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学校代码：１０２８５学号：２０１４５２３２１３５ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ（专业学位）通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｎｇｌｉｏｍａｓＲ、研究生姓名丨闫可指导教师姓名崔岗专业名称神经外科学研究方向胶质瘤的发生发展机制所在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期０１７—２年５月 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期： 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文□本学位论文属在年月解密后适用本规定。非涉密论文□论文作者签名：日期：导师签名：日期： 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒中文摘要通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒中文摘要目的：验证中途进退式聚合酶链反应（dropin/outPCR）对于检测肿瘤样品中的人类巨细胞病毒（HCMV）的灵敏性和准确性，并通过对50例人颅内肿瘤标本中的HCMV检测，分析HCMV感染与肿瘤分型，WHO分级，以及与细胞受体PDGFRα和EGFR的关系。方法：应用基因克隆技术，构建HCMV克隆质粒，并进行梯度稀释，用dropin/outPCR检测不同梯度的HCMV质粒，确定可检测到的最低质粒浓度，分析此方法对于检测该病毒核酸的灵敏性。然后，用dropin/outPCR检测50例颅内肿瘤样品中的HCMV，并用免疫组化技术对有效结果的样品检测HCMVIE抗原来验证dropin/outPCR的准确性。结合病理资料分析HCMV感染与肿瘤分型以及WHO分级的关系。最后，用免疫组化技术检测所有有效结果样品的PDGFRα和EGFR抗原，并结合之前HCMVIE和dropin/outPCR检测结果分析HCMV感染与细胞受体PDGFR和EGFR的关系。结果：我们发现，对不同梯度浓度的HCMV质粒进行dropin/outPCR检测后，4可检测到的最低质粒浓度为5*10个质粒分子/ml，验证了此方法灵敏度较好。在对50样品的检测中，得到有效结果41例，其中HCMV阳性29例，统计分析证明其阳性率与41例样品的HCMVIE免疫组化结果无明显差别（p>0.05），并且两者结果一致性可（p<0.05），进一步证实dropin/outPCR对于检测肿瘤样品中的HCMV准确性尚可。我们还发现，HCMV感染与否和其感染强度与胶质瘤类型以及胶质瘤WHO分级无明显相关性（p>0.05），HCMV感染与否与两种细胞受体是否表达无明显相关性（p>0.05），HCMV感染强度与EGFR表达量之间存在正相关关系（p<0.05），而与PDGFRα无明显正相关关系（p>0.05）。结论：1.dropinoutPCR可以用于检测胶质瘤样品中的HCMV，并且其灵敏性与准确性I 中文摘要通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒均较好。2.HCMV是否感染、感染强度均与胶质瘤病理类型以及WHO分型无明显相关性。3.HCMV是否感染与PDGFRα和EGFR是否表达相关性不显著，HCMV感染强度与EGFR表达量显著正相关，而与PDGFRα表达量无明显正相关关系。关键词：进退式聚合酶链反应（dropin/outPCR），人类胶质瘤，人类巨细胞病毒（HCMV）作者：闫可指导老师：崔岗II Detectionofhumancytomegalovirusingliomasbydropin/outPCRAbstractDetectionofhumancytomegalovirusingliomasbydropin/outPCRAbstractObjective:Weaimedtoinvestigateaccuracyandsensitivityofdropin/outPCRandtovalidatewhethercanitbeusedtodetecttheHCMVintumortissues.Moreover,weinvestigatetherelationshipbetweentheinfectionofHCMVandtypeoftumors,WHOgradesofgliomaandcellularreceptorPDGFRαandEGFRthroughthedetectionofHCMVin50humanintracranialtumortissues.Methods:ApplyingthegenecloningweestablishedclonedplasmidofHCMV,andthenundergogradientdilution.ThroughtestingtheplasmidofHCMVofdifferentconcentrationusingdropin/outPCR,weconfirmedthelowestconcentrationoftheplasmidthatisdetectableandthenanalyzethesensitivityofthismethodusedfordetectingHCMV.Then,HCMVin50intracranialtumorswastestedusingthiskindofmethod.ThevalidresultswerethendetectedofHCMVIEinimmunohistochemistry.Allthetwoassays'results,aswellasthecorrespondingpathologicaldata,wereusedforexploringtherelationshipoftheHCMVinfectionandthetypeoftumorandWHOgradesofastrocytoma.Atlast,immunohistochemistrywasappliedagaintodetectPDGFRαandEGFRofallthetumortisseswhichisofvalidresultsindropin/outPCR,andthenindentifiedtherelationshipbetweenintensityofHCMVinfectionandexpressionvolumeofPDGFRαandEGFR.Results:Incurrentstudy,wefindthatthelowestconcentrationofHCMVplasmidis45*10copies/ml,clarifiedthatitisofproperaccuracyfordropin/outPCRtodetecttheHCMVgene.InthedetectionofHCMVintumortissuesbythiskindofmethod,41of50validresultwasobtained,whichcontained29of41positiveresults.Statisticanalysisdemonstratedthepositiverateisofnoobviousdifferentiationbetweentheresultsthatisobtainedbytheusingofdropin/outPCR(p>0.05)andimmunohistochemistry,andtheconsistencyoftheresultsoftwodifferentmethodsisdecent(p<0.05).StatisticresultsalsoindicatesthatneitherthepresenceofHCMVintissuesnorintensityofHCMVinfectionhasobviouscorrelationtothetypeofHCMVandWHOgradesofIII AbstractDetectionofhumancytomegalovirusingliomasbydropin/outPCRastrocytoma(p>0.05).Finally,wealsoprovedthatthereisnodistinctcorrelationbetweentheexistenceofHCMVinfecionandthepresenceofPDGFRαandEGFR(p>0.05).AndwefoundthatthepositivecorrelationbetweentheintensityofHCMVinfectionandexpressionquantityofEGFRisobvious(p<0.05),butisnotbetweenintensityofHCMVinfectionandexpressionquantityofPDGFRα.Conclusions:1.Dropin/outPCRisofgoodaccuracyandsensitivityandcanbeusedtodetecttheHCMVintumortissues.2.NeitherthepresenceofHCMVintissuesnortheintensityofHCMVinfectionhascorrelationbetweenthetypeoftumorsandWHOgradesofastrocytoma..3.TheexistenceofinfectionsofHCMVintissuesisunobviouscorrelatedtothepresenceofPDGFRαandEGFR.TheintensityofHCMVinfectionissignificantlypositivelycorrelatedtotheexpressionquantityofEGFR,butnottotheexpressionquantityofPDGFRα.Keywords:dropin/outPCR,humanglioma,humancytomegalovirus(HCMV)Writtenby：YankeSupervisedby：CuiGangIV 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒目录前言....................................................................................................................................1材料和方法............................................................................................................................41.材料.................................................................................................................................41.1人颅内肿瘤样品......................................................................................................41.2HCMV阳性的患者血液样品..................................................................................41.3细胞培养..................................................................................................................41.4实验试剂..................................................................................................................41.5实验仪器..................................................................................................................62.方法.................................................................................................................................71.293T细胞基因组DNA提取.....................................................................................72.石蜡包埋组织基因组DNA提取...............................................................................73.基因克隆......................................................................................................................84.