谷氨酸变异成为一个丙氨基团。发生A1298C变异的MTHFR酶活性也会降低，但是程度低于C677T变异，却[3]不会影响蛋白质的热稳定性。无论是纯合型或是杂合型的A1298C变异都不会出现血浆同型半胱氨酸升高或是血浆叶酸水平降低，在这一点上也[4]与C677T纯合型变异不同。国外有研究发现MTHFR基因C677T多态对高叶酸摄入人群的大肠癌[5]发生有保护作用，但该位点的多态性具有地域性，而且研究结果存在差[6-7]异。关于A1298C位点多态与大肠癌易感性关系的研究相对较少，且尚[5]未取得统一的结论。本研究首次选择河北省承德市作为研究地点，运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的技术，探讨MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的病例对照研究，为确定大肠癌的易感人群，制定早期防治措施和预后评价提供依据。材料与方法1材料：1.1标本选择及处理：随机收集大肠癌病例组120例（2010年8月至2011年6月就诊于承德医学院附属医院肿瘤科的患者）和对照者202例。其中120例大肠癌患者中男性64例，女性56例；年龄28-80岁，平均年龄61.98±9.26岁；分化程度：高10 研究论文分化腺癌26例，中低分化腺癌94例；组织学分型：管状腺癌50例，乳头状腺癌38例，黏液腺癌32例；有淋巴结转移的54例，无淋巴结转移的66例；Duke’sA期20例，Duke’sB期46例，Duke’sC期35例，Duke’sD期19例；饮酒情况：饮酒69例，不饮酒51例；吸烟情况：吸烟72例，不吸烟48例。在202例对照组中，男性112例，女性90例；年龄18-65岁，平均年龄45.46±9.59岁；饮酒情况：饮酒122例，不饮酒80例；吸烟情况：吸烟101例，不吸烟101例。以上研究对象均为河北省承德市及其周边区域的居民，且相互间无血缘关系。所有大肠癌病例组经临床资料和组织病理学检查确诊，对照组为同期住院病人，且排除肿瘤患者。以问卷调查和病历记录方法取得所有研究对象的有关资料。饮酒情况以调查对象每周饮酒一次或者一次以上，持续半年以上定义为饮酒。吸烟情况以研究对象每天吸烟一支以上，且持续半年以上者定义为吸烟。抽取120例患者术后、化疗前及202例对照者的外周静脉血2ml，置乙二胺四乙酸钠抗凝管，放-20℃冰箱保存备用。1.2主要仪器：京立LD4-2A离心机北京京力公司紫外可见分光光度计（DU800）BECKMANCOULTER公司CSR-1-30型超纯水机北京爱思泰克公司SIM-F124制冰机日本SANYO公司YXQG02型手提式电热压力蒸山东安得医疗科技有限公司汽消毒锅TDL-40B离心机上海安亭科学仪器制造厂SORVALLBiofugefresco冷冻德国离心机MDF-u4086s低温冰箱日本SANYO公司ESJ200-4电子天平沈阳龙腾电子有限公司液体快速混合器YKH-I型江西医疗器械厂HI98127酸度计HANNA公司10ul微量移液器Eppendorf公司20ul微量移液器Eppendorf公司50ul微量移液器Eppendorf公司200ul微量移液器Eppendorf公司11 研究论文1000μl微量移液器Eppendorf公司PCR仪（PTC-100）MJResearch公司PCR电泳仪（DYY-6B）购自北京六一厂SZX-B水域振荡器哈尔滨市东方电控开关厂紫外透射反射分析仪（ZF型）上海嘉鹏公司DYY-7型转移电泳仪北京市六一仪器厂1.3主要试剂：TIANampGenomicDNAKit天根生物技术有限公司（DNA提取试剂盒）DNAMarkerDL500大连宝生物生物技术有限公司琼脂糖西班牙（上海分装）引物上海生工生物工程有限公司溴化乙锭（EB）AMRESCO公司2×TaqMasterMix北京康为世纪生物技术有限公司HinfΙ内切酶Fermentas公司MboΙΙ内切酶Fermentas公司Tris碱日本Takara公司1.4主要溶液：1.4.10.5MEDTA(PH=8)：Na2EDTA/2H2O18.61g、蒸馏水70ml，溶解后用10MNaOH调节PH值至8.0，室温保存。1.4.210mg/ml的溴化乙锭(EB)：小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。1.4.3电泳缓冲液(5×TBE)：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA(PH=8)20ml，加双蒸水定容至1000ml，使用时加双蒸水稀释，工作液：0.5×TBE。1.4.410MNaOH：NaOH40g、蒸馏水45ml，溶解后加入蒸馏水定容到100ml。2方法：2.1外周静脉血液DNA提取：12 研究论文使用TIANampGenomicDNAKit抽提血液基因组DNA，具体操作步骤如下：准备工作：在GD液和PW液中加入无水乙醇，混匀。盖紧瓶盖保存，使用前必须使其温度达到室温。(1)在1.5ml离心管中加入200μl含抗凝剂的血液，再加入600μl的红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底混匀。(2)加入20μl蛋白酶k溶液，轻轻混匀。(3)加入200μlGB液，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内的水珠（如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯）。(4)加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。(6)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入600ul缓冲液PW（已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600ul缓冲液PW（已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。(11)测定DNA浓度。(12)保存于-20℃冰箱。13 研究论文2.2MTHFRC677T引物合成：［8］MTHFRC677T扩增引物按照文献合成，引物序列见下，PCR扩增后产物大小198bp。由上海生工生物工程有限公司合成。′′上游引物：5-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′′下游引物：5-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-32.3MTHFR基因C677T多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测MTHFR基因C677T基因型。2.3.1MTHFR基因C677T扩增与酶切：(1)PCR反应体系如下：TaqMasterMix10ul10umol/L(Primer1)1ul10umol/L(Primer2)1ul模板DNA2ulddH2O6ul总体积20ul注：TaqMasterMix含有TaqDNApolymerase、10×PCRbuffer、MgCl2和各10umol/LdNTP(2)PCR反应条件如下：94℃4min94℃30s14 研究论文62℃30s72℃30s72℃5min循环35次(3)PCR扩增产物酶切体系如下：PCRmixture10ulddH2O18ul10xBuffer2ulHinfΙ2ul总体积32ul轻轻混匀，并短暂离心。37℃消化3h，65℃20min灭活HinfΙ。2.3.2酶切产物结果判断：配置3%的琼脂糖凝胶(含2ul10mg/ml的溴化乙锭)，取10ul酶切产物，电压80v，电泳60min，取凝胶在紫外光下观察酶切条带，电泳条带仅出现198bp的为野生型C/C纯合子，出现175bp和23bp的为变异型T/T纯合子，同时出现198bp、175bp、23bp的为杂合子C/T基因型。因23bp片段太小，该条带在琼脂糖凝胶电泳下不可见。2.4MTHFRA1298C引物合成：［8］MTHFRA1298C扩增引物按照文献合成，引物序列见下，PCR扩增后产物大小56bp。由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5'-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3'下游引物：5'-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3'2.5MTHFR基因A1298C多态性分析：15 研究论文采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测MTHFR基因A1298C基因型。