质粒梯度稀释实验......................................................................................................95.dropin/outPCR........................................................................................................106.免疫组化....................................................................................................................117.HE染色：................................................................................................................128.统计分析....................................................................................................................12结果..................................................................................................................................131.验证dropin/outPCR对于检测HMCV核酸的灵敏性.............................................132.dropin/outPCR检测肿瘤样品中的HCMV...............................................................143.免疫组化检测检测肿瘤组织中的HCMV..................................................................174.HCMV感染与胶质瘤病理类型及WHO分级的关系..............................................195.HCMV感染与细胞受体PDGFRα和EGFR的关系.................................................21讨论..................................................................................................................................25结论..................................................................................................................................28 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒参考文献..............................................................................................................................29综述..................................................................................................................................34参考文献..........................................................................................................................41攻读硕士期间公开发表的论文..........................................................................................49中英文缩略词表..................................................................................................................50致谢..................................................................................................................................51 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒前言前言胶质瘤(Glioma)是一类起源于神经上皮组织的恶性肿瘤，占全部颅内肿瘤发病率[1]的46%，约占成人全身恶性肿瘤的2%，是颅内原发性肿瘤中发病率、病死率最高[2]的一种。根据2007年世界卫生组织（WHO）胶质瘤病理分级标准，胶质瘤可分为[3]Ⅰ-Ⅳ级四个等级，等级越高，恶性程度越高。病理类型以星型胶质瘤最常见，其次[4]为胶质母细胞瘤。胶质瘤Ⅳ级亦为胶质母细胞瘤（GBM），是恶性度最高的胶质瘤。近年来流行病学调查报告显示胶质瘤发病率明显递增，年增长率为1.2%，其中成人[5]发病率为30%。尽管近10年来显微外科技术、常规放射治疗、立体定向放射治疗有所进展，新型化疗药物(如替莫唑胺)和新的治疗方法(如免疫治疗)等的出现，都未能明显延长胶质瘤患者的生存期，尤其是恶性胶质母细胞瘤患者，5年生存率不足5%,[6-7][8-9]平均生存期仅为14个月，具有发病率、复发率、死亡率高的临床特点。胶质瘤已成为严重危害人类生命和健康的疾病之一，患者生活质量明显下降，给家庭和社会造成严重负担。所以，深入研究胶质瘤发生发展的机制，有助于发现新的治疗的思路，控制病情的发展，从而延长胶质瘤患者生存时间，改善生活质量。近年来有研究报道，人类巨细胞病毒（humancytomegalovirusHCMV）感染对胶[15-26]质瘤的生长、转移、侵袭有着重要作用。HCMV是一种DNA病毒，属于β疱疹病毒亚科，在人群中感染率较高，流行病学调查显示，约70％以上成年人存在巨细[10-11]胞病毒感染，人群中血清HCMV阳性率为80%。研究发现，胶质瘤组织中存在[12-14][15]人类巨细胞病毒。神经干细胞、胶质细胞易感染人类巨细胞病毒。此外，在其[16-17]它肿瘤，如前列腺癌，直肠癌组织中也有HCMV感染。近年关于该病毒与胶质瘤的关系的研究取得了良好进展，人们发现HCMV可诱导细胞恶性转化和关键性细胞调控通路功能障碍，如引起基因突变、细胞周期调控失常、抑制或促进细胞凋亡、促进新生血管形成、促进细胞免疫耐受形成、调控宿主细胞合成和分泌细胞因子等，[15-26]有一定的致瘤性，从而导致胶质瘤发生与发展。然而，部分实验室存在矛盾报道，有学者认为HCMV与恶性肿瘤发生发展并无明显关系，因为在肿瘤组织中未检测到[41-43]该病毒。而且，并没有体内实验证明HCMV会导致恶性胶质母细胞瘤发生。目前实验学检测肿瘤组织中的HCMV包括蛋白水平和核酸水平两类检测方法。1 前言通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒核酸水平检测常用方法有：巢式聚合酶链反应（nestedPCR），实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR），原位杂交（ISH）等。蛋白水平常用检测手段有：免疫印迹[12-14,27]（Westernblot）和免疫组化（immunohistochemistry）。其中免疫组化是检测HCMV最传统，最可靠的方法，因其具有较高灵敏度准确度而被广泛应用。目前研究水平已可以检测IE,US28,pp65,gB,HCMVIL-10,和pp28等病毒蛋白。其中IE测出率最高而最为常用，其阳性率可达100%。该蛋白表达于肿瘤细胞核及核周胞质，在其他肿瘤如低级别胶质瘤、退行性神经细胞瘤，以及一些星型细胞瘤，少突细胞胶质瘤，室管膜细胞瘤都有该蛋白表达。而正常脑组织，肿瘤旁组织则不含有HCMV[28-29]蛋白或核酸。有文献报道，NestedPCR可以用于检测胶质瘤组织中的HCMV，但由于其灵敏度较高，且中间需取出第一轮PCR产物进行第二轮扩增反应，很容易造成污染引起[30-32]结果不准确。并且有研究报道，nestedPCR检测灵敏度较qPCR低。中途进退式聚合酶链反应（dropin/outPCR）是nestedPCR的改良，专用于极少量DNA模板的扩增，其将两步操作简化为一步，大大降低了因操作步骤繁多引起的污染问题。此方法将外引物设计得比内引物长，且用量远远小于内引物，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时,由于在较高退火温度下内引物不能与模板结合，而外引物可以与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环,待外引物基本消耗尽，无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行第二次PCR扩增。这不仅减少操作步骤，同时也降低了交叉污染的机会。HCMV可以感染多种类型的细胞，关于其感染机制的研究也取得了一定进展。近年研究证明，病毒表面膜蛋白gHgLgO三聚体可以与细胞表面酪氨酸激酶受体血小板衍生生长因子受体α（platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha，PDGFRα）结合来介导病毒包膜表面gB膜融合蛋白的膜融合作用使病毒核衣壳进入胞内。他们还提出另一种可能性：病毒膜蛋白gHgLULULUL五聚体可以与细胞表面酪氨酸激酶受体ErbB1和ErbB2结合导致其磷酸化，结果使细胞发生胞饮作用而介导病毒入胞内，在[33]胞质中通过gB介导的酸融合作用使病毒核衣壳释放入胞质，但该通路还未被证实。其中ErbB1又叫做表皮因子生长受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR），ErBb2又叫做原癌基因人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactor2 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒前言receptor-2,HER2)。PDGFRα和ErbB1广泛分布与各种细胞膜表面，如上皮细胞、内[33-35]皮细胞、造血前体细胞，神经细胞，星型细胞和胶质细胞等，因此以上研究结果也解释了为何HCMV可以感染不同种类的细胞。因此细胞膜表面的这两种受体的表达量多少可能与HCMV感染细胞的几率以及感染程度正相关。综上所述，我们打算为临床和基础研究中检测样品的HCMV提供一种更为便捷的方法，即dropin/outPCR，来减少繁琐的检测步骤，节约成本，提高准确率。我们对HCMV基因序列进行对比和筛选，选择了最保守的基因组区段，在此区段设计引物来进行dropin/outPCR扩增。首先，我们构建了HCMV与阳性对照IDH1的基因克隆质粒，并对其做梯度稀释，用dropin/outPCR对不同浓度的质粒进行检测来验证这种方法的灵敏性；其次，收集50例不同类型和级别的胶质瘤、其他颅内非胶质瘤及正常脑组织，分别用本方法对其进行检测，然后对所有有效样品切片进行免疫组化检测HCMVIE抗原，进一步验证本方法的准确性，并结合病理资料分析HCMV感染与胶质瘤类型与WHO分级之间的关系；最后，用免疫组化检测所有有效样品PDGFRα和EGFR抗原，将其结果与HCMV免疫组化结果结合来分析HCMV感染与细胞表面这两种受体表达量的关系。我们通过本课题的研究，将会验证dropin/outPCR对于检测胶质瘤样品中HCMV的可行性，并进一步阐明HCMV的感染机制，为胶质瘤的研究、诊断和治疗提供充足的理论依据。3 材料和方法通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒材料和方法1.材料1.1人颅内肿瘤样品本课题应用的是近3年收集的50例人颅内肿瘤样品（包含胶质瘤，脑膜瘤，转移瘤，正常脑组织等）。大部分患者未接受过放疗、化疗或其他影响胶质瘤的任何治疗。部分患者为二次手术。我们使用的临床-病理学资料均由苏州大学附属第一医院病理科提供。样品中的正常脑组织作为阴性对照，这些正常脑组织中不含任何肿瘤组织。新鲜标本在离体后立即经10%福尔马林固定，然后石蜡包埋后制作成切片。本课题所收集的标本的过程均依照世界医学联盟的伦理要求及赫尔辛基宣言，并经苏州大学伦理委员会批准。1.2HCMV阳性的患者血液样品本课题使用的HCMV阳性的患者血清由苏州大学附属第一医院血液研究中心提供。患者静脉采血后立即置于抗凝管中，于-80℃下保存。经苏州大学附属第一医院血液研究中心鉴定，已确定含有HCMV。1.3细胞培养本课题使用的293T细胞取自苏州大学功能纳米及软物质学院，以含有10%热失活小牛血清的高糖DMEM培养基培养，培养环境为37℃，5%CO2。1.4实验试剂（1）胰蛋白酶（美国Sigma公司）（2）1XPBS（pH7.4）NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，用ddH2O定容至1000ml，调pH至7.4。