2.5.1MTHFR基因A1298C扩增与酶切：(1)PCR反应体系如下：TaqMasterMix10ulForwardPrimer1ulReversePrimer1ul模板DNA2ulddH2O6ul总体积20ul注：TaqMasterMix含有TaqDNApolymerase、10×PCRbuffer、MgCl2和各10umol/LdNTP(2)PCR反应条件如下：94℃2min94℃30s62℃30s72℃30s72℃2min16 研究论文循环34次(3)PCR扩增产物酶切体系如下：PCRmixture10ulddH2O18ul10xBuffer2ulMboΙΙ1.5ul总体积31.5ul轻轻混匀，并短暂离心。37℃消化3h，65℃20min灭活MboΙΙ。2.5.2酶切产物结果判断：配置4%的琼脂糖凝胶(含2ul10mg/ml的溴化乙锭)，取10ul酶切产物，电压80v，电泳80min，取凝胶在紫外光下观察酶切条带，电泳条带出现56bp、31bp、30bp、28bp、18bp的为野生型A/A纯合子，出现84bp、31bp、30bp、18bp的为变异型C/C纯合子，出现84bp、56bp、31bp、30bp、28bp、18bp的为杂合子A/C基因型。因31bp、30bp、28bp、18bp片段太小，该条带在琼脂糖凝胶电泳下不可见。3.0统计学分析：2采用x检验对照组与大肠癌组人群各基因型分布是否符合2Hardy-Weinberg遗传平衡，从而确定样本群体的代表性。采用x检验，对大肠癌组和对照组的一般资料（性别、年龄、吸烟、饮酒）及两组基因型和等位基因频率的分布进行比较，以非条件Logistic回归法计算表示相对危险度的比值比（OR）及其95％的可信区间（CI），OR值均经性别、年龄、吸烟、饮酒等因素校正，所有统计分析均采用SPSS11.5统计软件进行。结果17 研究论文1.1MTHFR基因C677T多态性电泳结果：MTHFR基因C677T经内切酶HinfΙ消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，呈现三种基因型，如（图1）所示，第1泳道为纯合子野生型C/C（198bp），第2及第3泳道为纯合子突变型T/T（175bp和23bp），第4及第5泳道为杂合子型C/T（198bp、175bp和23bp），由于23bp片段太小，电泳后不能显示此条带。1.2MTHFR基因A1298C多态性电泳结果：MTHFR基因A1298C经内切酶MboΙΙ消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，呈现三种基因型，如（图2）所示，第1泳道为纯合子突变型C/C（84bp、31bp、30bp和18bp），第2及第3泳道为杂合子型A/C（84bp、56bp、31bp、30bp、28bp和18bp），第4及第5泳道为纯合子野生型A/A（56bp、31bp、30bp、28bp和18bp），由于31bp、30bp、28bp和18bp片段太小，电泳后不能显示此条带。1.3遗传平衡性检验：为了了解大肠癌组和对照组在人群中是否具有代表性，将大肠癌组和对照组的MTHFRC677T基因型分布频率进行了Hardy-Weinberg遗传平衡检验。根据观察到C、T等位基因频率计算出预期基因型频率，然后与实际值进行卡方检验。如（表1）所示大肠癌组和对照组中MTHFRC677T预期值与实际值分布都无统计学差异（P＞0.05），表明大肠癌组和对照组中MTHFRC677T基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，大肠癌组和对照组样本均具有群体代表性。同样，大肠癌组和对照组MTHFRA1298C基因型频率也均符合遗传平衡（P＞0.05）（表2）。1.4大肠癌（CRC）组与对照组一般资料比较：在120例大肠癌组与202例对照组中，大肠癌组平均年龄61.98±9.26岁（年龄范围28-80岁），其中男性占53.3％；对照组平均年龄45.46±9.59岁（年龄范围18-65岁），其中男性占55.4％，两组人群在性别构成差异无显著意义（P＞0.05），年龄构成差异有显著意义（P＜0.01）。大肠癌组吸烟72例，不吸烟48例，饮酒69例，不饮酒51例；对照组中吸烟101例，不吸烟101例，饮酒122例，不饮酒80例，两组人群在吸烟及饮酒构成差异无显著意义（P＞0.05）（表3）。1.5.1MTHFRC677T基因型频率比较：18 研究论文MTHFR基因C677TC/C、C/T和T/T基因型分布频率在大肠癌组分别为45.0%，46.7%，8.3%，对照组分别为32.7%，47.5%，19.8%，两组之间2的基因型频率分布差异有显著性（x=9.46，P＜0.01）；MTHFR基因C677TC等位基因与T等位基因分布频率在大肠癌组分别为68.3%和31.7%，对照组分别为56.4%和43.6%，两组之间的等位基因频率分布差异有显著性2（x=8.95，P＜0.01）（表4）。1.5.2MTHFR基因C677T多态与大肠癌风险的关系：与C677TC等位基因相比，C677TT等位基因的大肠癌风险显著降低（aOR：0.57，95％CI：0.40-0.81，P＜0.01)。与C/C纯合子相比，T/T纯合子的大肠癌风险显著降低至0.28倍（95％CI：0.12-0.63，P＜0.01），差异有统计学意义，提示其为大肠癌的保护因素；CT杂合子的大肠癌风险降低至0.64倍（95％CI：0.37-1.08，P＞0.05），差异无统计学意义（表5）。1.5.3饮酒在MTHFR基因C677T多态性与大肠癌风险关系中的作用：在不饮酒的人群中，与C677TC等位基因相比，C677TT等位基因的大肠癌风险显著降低（aOR：0.44，95％CI：0.25-0.76，P＜0.01）；与C/C纯合子相比，C/T杂合子和T/T纯合子的大肠癌发病风险分别降低至0.41倍（95％CI：0.17-0.95，P＜0.05)和0.26倍（95％CI：0.09-0.78，P＜0.05)，差异有统计学意义。而在饮酒人群中，与C677TC等位基因相比，C677TT等位基因的大肠癌风险降低（aOR：0.68，95％CI：0.43-1.09，P＞0.05）；与C/C纯合子相比，C/T杂合子和T/T纯合子的大肠癌发病风险分别降低至0.86倍（95％CI：0.43-1.72，P＞0.05)和0.29倍（95％CI：0.08-1.00，P＞0.05)，差异无统计学意义。（表6）。1.5.4MTHFR基因C677T多态与大肠癌临床病理特征的关系：MTHFR基因C677T多态与大肠癌的肿瘤大小、位置、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Duke's分期均无显著性相关(P＞0.05)(表7)。1.6.1MTHFRA1298C基因型频率比较：MTHFR基因A1298CA/A、A/C和C/C基因型分布频率在大肠癌组分别为64.2%，32.5%，3.3%，对照组分别为62.9%，31.2%，5.9%，两组之间2的基因型频率分布差异无显著性（x=1.09，P＞0.05）；MTHFR基因A1298CA等位基因与C等位基因分布频率在大肠癌组分别为80.4%和19.6%，对照组分别为78.5%和21.5%，两组之间的等位基因频率分布差异无显著性19 研究论文2（x=0.35，P＞0.05）（表8）。1.6.2MTHFR基因A1298C多态与大肠癌风险的关系：与A1298CA等位基因相比，A1298CC等位基因的大肠癌风险降低至0.91倍（95％CI：0.60-1.39，P＞0.05)。与A/A纯合子相比，C/C纯合子的大肠癌风险降低至0.63倍（95％CI：0.19-2.09，P＞0.05)，A/C杂合子的大肠癌风险升高至1.03倍（95％CI：0.61-1.73，P＞0.05），差异无统计学意义（表9）。1.6.3饮酒在MTHFR基因A1298C多态性与大肠癌风险关系中的作用：在不饮酒的人群中，与A1298CA等位基因相比，A1298CC等位基因的大肠癌风险升高（aOR：1.01，95％CI：0.25-0.76，P＞0.05)；与A/A纯合子相比，A/C杂合子和C/C纯合子的大肠癌发病风险分别降低至0.90倍（95％CI：0.39-2.04，P＞0.05）和升高至1.19倍（95％CI：0.29-4.94，P＞0.05)，差异无统计学意义。