（3）10XPBS（pH7.0）：NaCl80g，KCl2g，Na2HPO414.38g，KH2PO40.77g，用ddH2O定容至1000ml，调pH至7.0，使用时稀释成1X（4）10%SDS（上海生工公司）（5）0.5MEDTA（上海生工公司）4 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒材料和方法（6）1MTris-HCl（pH8.0）（上海生工公司）（7）5MNaCl（上海生工公司）（8）无水乙醇（上海国药公司）（9）50XTAE:Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g，800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，使用时稀释为1X（10）2%/0.8%琼脂糖凝胶：2g/0.8g琼脂糖，1xTAE100ml，混匀后加热，凝固（11）二甲苯（上海国药公司）（12）伊红溶液（上海生工公司）（13）苏木精溶液（上海生工公司）（14）中性树胶（上海国药公司）（15）0.001M柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）：枸橼酸0.21g，枸橼酸钠二水2.9g，双蒸水定容至1L，调pH至6.0（16）0.001MEDTA抗原修复液（pH8.0/pH9.0）：Tris1.21g，EDTA二钠钙0.37g，双蒸水定容至1L，调pH至8.0/9.0（17）1XPBST：1XPBS（pH7.0）1L，Tween-201ml（18）FBS（浙江天杭公司）（19）3%H2O2（上海阿拉丁公司）（20）DAB（美国Sigma公司）（21）DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）（22）小牛血清（美国Gibco公司）（23）无内毒素质粒小提中量试剂盒（北京天根公司）（24）琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根公司）（25）T载体克隆试剂盒（大连TaKaRa公司）（26）DH5α感受态（美国Sigma公司）（27）LB培养基（上海国药公司）（28）X-gal（美国Sigma公司）（29）青霉素溶液（美国Sigma公司）（30）抗Amp平板（美国Sigma公司）（31）BamHⅠ，EcoⅠ（美国Sigma公司）5 材料和方法通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒（32）CutSmart（美国Sigma公司）（33）蛋白激酶K（美国Sigma公司）（34）EXTaqHotStart（大连TaKaRa公司）（35）10XEXTaqBuffer（大连TaKaRa公司）（36）dNTP（大连TaKaRa公司）（37）引物（苏州金维智公司）（38）HCMVIE单克隆抗体（美国Millpore公司）（39）PDGFRα单克隆抗体（美国CellSignal公司）（40）EGFR单克隆抗体（北京中杉金桥公司）（50）山羊抗兔/鼠二抗（北京中杉金桥公司）（51）EasyTaq（大连TaKaRa公司）（52）细胞裂解液：Tris-HCl（1M）pH8.05ml，EDTA（0.5M）0.5ml，10%SDS1ml，NaCl（5M）2ml，ddH2O41.5ml，过滤灭菌。1.5实验仪器（1）恒温水浴锅（上海精宏公司）（2）低温冷冻离心机（德国Eppendorff公司）（3）超低温冰箱（美国Thermo公司）（4）自动蒸汽消毒机（美国Thermo公司）（5）医用净化工作台（美国Airtech公司）（6）生物安全柜（美国Airtech公司）（7）电热恒温干燥箱（上海精宏公司）（8）制冰机（上海精宏公司）（9）超纯水分离系统（美国Millpore公司）（10）磁力搅拌器（德国IKA公司）（11）石蜡切片机（德国Leica公司）（12）荧光扫描成像仪（美国AmershamBiosciences公司）（13）紫外灯切胶仪（德国Leica公司）（14）电泳仪（美国BIO-RAD公司）6 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒材料和方法（15）空气摇床（香港太华公司）（16）荧光显微镜（德国Leica公司）（17）细胞培养箱（美国Thermo公司）（18）移液枪（德国Eppendorff公司）（19）载玻片（江苏世泰公司）（20）电子天平（德国Sartorius公司）（21）石蜡包埋机（德国Leica公司）（22）组织脱水机（德国Leica公司）（23）DNA浓度测试仪（美国Thermo公司）（24）PCR仪（美国Lifetechnology公司）2.方法1.293T细胞基因组DNA提取（1）用0.125%胰蛋白酶，消化细胞3分钟，用5ml吹管吹打细胞，重悬细胞（2）将重悬后的细胞转移至1.5ml离心管，1000rpm，3min离心（3）加入200μL细胞裂解液，1μL蛋白激酶K，55℃裂解1h。（4）加入2倍体积无水乙醇，震荡混匀，可见絮状沉淀（5）4℃离心，12000rpm，10min（6）去上清，加入750μL70%乙醇清洗沉淀（7）4℃离心，12000rpm，5min（8）去上清，晾干（9）加入20μLddH2O，于37℃溶解2h（10）-20℃保存2.石蜡包埋组织基因组DNA提取（1）切石蜡包埋组织切片7-8片放入灭菌的EP管中，最初暴露在空气中的几片弃去不要。（2）加1ml二甲苯，漩涡震荡10s，12000rpm离心2min，弃上清（3）加1ml无水乙醇，漩涡震荡10s，12000rpm离心2min，弃上清7 材料和方法通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒（4）完全挥发乙醇，加200μl组织消化液，与1μl200x蛋白激酶K，55℃孵育至组织完全裂解。（5）加2倍体积的无水乙醇，震荡混匀，12000rpm，4℃离心10min，吸掉上清（6）加入750μl70%无水乙醇，12000rpm，4℃离心5min，吸掉上清（7）待乙醇完全挥发后加入20μl灭菌水，震荡混匀，放入37℃培养箱溶解2小时（8）-20℃保存3.基因克隆分别采用HCMV阳性患者血清与293T细胞基因组DNA做模板，用PCR技术分别扩增出HCMV与异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）目的基因片段，按如下反应体系与条件进行：（1）反应体系：20μL，每个反应体系包括10XEXTaqbuffer(Mg2+)2μL、dNTP0.5μL、HCMV上游引物：GGCTGGTGATGTCGGTGATCTGATTCGG：0.5μL、HCMV下游引物：GCGGTCGATGTCAGATGCTGGAC0.5μL，IDH1上游引物：GGCGCTGTGTTTCTGTTGATTTGGCCCTT0.5μL，IDH1下游引物：CAGGTGTGGTCGCATGCCTATAGTCCCTG0.5μL，EasyTaq0.25μL，其余用水补足。（2）反应条件：HCMV：1：95℃5分钟2：95℃30秒3：70℃45秒4:返回步骤2，共40个循环5：72℃5分钟6：4℃孵育IDH1：1：95℃5分钟2：95℃30秒3：70℃45秒4：返回步骤2，共40个循环5：72℃5分钟6：4℃孵育8 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒材料和方法HCMV与IDH1分别做2管共40ul。（3）琼脂糖凝胶电泳与成像：配置含3%溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，反应产物与6Xloadingbuffer混合，取40μl上样，110V恒压电泳25分钟，结果在荧光电泳成像仪下成像。（4）目的片段回收：在紫外灯切胶仪下用刀片切下含有目的片段的凝胶，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。（5）链接T载体：配置5μl反应液，包括3μl插入的目的片段，0.5μlpUCm-Tvector，0.5μl10xligationbufferm,0.5μl50%PEG4000,0.5μlT4DNAligase,16℃过夜。（6）转化:大体步骤如下1).50μl感受态DH5α放在冰上解冻2)加入5μl链接产物并混匀，冰上静置30分钟3)42℃热激90秒，再放在冰上静置2分钟4)加入700μlLB，用摇床37℃，20rpm振荡培养45分钟5)3000rpm离心5分钟，用枪头吸去550μl上清液，剩余的培养基将细胞悬浮。6)用25μlX-gal，和75μlLB均匀涂氨苄青霉素抗性的平板上，晾干。7)将菌液均匀涂板，然后再37℃培养箱倒置过夜培养。（7）转化子蓝白斑筛选与鉴定：大体步骤如下1）用牙签挑取平板上生长的白色菌落至含有100μl氨苄青霉素和50mlLB的培养瓶中，放入摇床37℃，250rpm过夜振荡培养。2）吸取100μl培养后的菌液进行测序确定是否含有目的克隆。3）用质粒小提中量试剂盒对菌液进行质粒抽提，测浓度。4）用BamHⅠ与EcoⅠ对所提质粒进行酶切鉴定4.质粒梯度稀释实验（1）质粒数目计算：提取质粒后用DNA浓度测试仪测质粒浓度为Cμg/μl，克6隆质粒碱基长度为L，则克隆质粒分子量根据公式得：M=（L*607.4+157.9）*10μg/mol，23则每微克克隆质粒分子数为（1/M）*6.02*10个/μg，计为a，这样可以根据所测得3质粒浓度C求得每毫升中克隆质粒得分子个数为：N=a*C*10个/mln（2）梯度稀释：将所得HCMV、IDH1质粒根据浓度N调整为浓度为10个/ml9 材料和方法通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒（n为大于10的整数），然后分别用灭菌去离子水按10倍数量级稀释。稀释范围为123每毫升10-10个质粒分子，做6-8个梯度。5.dropin/outPCR用所提石蜡样品基因组DNA和梯度稀释的质粒做模板，设置1个阴性对照用水作为模板，按如下反应体系和条件进行：2+（1）反应体系：20μl，每个反应体系包括10XEXTaqbuffer(Mgplus)2μl、dNTP0.5μL、正向外引物0.05μL，反向外引物0.05μL，正向内引物0.5μL，反向内引物0.5μL。EXTaq酶0.25μL，模板1μL，其余用水补足。具体引物序列见附表3。（2）PCR反应条件：详见下表：10 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒材料和方法（3）琼脂糖凝胶电泳与成像：配置含3%溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，反应产物与6Xloadingbuffer混合，取10μl上样，110V恒压电泳22分钟，结果在凝胶电泳荧光成像仪下成像。6.免疫组化（1）石蜡包埋组织做5μm切片，55℃烘片30min以上，然后对切片进行如下处理（2）二甲苯脱蜡15min3次（3）100%乙醇2min，3次（4）95%乙醇2min，80%乙醇2min，70%乙醇2min（5）去离子水1min，3次（6）分别用pH=6.0的EDTA抗原修复液（修复PDGFRα抗原）、pH=8.0的柠檬酸钠抗原修复液（修复EGFR抗原）、pH=9.0的柠檬酸钠抗原修复液（修复HCMVIE抗原），高温高压修复抗原30min（7）冷却至室温，去离子水洗3min，3次（8）用3%过氧化氢孵育15min，去除内源性过氧化物酶（9）去离子水洗3min，3次（10）用免疫组化笔在组织周围划线，用PBST洗3min，3次（11）用10%FBS（用PBST稀释）25℃孵育1小时（12）用PBST洗片子3分钟，3次（13）用含有2%FBS的PBST按如下浓度稀释一抗anti-HCMVIE（1:1000）,anti-EGFR（1:100）,anti-PDGFRα（1:500），然后滴加至完全覆盖组织，4℃孵育过夜（14）用PBST洗片子3min，4次（15）二抗室温孵育1小时（16）PBST洗片子3min，3次（17）用含有1xDABbuffer、30xDAB、30x过氧化氢的DAB显色液显色至背景可见，用大量水终止反应，去离子水洗3min，3次（18）复染：苏木精溶液染色2分钟，然后自来水冲洗一分钟11 材料和方法通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒（19）70%乙醇2min，80%乙醇2min，95%乙醇2min（20）100%乙醇2min，3次（21）二甲苯5min，3次（22）用稀释的中性树胶封片，光镜下观察7.HE染色：（1）取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，5μm切片。（2）切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min，二甲苯（Ⅱ）5min，100％乙醇2min，95％的乙醇1min，80％乙醇1min，75％乙醇1min，蒸馏水洗2min。（3）苏木素染色5min，自来水冲洗。（4）自来水冲洗1min（5）置伊红液2min。（6）自来水冲洗1min（7）常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min，95％乙醇（Ⅱ）1min，100％乙醇（I）1min，100％乙醇（Ⅱ）1min，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯（I）1min，二甲苯（Ⅱ）1min，中性树脂封固。