而在饮酒人群中，与A1298CA等位基因相比，A1298CC等位基因的大肠癌风险升高（aOR：0.84，95％CI：0.47-1.49，P＞0.05)；与A/A纯合子相比，A/C杂合子的大肠癌发病风险升高至1.11倍（95％CI：0.56-2.23，P＞0.05），差异无统计学意义（表10）。1.6.4MTHFR基因A1298C多态与大肠癌临床病理特征的关系：MTHFR基因A1298C多态与大肠癌的肿瘤大小、位置、分化程度、淋巴结转移及Duke's分期均无显著性相关(P＞0.05)(表11)。1.7.1MTHFR基因C677T和A1298C多态联合基因型频率比较同时携带MTHFR基因CC/AA(C677TC/C和A1298CA/A)和TT/AA(C677TT/T和A1298CA/A)基因型分布频率在大肠癌组分别为31.7%，6.7%，对照组分别为19.8%，18.3%，两组之间的基因型频率分布差异有2显著性（x=11.67，P＜0.01）（表12）。1.7.2MTHFR基因C677T和A1298C多态联合作用与大肠癌的易感性：与携带MTHFRC677TC/C和A1298CA/A基因型者相比，携带C677TT/T和A1298CA/A基因型发生大肠癌的危险性显著降低，差异有统计学意义（aOR：0.22，95％CI：0.09-0.57，P＜0.01)（表13）。20 研究论文附图M12345Fig.1.TheresultofPCR-RFLPforMTHFRC677Tpolymorphism(PCR-RFLPresultsoftheMTHFRC677Tpolymorphismincolorectalcarcinoma.Lane1showsC/CgenotypefortheC677Tpolymorphism.Lane2and3showT/TgenotypefortheC677TpolymorphisminMTHFR.Lane4and5showC/TgenotypefortheC677TpolymorphisminMTHFR).21 研究论文M12345Fig.2.TheresultofPCR-RFLPforMTHFRA1298Cpolymorphism(PCR-RFLPresultsoftheMTHFRA1298Cpolymorphismincolorectalcarcinoma.Lane1showsC/CgenotypefortheA1298Cpolymorphism.Lane2and3showA/CgenotypefortheA1298CpolymorphisminMTHFR.Lane4and5showA/AgenotypefortheA1298CpolymorphisminMTHFR.)22 研究论文附表Tab.1Hardy-WeinbergequilibriumofMTHFRC677TgenotypeCRCControlsgenotypeobservedexpectedPobservedexpectedPCC48486664CT5656>0.059699>0.05TT16164039Tab.2Hardy-WeinbergequilibriumofMTHFRA1298CgenotypeCRCControlsgenotypeobservedexpectedPobservedexpectedPAA7778127125AC3938>0.056368>0.05CC44129Tab.3FrequencydistributionsofselectedvariablesintheCRCcasesandcontrols2CRCControlsxPItemsMales64(53.3)112(55.4)Gender0.14>0.05Females56(46.7)90(44.6)<4013(10.8)50(24.8)Age(years)40-6065(54.2)116(57.4)16.77<0.01>6042(35.0)36(17.8)smoker72(60.0)101(50.0)Smoking3.03>0.05Non-smoker48(40.0)101(50.0)drinker69(57.5)122(60.4)Drinking0.27>0.05Non-drinker51(42.5)80(39.6)23 研究论文Tab.4GenotypeandallelefrequenciesofMTHFRC677TintheCRCcasesandcontrols2MTHFRC677TCRCControlsxPCC54(45.0)66(32.7)genotypeCT56(46.7)96(47.5)9.46<0.01TT10(8.3)40(19.8)C164(68.3)228(56.4)Theallele8.95<0.01T76(31.7)176(43.6)Tab.5MTHFRgeneC677TpolymorphismandtheriskofCRCMTHFRC677TCRCControlsaOR(95%CI)CC54(45.0)66(32.7)1.00#genotypeCT56(46.7)96(47.5)0.64(0.37-1.08)&TT10(8.3)40(19.8)0.28(0.12-0.63)C164(68.3)228(56.4)1.00ThealleleT*76(31.7)176(43.6)0.57(0.40-0.81)与CC基因型比较：#P＞0.05，&P＜0.01；与C等位基因比较：*P＜0.01ORswereadjustedforgender,age,smoking,alcoholdrinkingconsumption.24 研究论文Tab.6TheeffectofAlcoholdrinkinginMTHFRgeneC677TpolymorphismandtheriskofCRCNon-drinkerDrinkerMTHFRaORaORC677TCRCControlsPCRCControlsP(95％CI)(95％CI)genotype27242742CC1.001.00(52.9)(30.0)(39.1)(34.4)18370.4138590.86CT<0.05>0.05(35.3)(46.3)(0.17-0.95)(55.1)(48.4)(0.43-1.72)6190.264210.29TT<0.05>0.05(11.8)(23.7)(0.08-0.78)(5.8)(17.2)(0.08-1.00)allele728592143C1.001.00(70.6)(53.1)(66.7)(58.6)30750.44461010.68T<0.01>0.05(29.4)(46.9)(0.25-0.76)(33.3)(41.4)(0.43-1.09)ORswereadjustedforgender,age,smokingconsumption.25 研究论文Tab.7RelationofMTHFRC677TgenotypeandClinicalPathologicfeaturesMTHFRC677TgenotypeClinicalpathologicfeaturesPCCCTTT≤429(46.8)30(48.4)3(4.8)Size(cm)>0.05＞425(43.1)26(44.8)7(12.1)Rectum30(45.5)31(46.9)5(7.6)Location>0.05Colon24(44.4)25(46.3)5(9.3)High14(53.8)10(38.5)2(7.7)Differentiation>0.05Moderatelyandlow40(42.6)46(48.9)8(8.5)Tubularadenocarcinoma24(48.0)22(44.0)4(8.0)HistologicalPapillaryadenocarcinoma16(42.1)17(44.7)5(13.2)>0.05typeMucinousadenocarcinoma14(43.8)17(53.1)1(3.1)LymphnodeNon30(45.5)29(43.9)7(10.6)>0.05metastasisMetastasis24(44.4)27(50.0)3(5.6)A9(45.0)10(50.0)1(5.0)B19(41.3)21(45.7)6(13.0)Duke'sstage>0.05C16(45.7)16(45.7)3(8.6)D10(52.6)9(47.4)0(0.0)Tab.8GenotypeandallelefrequenciesofMTHFRA1298CintheCRCcasesandcontrols2MTHFRA1298CCRCControlsxPAA77(64.2)127(62.9)genotypeAC39(32.5)63(31.2)1.09>0.05CC4(3.3)12(5.9)A193(80.4)317(78.5)Theallele0.35>0.05C47(19.6)87(21.5)26 研究论文Tab.9MTHFRgeneA1298CpolymorphismandtheriskofCRCMTHFRA1298CCRCControlsaOR(95%CI)AA77(64.2)127(62.9)1.00#genotypeAC39(32.5)63(31.2)1.03(0.61-1.73)#CC4(3.3)12(5.9)0.63(0.19-2.09)A193(80.4)317(78.5)1.00ThealleleC*47(19.6)87(21.5)0.91(0.60-1.39)与AA基因型比较：#P＞0.05，与A等位基因比较：*P＞0.05ORswereadjustedforgender,age,smoking,alcoholdrinkingconsumption.Tab.10TheeffectofAlcoholdrinkinginMTHFRgeneA1298CpolymorphismandtheriskofCRCNon-drinkerDrinkerMTHFRaORaORA1298CCRCControlsPCRCControlsP(95％CI)(95％CI)genotype32504577AA1.001.00(62.7)(62.5)(62.5)(63.1)15250.9024380.86AC>0.05>0.05(29.4)(31.3)(0.39-2.04)(34.8)(31.1)(0.56-2.23)451.1907CC>0.05(7.9)(6.2)(0.29-4.94)(0.0)(5.8)allele79125114192A1.001.00(77.5)(78.1)(82.6)(78.7)>0.05>0.0523351.0124520.84C(22.5)(21.9)(0.25-0.76)(17.4)(21.3)(0.47-1.49)ORswereadjustedforgender,age,smokingconsumption.27 研究论文Tab.11RelationofMTHFRA1298CgenotypeandClinicalPathologicfeaturesMTHFRA1298CgenotypeClinicalpathologicfeaturesPAAACCC≤439(62.9)22(35.5)1(1.6)Size(cm)>0.05＞438(65.5)17(29.3)3(5.2)Rectum44(66.7)20(30.3)2(3.0)Location>0.05Colon33(61.1)19(35.2)2(3.7)High17(65.4)8(30.8)1(3.8)Differentiation>0.05Moderatelyorlow60(63.8)31(33.0)3(3.2)LymphnodeNon40(60.6)23(34.8)3(4.6)>0.05metastasisMetastasis37(68.5)16(29.6)1(1.9)A10(50.0)9(45.0)1(5.0)B31(67.4)14(30.4)1(2.2)Duke'sstage>0.05C20(57.1)14(40.0)1(2.9)D16(84.2)2(10.5)1(5.3)Tab.12CombinedgenotypedistributionforMTHFRC677TandA1298CpolymorphismsinCRCcasesandcontrolsMTHFRMTHFRCRCControls2XPC677TA1298C(n=120)(n=202)CCAA38(31.7)40(19.8)——CCAC12(10.0)14(6.9)0.05>0.05CCCC4(3.3)12(5.9)3.02>0.05CTAA31(25.8)50(24.8)1.77>0.05CTAC25(20.8)46(22.8)2.78>0.05CTCC0(0.0)0(0.0)——TTAA8(6.7)37(18.3)11.67<0.01TTAC2(1.7)3(1.5)0.14>0.05TTCC0(0.0)0(0.0)——28 研究论文Tab.13InteractionsofMTHFRgeneC677TandA1298CpolymorphismsandtheriskofCRCMTHFRMTHFRCRCControlsaOR(95％CI)PC677TA1298C(n=120)(n=202)CCAA38(31.7)40(19.8)1.00CCAC12(10.0)14(6.9)0.94(0.36-2.46)>0.05CCCC4(3.3)12(5.9)0.37(0.10-1.34)>0.05CTAA31(25.8)50(24.8)0.56(0.28-1.09)>0.05CTAC25(20.8)46(22.8)0.49(0.23-1.01)>0.05CTCC0(0.0)0(0.0)——TTAA8(6.7)37(18.3)0.22(0.09-0.57)<0.01TTAC2(1.7)3(1.5)0.59(0.09-3.96)>0.05TTCC0(0.0)0(0.0)——ORswereadjustedforgender,age,smoking,alcoholdrinkingconsumption.29 研究论文讨论大肠癌是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康，在北美欧洲各国，大肠癌的死亡率占全部癌症死亡原因的第2位。在我国，随着国民生活水平的提高，生活节奏的加快，大肠癌的发病率呈逐年升高趋势。随着分子生物学技术的发展，同时存在的分子事件基因表达亦渐被认识，从中明确癌的发生发展是一个多步骤、多阶段及多基因参与的疾病。大肠癌病因虽未明确，但其相关的高危因素渐被认识，如过多的动物脂肪及动物蛋白饮食，缺乏新鲜蔬菜及纤维素食品，缺乏适当的体力活动。目前遗传易感性在大肠癌的发病中也具有重要地位，大肠癌时从细胞向癌变演进约经历10-15年，在此癌变过程中，具有较明显的早期阶段病变，为早期诊断提供了可能。目前已经证明，许多基因及细胞因子在大肠癌的演进过程中发挥重要作用。近年来，随着分子生物学技术的更新，为个体基因分型提供了快捷的手段，使得MTHFR基因多态性与大肠癌的研究有了许多进展，并以此作为特异的生物学指标用于筛选和保护易感人群，为实现个性化预防提供可能。本研究采用以医院为基础的病例对照研究设计，分析MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系，探讨MTHFR基因多态性在大肠癌的发生、发展阶段作用如何。一、MTHFR基因1988年，Kang首先发现一种不耐热、低活性的MTHFR变异体。1991年发现不耐热的MTHFR呈常染色体隐性遗传。此后研究发现不耐热的MTHFR在结、直肠癌的发病过程中起一定作用。1994年，Goyette首次用cDNA技术将人类MTHFR基因成功克隆并定位。MTHFR基因位于染色体1p36.3，整个编码区长1980bp，编码蛋白的分子量为74.6kDa。cDNA序列长2.2kb，包含11个外显子，长度102-432bp，内含子250bp-1.5kb。由此可见MTHFR在生物群体中是一个原始的、保守的、有重要功能的基因。MTHFR基因最常见的C677TC-T和A1298CA-C突变，不同基因型可能造成对MTHFR的活性降低，一方面，MTHFR是叶酸代谢过程中复甲基化的一个关键酶，它催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应，生成5-甲基四氢叶酸作为叶酸复甲基化的甲基供体，在甲30 研究论文硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中同型半胱氨酸再发生甲基化，生成蛋氨酸（甲硫氨酸），从而维持血浆同型半胱氨酸的正常水平。另一方面，MTHFR还是组织和血清叶酸的主要形式，参与体内多种重要的生化反应（如嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成等），并为DNA、RNA和蛋白质的甲基化提供甲基，从而影响正常的DNA代谢。如果MTHFR催化反应过程发生障碍，将会导致5-甲基四氢叶酸生成减少，Hcy代谢障碍并在血液中蓄积。这两个代谢过程对于机体极其重要，若这两个代谢过程出现异常并长期存在，则很有可能导致癌变。1MTHFRC677T突变在MTHFR基因上最普通的一个变异是在第4外显子，677位点上。一个胞嘧啶（C）变异成为一个胸腺嘧啶（T），[9-10]引起了一个丙氨酸替换缬氨酸的变异，导致酶的活性降低，且作为衡[11]量编码酶活性的指标-耐热性降低到了37℃。