8.统计分析（1）上述实验均至少重复3次，以减少随机误差（2）实验数据经SPSS22.0统计软件包进行统计分析。（3）两组数据间差异性比较采用卡方检验，一致性检验采用kappa分析，相关性检验采用spearman相关性分析及卡方检验。多组数据间相关性分析采用spearman相关性分析。设定p<0.05时，差异有统计学意义。12 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果结果1.验证dropin/outPCR对于检测HMCV核酸的灵敏性为了探究dropin/outPCR对于检测样品中HCMV的灵敏性，我们构建了HCMV与阳性对照IDH1的克隆质粒，然后将其浓度换算成每毫升中含有的质粒数1098（copies/ml）,并按10倍数量级进行梯度稀释，共设置8个浓度梯度（10，10，10，7654410，10，10，5*10，10copies/ml），以及一个阴性对照（水），然后用dropin/outPCR4对其进行检测（图1）。如图所示，可检测到的HCMV质粒最小浓度为5*10copies/ml，5可检测到阳性对照IDH1的最小浓度为10copies/ml，可见该方法对检测HCMV核酸有一定的灵敏性。图1：HCMV与IDH1克隆质粒梯度稀释后，用dropin/outPCR检测的结果。图表下方为质粒浓度（copies/ml），条带大小：HCMV:96bp，IDH1：95bp。NG：阴性对照。部分泳道存在<60bp的引物二聚体13 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒2.dropin/outPCR检测肿瘤样品中的HCMV我们用该方法检测了50例人颅内肿瘤样品。我们得到有效样品41例，即IDH1阳性，HCMV阳性或阴性，或IDH1阴性，HCMV阳性，无效样品9例，即IDH1与HCMV均阴性。其中有效样品包括星型胶质瘤22例，室管膜瘤2例，室管膜母细胞瘤1例，少突星型胶质瘤3例，病理类型不明的胶质瘤2例，以及其他非胶质瘤9例，正常脑组织1例，病理类型不明1例。我们把有效样品分为，HCMV阴性，HCMV阳性（表1），HCMV阳性率为71%（29/41）。所有检测结果见表2。我们从中随机选取了胶质瘤样品15例，非胶质瘤样品8例的dropin/outPCR结果如图2。表1：dropin/outPCR有效结果统计图。POS：阳性结果，NEG：阴性结果。右侧为两种结果所占比例14 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果图2：a：部分胶质瘤样品进行dropin/outPCR后经琼脂糖凝胶电泳的结果，HCMV条带大小为96bp，IDH1条带大小为95bp，其中用水作为阴性对照NG，样品编号及病理类型在图下方，AST:星型细胞瘤，EMBM：室管膜母细胞瘤,GBM：胶质母细胞瘤，LGG：低级别胶质瘤，EM：室管膜瘤，OA：少突星型胶质瘤。红色为HCMV阳性结果，绿色为HCMV阴性结果。b：部分非胶质瘤样品PCR结果，红色为HCMV阳性结果，绿色为HCMV阴性结果。SCLCMT:小细胞转移瘤，LMT：肺癌转移瘤，RMT：直肠癌转移瘤，NB：正常脑组织，MG：脑膜瘤，GS：胶质增生，HT：血肿机化15 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒表2：全部有效结果样品的dropin/outPCR与HCMVIE免疫组化结果以及相应的肿瘤病理类型表，PCR与免疫组化结果一致的样品用“Y”标出，NA代表无组织切片，病理类型说明：AST:星型细胞瘤，EMBM：室管膜母细胞瘤，GBM胶质母细胞瘤，LGG：低级别胶质瘤，EM：室管膜瘤，OA：少突星型胶质瘤。SCLCMT:小细胞转移瘤，LMT：肺癌转移瘤，RMT：直肠癌转移瘤，16 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果NB：正常脑组织，MG：脑膜瘤，GS：胶质增生，HT：血肿机化；UG：未知类型的胶质瘤，UN：病理类型不明的肿瘤。黄色部分代表非胶质瘤样品3.免疫组化检测检测肿瘤组织中的HCMV为了验证dropin/outPCR检测组织中HCMV的准确性，以及相对于传统的检测方法其检出率如何，我们对所有有效结果的样品做抗HCMVIE的免疫组化，免疫组化所有结果按表3进行分级，所有结果汇总见表2。部分结果免疫组化结果如图3。部分样品因组织量少未做免疫组化。我们统计了免疫组化检测HCMV与dropin/outPCR检测HCMV一致的样品数为29例，一致率76.3%。总体上看，免疫组化结果阳性率为84%（32/38）。统计分析结果免疫组化与dropin/outPCR对于检测HCMV的阳性率无明显差别（p>0.05，表2，a）,且Kappa一致性检验提示两种方法一致性良好（p<0.05，表2，b）。表3：HCMVIE，PDGFRα和EGFR免疫组化结果分级标准。17 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒图3：部分胶质瘤与非胶质瘤样品HCMVIE免疫组化结果图。信号强度等级标注在右下角。对应的样品编号及病理类型如下：a：8，ASTI-II；b：31，EM；c：21，OAⅢ；d：33，GSe：29，ASTⅡ；f：23，MG表4：a:dropin/outPCR和免疫组化检测肿瘤样品中的HCMV阳性率卡方检验结果。b:dropin/outPCR和免疫组化检测肿瘤样品中的HCMV结果Kappa一致性分析结果与spearman相关分析结果。r为相关系数。18 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果4.HCMV感染与胶质瘤病理类型及WHO分级的关系为了探究HCMV感染与胶质瘤病理类型及WHO分级之间的关系，我们将HCMV是否感染和其感染强度与样品的病理类型及WHO分级做相关分析。首先，我们将PCR的结果与肿瘤类型及星型胶质瘤的WHO分级做统计检验（表3），从结果中我们看到，HCMV感染与否与肿瘤类型及胶质瘤WHO分级均无明显相关性（p>0.05）。然后，我们将免疫组化结果中不同程度的HCMV感染与肿瘤类型，和星型胶质瘤WHO分级做统计分析和相关分析（表4），检验结果提示，HCMV感染程度与肿瘤类型以及与星型胶质瘤WHO分级均无明显相关性（p>0.05）。表5：HCMV结果与肿瘤类型和星型细胞瘤WHO分级的统计表和卡方检验结果。19 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒表6：a：HCMV感染强度与肿瘤类型的卡方检验结果。b：HCMV感染强度与星型胶质瘤WHO分型的spearman相关分析结果。r为相关系数。