Frosst等人的研究表明，MTHFRC677TC/T杂合子编码产物的活性约为野生型纯合子C/C的65％，而突变性纯合子T/T仅有30％的活性。现有的资料表明，MTHFR基因C677TC-T突变频率在不同国家、同一国家不同地区及同一地区不同民族的分布有显著差异。欧洲人C677TT等位基因频率在22%-44%之间，其中意大利人较高，为44%，且C677TT/T纯合子频率达18%。非洲撒哈拉地区黑人C677TT等位基因频率为7%，且未发现有纯合突变。而居住在巴西、美国的非洲人后裔其C677TT等位基因频率在5%-24%不等。亚［12］洲人中，日本人C677TT等位基因频率为34%。于佳梅等对中国5个民族MTHFR基因多态性进行了研究，结果汉族人C677TT等位基因频率为40%，达斡尔族人为45%，认为亚洲人MTHFR基因677C-T突变频率偏高。本研究MTHFRC677TT突变基因的频率为43.6%。2MTHFRA1298C突变在MTHFR基因上另一个多态性位点在第7外显子上，1298位点上的一个腺嘌呤（A）变异成为一个胞嘧啶（C），导致一个谷氨酸变异成为一个丙氨基团。发生A1298C变异的MTHFR酶活性也会降低，但是程度低于C677T变异，却不会影响蛋白质的热稳定[3]性。无论是纯合型或是杂合型的A1298C变异都不会出现血浆同型半胱氨酸升高或是血浆叶酸水平降低，在这一点上也与C677TT/T纯合型变异[4]不同。相对于C677T位点，A1298CC突变基因在人群中分布的研究较少。以往的研究显示：A1298CC等位基因频率在亚洲人为17%-19%，西31 研究论文欧为27%-36%，非洲为39%。A1298CC等位基因频率在南美洲的资料较少。中国北方汉族为20%，少数民族为8%-9%，贵州荔波汉族、布依族和苗族分别为28.9%、16.1%，10.6%。对于C677TC-T/A1298CA-C复合[13]突变，加拿大人突变频率为15%，荷兰人为20%，美国人为7%。本研究MTHFRA1298CC突变基因的频率为21.5%。二、MTHFR基因多态性与大肠癌的关系研究证实，MTHFR基因是多态的，存在于密码子677C→T和［14-17］1298A→C的变化，与大肠癌关系密切。并且MTHFR基因多态性，［18-20］可能是很多肿瘤发生的遗传易感性因素。近年来关于MTHFR基因多态性与肿瘤易感性关系的研究日趋增多，并取得了一些成果，但与大肠[7]癌易感性关系的研究国内外尚无统一结论。Haghighi等研究伊朗人群MTHFRC677T基因型与非家族性结直肠癌的关系，发现C677TT/T基因型与结直肠癌的危险性呈负相关，特别是对血清中存在高水平叶酸的患[21][22]者。Levine等的研究也得出相似的结果。Hubner等还对25个人群MTHFRC677T基因型与大肠癌的关系进行Meta分析，结果表明：与C/C基因型相比，MTHFRC677TT/T基因型与大肠癌的危险性降低有关。但[23]是，Delgado-Enciso等在墨西哥人群中的研究结果显示，C677TT是大肠癌的危险等位基因。对于A1298C位点与大肠癌的研究相对较少，国内[24]朱凡等的研究表明MTHFR基因A1298C多态不是大肠癌的易感性因[25]素。俞晓静等对MTHFR基因多态性与结直肠癌易感性的Meta分析表明，1298位点与结直肠癌的易感性存在相关，C/C基因型可能是结直肠[26]癌的低危因素。Huang等对MTHFR多态性与大肠癌和腺瘤的关系进行Meta分析，结果亦未能证明C677T和A1298C与大肠癌有关。Murtaugh[27]等通过病例对照研究表明，叶酸摄入与直肠癌危险性的降低有关，1298C/C基因型起保护作用。本研究结果显示：大肠癌组和对照组之间的MTHFRC677T基因型分布频率和等位基因频率差异有统计学意义；MTHFR基因C677T多态与大肠癌的易感性有显著相关，T/T纯合子为大肠癌的保护因素，可以降低大肠癌的发病风险。大肠癌组和对照组之间的MTHFRA1298C基因型分布频率和等位基因频率差异无统计学意义；MTHFR基因A1298C多态与大肠癌的易感性无显著相关。MTHFR基因变异C677TT/T增高大肠癌风险32 研究论文的机制可能与其引起的DNA低甲基化有关。按照基因组低甲基化的理论来看，携带MTHFRC677TT/T基因型者结直肠癌的发病率应升高，然而很多研究及本研究显示C677TT/T基因型比野生C677TC/C基因型患结直肠癌的风险降低，目前认为这可能是通过影响DNA的合成而发挥作用。5，10-MTHFR提供1个甲基给脱氧尿嘧啶，将之转变为胸腺嘧啶，参与DNA的合成。5，10-MTHFR缺乏，胸苷酸合成不足导致尿嘧啶错配入DNA。在正常情况下，DNA修复酶会将错配的尿嘧啶去除，如果叶酸缺乏持续存在错配和修复可导致DNA双链的断裂，最终导致染色体损伤及细胞恶性转化。野生型的MTHFR酶活性较高，使较多的5，10-MTHFR被转化为5-甲基四氢叶酸，减少合成胸苷酸所需的5，10-MTHFR的量，导致较多的尿嘧啶错配入DNA，而携带MTHFRC677TT/T者体内5，10-MTHF水平较高，减少DNA合成过程中尿嘧啶的错配，从而降低结直肠癌的发生。叶酸摄取充分时，MTHFRC677TT/T纯合子倾向于增加细胞内5，10-MTHF的浓度。然而当叶酸水平缺乏时，C677TT/T基因型可能就是有害的了，因为低叶酸时C677TT/T基因型既降低DNA甲基化，同时用于DNA合成的5，10-MTHF也不足，因此可能失去保护作用，进一步说明了叶酸摄入在不同的MTHFR基因型，其作用是不同的。三、饮酒因素在MTHFR基因多态性与大肠癌易感性关系中的作用本研究结果显示：饮酒可削弱甚至拮抗MTHFR基因C677TT/T基因型的大肠癌风险保护效应。未发现饮酒在MTHFR基因A1298C多态与大肠癌易感性的关系中有显著作用。由于大肠癌组和对照组没有确切的饮酒[28]年数资料，因此无法分析累积饮酒量对大肠癌风险的影响。国外Ma等对饮酒的半定量分析结果标明，以携带C677TC/C基因型的少量或不饮酒为参照，携带C677TT/T基因型的少量或不饮酒者、中量饮酒者和大量[29]饮酒者的结直肠癌发病风险分别降低7倍、1倍和不降低。类似的，Chen等报道，每周饮酒5次或5次以上可拮抗C677TT/T基因型的结直肠癌风险保护效应。这些研究结果及本结果均提示，饮酒可削弱甚至拮抗C677TT/T基因型的结直肠癌风险保护效应。酒精之所以能增高大肠癌的发病风险，因为酒精是影响叶酸代谢的一个重要因素。酒精使小肠吸收叶酸及肝脏摄取叶酸减少，并增加肾脏排泄叶酸，另外乙醇到达小肠黏膜后，由小肠中的微生物转变为乙醛，乙醛能33 研究论文分解叶酸，导致小肠黏膜的叶酸被消耗，引起体内叶酸缺乏。研究发现叶酸低及饮酒多的结直肠癌患者抑癌基因启动子区高甲基化的程度较叶酸高而饮酒少者高，提示低叶酸和饮酒可能与抑癌基因启动子区高甲基化有[30]关，参与结直肠肿瘤的形成。四、MTHFR基因多态性与大肠癌肿瘤特征本研究结果显示：MTHFR基因C677T多态与大肠癌肿瘤大小、位置、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Duke's分期均无显著性相关（P＞0.05）。MTHFR基因A1298C多态与大肠癌肿瘤大小、位置、分化程度、淋巴结转移及Duke's分期均无显著性相关（P＞0.05）。说明MTHFR基因多态性[31]与大肠癌肿瘤进展无关。但金夏祥等报道，T/T基因型与肿瘤大小（＞4cm）[32]和组织学类型（黏液腺癌）有关。Odin等研究认为677T携带者与大肠癌复发有关。关于MTHFR基因多态性与大肠癌临床病理特征的研究，国内外报道很少，本研究仅限于承德地区人群，由于MTHFR基因多态性受地域、种族、叶酸摄入水平及样本量的影响，因此，MTHFR基因C677T和A1298C多态性与其它地区大肠癌的临床病理特征关系有待于进一步的研究。五、MTHFRC677T和A1298C联合作用与大肠癌的关系本研究结果显示，同时携带MTHFR基因CC/AA(C677TC/C和A1298CA/A)和TT/AA(C677TT/T和A1298CA/A)在大肠癌组和对照组2的基因型频率分布差异有显著性（x=11.67，P＜0.01）。与携带MTHFRC677TC/C和A1298CA/A基因型相比，携带C677TT/T和A1298CA/A基因型发生大肠癌的危险性降低（aOR：0.22，95％CI：0.09-0.57，P＜0.01)，提示MTHFR基因C677TT/T与A1298CA/A多态在对大肠癌易感性的影响中有协同作用，降低大肠癌的发病风险。[33]国内高长明等的研究结果认为，MTHFRC677TT/T与A1298CA/A多态在对男性结直肠癌的易感性的影响有协同作用，可以降低直肠癌的发[34]病风险，升高结肠癌的发病风险。另外张艳玲等对MTHFRC677T和A1298C多态性进行了检测，结果表明：MTHFR677C/T和1298A/C组合型基因是结直肠癌的危险因素。本研究中与携带MTHFRC677TC/C和A1298CA/A基因型相比，677C/T和1298A/C基因型发生大肠癌的风险性降低（aOR：0.49，95％CI：0.23-1.01，P＞0.05)，差异无统计学意义。研34 研究论文究表明，只有T/T基因型者叶酸摄入水平低才能导致DNA的甲基化，其理由是发现那些C/T或A/C基因型的个体即使叶酸低下也没发生DNA低甲基[35]化。因此关于MTHFR基因多态之间如何联合作用导致大肠癌易感性降低有待于分析叶酸摄入水平进一步研究。国内外对MTHFR基因多态性研究的结论不一致，可能有以下几点原因：第一，研究人群的地域及种族不同，这使所研究的基因多态的基因频率有很大差别，导致研究论文的不一致。第二，不同研究对象的饮食叶酸摄入水平不一致，研究表明，MTHFR基因多态性与肿瘤易感性的关系受饮食叶酸摄入水平的影响。第三，不同研究对象人群中环境因素存在差别，如吸烟史、饮酒史等。第四，对于单核苷酸多态的病例对照研究，样本量的多少很重要，由于所研究人群的样本量不同，统计学效力亦有不同。本研究尚有一些局限性，首先，未进行饮食叶酸及其他甲基营养素摄入水平的调查，这使得在统计学分析中无法判断叶酸摄入水平与MTHFR基因多态的交互作用。由于MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系受饮食叶酸摄入水平的影响，这可能使研究结果受到一定的影响，这可能对实验结果造成影响。最后，相对少的样本量，同样有可能影响最终的统计学结果。今后进一步探讨MTHFR基因多态性与大肠癌易感性的关系，有必要加大样本量并且研究MTHFR基因多态与蛋氨酸、同型半胱氨酸、叶酸及其他甲基营养素摄入量之间的交互作用。35 研究论文结论1.MTHFR基因C677T多态与大肠癌的易感性有显著相关，C677TT/T基因型可降低大肠癌风险，是承德地区人群患大肠癌的一个遗传保护因素，可作为本地区人群大肠癌发病风险的筛选指标；同时饮酒可削弱C677TT/T基因型的大肠癌风险保护效应；MTHFR基因C677T多态与大肠癌临床病理特征无相关性。2.MTHFR基因A1298C多态与大肠癌的易感性无显著相关。MTHFR基因A1298C多态与大肠癌临床病理特征无相关性。3.MTHFR基因C677TT/T与A1298CA/A多态在对大肠癌易感性的影响中有协同作用，降低大肠癌的发病风险。36 研究论文参考文献[1]徐永成,许岸高.大肠癌的流行病学和病因研究[J].医学综述,2005,11(7):615-616.[2]ShannonB,GnanasampanthanS,BeilbyJ,eta1.Apolymorphisminthemethylenetetrahydrofolatereductasegenepredisposestocolorectalcancerswithmicrosatelliteinstability[J].Gut,2002,50(4):520-524.[3]SiemianowiczK,GminskiJ,GarczorzW,etal.MethylenetetrahydrofolatereductasegeneC677TandA1298Cpolymorphismsinpatientswithsmallcellandnonsmallcelllungcancer[J].OncolRep,2003,10(5):1341-1344.[4]JengYL,WuMH,HuangHB,etal.Themethylenetetrahydrofolatereductase677C→TpolymorphismandlungcancerriskinaChinesepopulation[J].AnticancerRes,2003,23(6D):5149-5152.[5]KonoS,ChenK.GeneticpolymorphismsofMethylenetetrahydrofolatereductaseandcolorectalcancerandadenoma[J].CancerSci,2005,96(9):535-542.[6]FernandezPeraltaAM,DamielL,NejdaN,etal.AssociationofpolymorphismsMTHFRC677TandA1298Cwithriskofcolorectalcancergeneticandepigeneticcharacteristicoftumorsandresponsetochemotherapy[J].IntJColorectalDis,2010,25(2):141-151.[7]HaghighimM,RadpourR,MahmoudIT,etal.AssociationbetweenMTHFRpolymorphism(C677T)withnorfamilialcolorectalcancer[J].OncolRes,2009,18(2/3):57-63.[8]BannisterAJ,ZegermanP,PartridgeJF,etal.Selectiverecognitionofmethylatedlysine9onhistoneH3bytheHP1chromodomain[J].Nature,2001,410(6824):120-124.[9]GuentherBD,SheppardCA,TranP,etal.ThestructureandpropertiesofmethylenetetrahydrofolatereductasefromEscherichiacolisuggesthowfolateameliorateshumanhyperhomocysteinemia[J].NatStructBiol,1999,6(4):359-365.[10]GoyetteP,PaiA,MilosR,etal.Genestructureofhumanandmouse37 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综述综述MTHFR基因多态性及其与大肠癌的相关性研究大肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，近几年来在我国特别是大城市有上升趋势。流行病学研究表明，环境因素约占大肠癌归因危险度的80%，主要与高脂肪、高热量、低纤维素饮食及少体力活动等因素有关；约20%左右的大肠癌归因危险度则与遗传背景有关，不良的饮食习惯、吸烟、及环境致癌因素等均可能是大肠癌的主要危险因素。大肠癌的发生是一个多因素多步骤的过程，是机体的内因与环境的外因交互作用的结果。但是，并非所有暴露于上述危险因素的个体均患大肠癌，说明个体之间存在遗传易感性的差异。研究结果显示，叶酸摄入过低或合成减少是大肠癌的危险因素之一。叶酸是人体重要的必需营养素，参与细胞内DNA甲基化和核苷酸合成过程，因此，叶酸缺乏可破坏DNA的正常甲基化，影响DNA合成及修复，增加细胞癌变的发生率，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢通路中的关键酶，可介导5，10-亚甲基四氢叶酸转变成叶酸的主要形式5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）。所以MTHFR的活性直接影响人体内叶酸的浓度，而MTHFR基因多态性正影响了该酶的活性。1MTHFR的生物学活性及其基因结构1.1MTHFR在叶酸代谢中的作用叶酸作为B族维生素之一，其主要生理功能是在生化反应中转移一碳单位即某些氨基酸在分解过程中产生的含有一个碳原子的基团，如甲基、亚甲基、次甲基等，为核苷酸单位从头合成DNA和RNA提供一碳单位。当普通饮食中甲基基团的含量不能满足细胞内正常代谢的需要时，甲基基团就通过叶酸中带有的一碳单位获取，以5-MTHF形式存在的叶酸在蛋白质转变为S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）中起重要作用，而SAM是DNA甲基化作用最重要的甲基提供者。叶酸缺乏时，其主要的循环形式5-MTHF水平低下，SAM很快就处于耗竭状态，导致DNA中胞嘧啶的甲基化减少。叶酸所提供的一碳单位对于嘧啶、胸核苷酸和嘌呤的从头合成途径至关重要。在哺乳动物细胞中，从脱氧尿苷合成胸核苷酸是DNA合成的限速步骤，需要5，10-MTHF作为辅酶。当41 综述饮食中叶酸不足而导致甲基基团匮乏时，生物的甲基化和核苷酸的合成竞争叶酸的辅助作用，SAM的浓度降低，代偿机制使5，10-MTHF转变为5-MTHF增多，此逆反应也包括核苷酸的从头合成途径中必需的叶酸。MTHFR催化5，10-MTHF还原为5-MTHF。一方面5-MTHF作为细胞内一碳单位的载体，参与嘌呤和嘧啶的合成，并为DNA、RNA和蛋白质的[1]甲基化提供甲基，从而影响正常的DNA代谢；另一方面5-MTHF作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中同型半胧氨酸再发生甲基化，生成蛋氨酸(甲硫氨酸)，从而维持血浆同型半胧氨酸的正常水平。1.2MTHFR的基因结构1988年，Kang首先发现一种不耐热、低活性的MTHFR变异体。1991年发现不耐热的MTHFR呈常染色体隐性遗传。此后研究发现不耐热的MTHFR在结、直肠癌的发病过程中起一定作用。1994年，Goyette首次用cDNA技术将人类MTHFR基因成功克隆并定位。MTHFR基因位于染色体1p36.3，整个编码区长1980bp，编码蛋白的分子量为74.6kDa。其氨基酸序列高度保守，90%与鼠MTHFR多肽具有同源性，其外显子的大小、内含子分界位置及内含子的大小在人、鼠两类中具有相似性。cDNA序列长2.2kb，包含11个外显子，长度102-432bp，内含子250bp-1.5kb。2MTHFR的基因多态性2.1MTHFR的基因多态性C677T在MTHFR基因上最普通的一个变异是在第4外显子，677位点上，一个胞嘧啶（C）变异成为一个胸腺嘧啶（T），引起了一个丙氨酸替换缬[2-3]氨酸的变异，导致酶的活性降低，且作为衡量编码酶活性的指标—耐热性降低到了37℃。现有的资料表明，MTHFR基因677C-T突变频率在不同国家、同一国家不同地区及同一地区不同民族的分布有显著差异。欧洲人677T等位基因频率在22%-44%之间，其中意大利人较高，为44%，且677TT纯合子频率达18%。非洲撒哈拉地区黑人677T等位基因频率为7%且未发现有纯合突变。而居住在巴西、美国的非洲人后裔其677T等位基因频率在5%～24%不等。亚洲人中，日本人677T等位基因频率为34%。[4]于佳梅等对中国5个民族MTHFR基因多态性进行了研究，结果汉族人677T等位基因频率为40%，达斡尔族人为45%，认为亚洲人MTHFR基42 综述因677C-T突变频率偏高。2.2MTHFR的基因多态性A1298C在MTHFR基因上另一个多态性位点在第7外显子上，1298位点上的一个腺嘌呤(A)变异成为一个胞嘧啶(C)，导致一个谷氨酸变异成为一个丙氨基团。发生A1298C变异的MTHFR酶活性也会降低，但是程度低于[5]C677T变异，却不会影响蛋白质的热稳定性。无论是纯合型或是杂合型的A1298C变异都不会出现血浆同半胱氨酸升高或是血浆叶酸水平降低，[6]在这一点上也与C677T纯合型变异不同。相对于C677T位点，A1298C突变基因在人群中分布的研究较少。以往的研究显示：C等位基因频率在亚洲人为17%～19%，西欧为27%～36%，非洲为39%。A1298C等位基因频率在南美洲的资料较少。中国北方汉族为20%，少数民族为8%～9%，贵州荔波汉族、布依族和苗族分别为28.9%、16.1%，10.6%。对于677C-T/1298A-C复合突变，加拿大人突变频率为15%，荷兰人为20%，[7]美国人为7%。3MTHFR基因多态性与大肠癌的关系MTHFR基因与肿瘤的关系是近年来国内外研究的热点，以往的研究表明MTHFR基因多态性与食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌和白血病等许多肿瘤有关。但是结果不尽相同。MTHFR基因与胃癌和肺癌的研究中，国内报道较多，并且认为C677T和A1298C在胃癌和肺癌的发生中起重要作用。从生物学的角度上来说，认为是多态性以及基因所处环境的联合作用共同影响了肿瘤的发病率更为合理，结果应该不单单是叶酸的摄入量就能够决定的。所以，很多研究都同时考虑到了多个因素，比如年龄、性别、吸烟状况、饮酒状况、叶酸摄入情况、药物使用情况等等。3.1MTHFR多态性与饮酒、吸烟习惯之间的关系酒精，作为叶酸的拮抗剂，自从Stocks1957年首次报道每日饮啤酒者结直肠癌发病的风险较非饮酒者有所增加以来，国内外已有多个同类研[8]究，但均为得出一致结论。蒋沁婷等对研究对象的饮酒状态，分析不饮酒、过去饮酒与现在饮酒与MTHFR677CT和1298AC之间的联合作用，结果发现，MTHFR1298C多态在非饮酒者中为结直肠癌的保护因素，而[9]在过去饮酒者中，就是结直肠癌的危险因素。Ma等对饮酒的半定量分析43 综述结果标明，以携带CC基因型的少量或不饮酒为参照，携带TT基因型的少量或不饮酒者、中量饮酒者和大量饮酒者的结直肠癌发病风险分别降低[10]7倍、1倍和不降低。类似的，Chen等报道，每周饮酒5次或5次以上可拮抗TT基因型的结直肠癌风险保护效应。这些研究结果提示，饮酒可[11]削弱甚至拮抗677TT基因型的结直肠癌风险保护效应。高长明等研究结果显示，在男性中，有饮酒习惯者发生结直肠癌的危险性均显著升高；MTHFRA1298C基因型，以及吸烟和饮茶习惯与结直肠癌易感性之间无显[12]著相关。类似的，张艳玲等报道MTHFRC677T多态性与吸烟、酒之间存在交互作用。3.2MTHFR多态性与大肠癌发生、发展的关系[13]Kono等对10个国家的16项关于结直肠癌与MTHFR基因突变关系的研究进行了总结，大部分研究结果显示C677T纯合突变是结直肠癌的一个遗传保护因子；但是，当体内叶酸缺乏时，677T/T基因型与增加[14]直肠腺癌的危险性有关。Haghighi等研究伊朗人群MTHFRC677T基因型与非家族性结直肠癌的关系，发现此基因型与结直肠癌的危险性呈负相[15]关，特别是对血清中存在高水平叶酸的患者。Levine等的研究也得出[16]相似的结果。Murtaugh等通过病例对照研究表明，叶酸摄入与直肠癌危险性的降低有关，这种危险性的降低发生在677T/T基因型的女性，而不发生在男性中，提示MTHFR677T/T基因型在女性中起保护作用，而[17]1298C/C基因型无论男女均起保护作用。Hubner等还对25个人群MTHFRC677T基因型与大肠癌的关系进行Meta分析，结果表明：与C/C基因型相比，MTHFR677T/T与大肠癌的危险性降低有关。国内张艳玲等[12]对MTHFRC677T和A1298C多态性进行了检测，结果表明：MTHFR677C/T和1298A/C组合型基因是结直肠癌的危险因素。但[18]Gallegos-Arreola等对墨西哥人群的研究却提示，MTHFR677C/T基因[19]型与结直肠癌的易感性呈正相关。Huang等对MTHFR多态性与大肠癌和腺瘤的关系进行Meta分析，结果亦未能证明C677T和A1298C与结肠腺瘤有关。对A1298C位点的研究相对较少，而且结果不一；关于MTHFRC677T多态性与直肠腺癌的7项研究表明，它们之间没有明显的相关性，二种截然不同的结论可能反映了不同种族MTHFR基因多态性对结直肠癌易感性的差异。44 综述4展望与思考MTHFR在机体代谢中起重要作用，MTHFR基因突变使酶活性降低，耐热性下降，血浆叶酸水平降低、同型半胧氨酸浓度增高，进而导致许多[20]疾病的发生。对于代谢基因多态性与大肠癌的遗传易感性研究尚处于起步阶段，而大肠癌发生具有明确的阶段性，为其遗传易感性研究提供了很好的机遇。对一些致癌或抑癌物代谢有关的基因多态与大肠癌的关系进行研究将有助于揭示大肠癌的遗传易感性机制，有利于进一步汇集大肠癌高危人群。对大肠癌的高危因子（吸烟、饮酒）与代谢基因多态之间以及多态基因之间的交互作用的进一步研究，将有利于揭示大肠癌病因机制，并可能为癌症的化学预防及基因治疗开辟新的途径。.45 综述参考文献[1]ChioSW,MasonJB.Folnteandcarcinogenesis:anintegratedscheme[J].Nutr,2000,130(2):129-132.[2]GoyetteP,PaiA,MilosR,etal.Genestructureofhumanandmousemethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)[J].Mamm.Genome,1998,9(8):652-656.[3]FrosstP,BlomHJ,MilosR,etal.Acandidategeneticriskfactorforvasculardisease:acommonmutationinmethylenetetrahydrofolatereductase[J].NatGenet,1995,10(1):111-113.[4]于佳梅,王断春,陈白滨,等.中国5个民族亚甲基四氮叶酸还原酶基因多态性的研究[J].人类学报,1998,17(3):242-246.[5]SiemianowiczK,GminskiJ,GarczorzW,etal.MethylenetetrahydrofolatereductasegeneC677TandA1298Cpolymorphismsinpatientswithsmallcellandnonsmallcelllungcancer[J].OncolRep,2003,10(5):1341-1344.[6]JengYL,WuMH,HuangHB,etal.Themethylenetetrahydrofolatereductase677C→TpolymorphismandlungcancerriskinaChinesepopulation[J].AnticancerRes,2003,23(6D):5149-5152.[7]XiaoY,ShunKR,LiY,etal.5,10-methylenetetrahydmfolatereductasepolymorphisminthreenationalitiesofGuiZhouinChina[J].ChinJMedGenet,2005,22(2):219-221.[8]蒋沁婷,陈坤,马新源,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性、饮酒与结直肠癌关系的病例对照研究[J].中华流行病学杂志,2004,25(7):612-616.[9]MaJ,StampferMJ,GiovannucciE,etal.Methylenetetrahydrofolatereductasepolomorphism,dietaryinteractions,andriskofcolorectalcancer[J].CancerRes,1997,57(6):1098-1102.[10]ChenJ,GiovannucciE,KelseyK,etal.Amethylenetetrahydrofolatereductasepolymorphismandtheriskofcolorectalcancer[J].CancerRes,1996,56(21):4862-4864.[11]高长明,TakezakiToshiro,吴建中,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结直肠癌易感性的关系[J].肿瘤防治杂志,2005,46 综述12(8):1215-1222.[12]张艳玲,苑晓燕,张冲,等.胸苷酸合成酶基因及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与辽宁本溪人群结直肠癌易感性的关系研究[J].临床肿瘤学杂志,2008,13(9):769-773.[13]KonoS,ChenK.GeneticpolymorphismsofMethylenetetrahydrofolatereductaseandcolorectalcancerandadenoma[J].CancerSci,2005,96(9):535-542.[14]HaghighiMM,RadpourR,MahmoudiT,etal.AssociationbetweenMTHFRpolymorphism(C677T)withnonfamilialcolorectalcancer[J].OncolRes,2009,18(2-3):57-63.[15]LevineAJ,FigueiredoJC,LeeW,etal.GeneticvariabilityintheMTHFRgeneandcolorectalcancerriskusingthecolorectalcancerfamilyregistry[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2010,19(1):89-100.[16]MurtaughMA,CurtinK,SweeneyC,etal.Dietaryintakeoffolateandcofactorsinfolatemetabolism,MTHFRpolymorphisms,andreducedrectalcancer[J].CancerCausesControl,2007,18(2):153-163.[17]HubnerRA,HoulstonRS.MTHFRC677Tandcolorectalcancerrisk:Ameta-analysisof25populations[J].IntJCancer,2007,120(5):1027-35.[18]Gallegos-ArreolaMP,Garca-OrtizJE,FigueraLE,etal.Associationofthe677C-TpolymorphismintheMTHFRgenewithcolorectalcancerinMexicanpatients[J].CancerGenomicsProteomics,2009,6(3):183-188.[19]HuangY,HanS,LiY,etal.DifferentrolesofMTHFRC677TandA1298Cpolymorphismsincolorectaladenomaandcolorectalcancer:ameta-analysis[J].JHumGenet,2007,52(1):73-85.[20]StrenLL,MasonJB,SelhubJ,etal.GenomicDNAhypomethylation,acharacteristicofmostcancers,ispresentinperipheralleukocytesofindividualswhoarehomozygousfortheC677Tpolymorphisminthemethylenetetrahydrofolatereductasegene[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2000,9(8):849-853.47 致谢致谢在三年学习即将结束、马上走上工作岗位之际，我要深深感谢导师郑纪宁教授当初给予我宝贵的学习机会，把我领入我向往的病理学殿堂。在这短暂时而又忙碌的三年，是您对我的学习和实验倾注了大量的心血，不遗余力地予以支持，使我得以能够顺利地完成学业；在这三年里，我学到了足以受用终身的知识，从此我的人生也将翻开新的一页，而这一切都与您密不可分；在跟随您学习的三年里，学到的不仅是专业知识，还有您那严谨的治学态度和对学业孜孜不倦追求的精神以及宽以待人的长者风范，这些宝贵的精神财富值得我终身学习。在今后的日子里我还将继续回昧、感触您当年给予的教诲。在此向我的导师致以深深的敬意和最诚挚的感谢。感谢承德医学院附属医院病理科李春辉、申兴斌、胡建功、王军、金小平等各位老师在临床病理诊断及病理技术方面给予的帮助；感谢承德医学院病理教研室侯志平、任立群、刘振虹、齐洁敏等各位老师在实验技术及论文方面的指导和帮助；感谢承德医学院基础研究所李欣、许倩、路国兵等各位老师在实验方面给予的帮助；感谢承德医学院附属医院肿瘤科和皮肤科给予的标本支持；感谢毛淑芳老师在统计学方面给予的的帮助；感谢我的同学徐树雷、康大伟、王泽民、李志加、于素香等在实验上和生活上给予我的帮助。感谢我的师妹刘荣霞、李桃，师弟孔意在论文答辩方面给予我的帮助。感谢研究生处的乔跃兵、李德臣、张晓英老师和科研处宋成军、苗光新老师三年来对我的关心、支持和帮助。感谢我的家人一直以来对我的关心，支持和鼓励。感谢所有支持和帮助过我的人们，谢谢！48 个人简历个人简历一、个人基本情况姓名孙全昌性别男民族汉出生日期1983年12月4日籍贯河北省沧州市二、个人经历2003年9月-2006年7月在河北工程大学医学院专科2006年9月-2009年7月在河北工程大学医学院本科2009年9月-2012年7月在承德医学院研究生三、发表论文情况《MTHFR基因多态性及其与大肠癌的相关性研究》以第一作者发表在《承德医学院学报》2012,29(1):85-87《MTHFR基因A1298C多态性与大肠癌易感性的关系》以第一作者发表在《承德医学院学报》2012,29(2):115-117《MTHFR基因C677T多态性与大肠癌遗传易感性的关系》以第一作者发表在《中国老年学杂志》定稿（2012年2月2号）稿号：114021已录用四、获奖情况2006-2007年度获河北工程大学三等奖学金2007-2008年度被评为河北工程大学“优秀团员”2009-2010年度被评为承德医学院“优秀研究生”五、主研课题情况主要研究基因多态性与大肠癌发展的关系以及大肠癌的病因机制和早期诊断。49