20 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果5.HCMV感染与细胞受体PDGFRα和EGFR的关系为了研究HCMV是否感染、感染程度与细胞受体PDGFRα和EGFR的关系，我们所有PCR有效结果样品进行PDGFRα和EGFR免疫组化，并按表3的标准对免疫组化结果进行分级，全部结果汇总见表7，部分免疫组化结果见图6。首先,为了验证HCMV是否感染与PDGFRα与EGFR是否表达有无关系，我们将PDGFRα与EGFR免疫组化结果中的“-”或“+”定义为不表达，“++”和“+++”定为表达，然后与PCR结果一起分析相关性。结果显示，HCMV感染与否与PDGFRα和EGFR是否表达均无明显相关性（kappavalue<0.1，p>0.05，表8，a，b）。然后，为了进一步探究细胞内HCMV的感染程度是否与PDGFRα、EGFR表达量有关，我们观察了同一样品同一部位HCMVIE，PDGFRα和EGFR的表达情况。我们定义：HCMV“-”为不感染，“+”为较弱感染，“++”为中等程度感染，“+++”为强感染，定义两种受体“-”或“+”为不表达，“++”为低中量表达，“+++”为高表达。部分免疫组化结果见图5。全部结果见表7。然后，我们对HCMV和两种受体的免疫组化结果进行统计相关分析，我们发现，HCMV感染程度与EGFR表达量正相关关系显著（p<0.05），而与PDGFRα无明显正相关关系（p>0.05）。21 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒表7：全部PCR有效结果的样品的HCMVIE，PDGFRα和EGFR免疫组化结果。NA：无组织切片。22 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结果图4：部分PDGFRα和EGFR免疫组化结果图。最上方为强度等级，样品号及病理类型如下，a：4，ASTⅡ-Ⅲ；b：37，GBM；c：25，GBM；d：37，ASTⅢ；e：27，ASTⅡ；f：24，LGG；g：7，ASTⅡ-Ⅲ，h：19，ASTⅡ图5：同一个位置的HCMVIE，PDGFRα，EGFR免疫组化和HE染色。最上方为样品编号。图中右下角标有相应信号强度，肿瘤病理类型如下：37：GBM；29：ASTⅡ，40：SCLCMT；41：NB23 结果通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒表8：a：HCMV感染情况与PDGFRα是否表达的统计结果与Kappa一致性检验结果。b：HCMV感染情况与EGFR是否表达的统计结果与Kappa一致性检验结果。c：HCMV感染强度与PDGFRα和EGFR表达量spearman相关分析结果。24 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒讨论讨论[12]自Cobbs等人发现胶质瘤中存在HCMV以来，关于HCMV与人类胶质瘤的关系研究成为当今研究的热点问题。目前，关于HCMV的感染机制问题、其在胶质瘤细胞中存在的问题，以及其在胶质瘤发生发展中的作用的研究已取得良好的进展，但关于其与恶性肿瘤之间的关系，以及其在胶质瘤细胞中是否存在的问题仍具有较大[35-38,41-43]的争议。有文献提到，使用qPCR，原位杂交，及免疫印迹等技术可以检测[12-14,27-29]到胶质瘤中的HCMV，且证明病毒蛋白IE-72可以增强细胞增殖，从而促进[44][45]正常细胞转化为肿瘤细胞。UL97蛋白可以磷酸化并激活Rb，介导肿瘤增殖。此外，将表达US28的细胞注射入裸鼠可以促进肿瘤的发生。但也有文献报道PCR[39,41-42]未检测到相关病毒基因，原位杂交及westernblot也检测出阴性结果，而认为[43]胶质瘤中并不存在HCMV，也没有体内实验表明HCMV可以导致恶性肿瘤的发生。不同地域来源的HCMV其基因组DNA差异较大，如美国、中国、日本等的HCMV基因组序列是不一样的，原因是基因组序列存在不同程度的突变，这样就可能导致目的基因由于突变的影响无法被检测到，而得到假阴性结果。为此，我们猜想，可能是因为检测方法缺陷导致了上面提到的假阴性结果。为此，我们将大量不同来源的HCMV基因组序列进行比对，发现基因组序列中存在大量突变区。我们经过对比和筛选，选择了一些最保守的基因组区段，在此区段设计引物，从而避免了序列的突变影响引物与模板的结合，然后用dropin/outPCR方法扩增一段HCMV的DNA。鉴于病毒基因组含量极低，普通PCR难以扩增出目的片段，因此，我们采用nestPCR进行扩增。我们实验室前期做用nestPCR检测了不同浓度梯度HCMV质粒，并检测了若干例颅内肿瘤样品的HCMV，发现可以检测到的最低HCMV质粒浓度为610copies/ml，并且在若干肿瘤样品中也检测到了HCMV（数据未给出），但我们在此过程中发现阴性对照频繁污染，原因可能是nestPCR需要取出第一轮产物进行第二轮扩增，增加了污染的机会，这样就有可能导致假阳性结果。因此，我们对nestPCR进行改良，使用dropin/outPCR来检测样品。此方法将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需25 讨论通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒降低退火即可直接进行第二次PCR扩增。我们在用dropin/outPCR检测样品的时候，未出现过阴性对照污染，并且该方法可检测到的最低质粒浓度远远高于nestPCR所能检测到的最低质粒浓度，因此我们打算对其灵敏性及准确性进行进一步验证，来判断此方法能否用于基础及临床上检测肿瘤样品中的HCMV。首先为了检测dropin/outPCR检测HCMV核酸的灵敏性，我们构建了HCMV和阳性对照IDH1的克隆质粒，并对其做10倍数量级的梯度稀释，然后用dropin/outPCR来检测不同梯度的质粒，检验能够检出的最低浓度的HCMV质粒。检测结果提示：4dropin/outPCR能检测到的最低浓度的质粒浓度为5*10copies/ml，高于nestPCR检6测到的最低浓度10copies/ml，因此我们认为，此方法检测HCMV有一定灵敏度，且灵敏度要优于nestPCR。IDH1所检测到的最低浓度较HCMV低，可能是HCMV的引物效率高于IDH1引物的效率引起的。然后，我们尝试用此方法来检测颅内肿瘤样品中的HCMV。我们共检测了50例肿瘤样品，得到了有效结果41例，无效结果可能是由于样品存放期间其HCMV基因组DNA和细胞基因组DNA降解所致。在所有有效结果中，HCMV阳性结果29例，阳性率71%，可见该方法检测HCMV的阳性率较为满意。而阳性对照IDH1阳性率并非100%，部分HCMV阳性而IDH1阴性的结果我们认为是该样品HCMV感染较重，而细胞基因组DNA提取量低所致。最后我们为了验证dropin/outPCR对于检测HCMV的准确性，我们用免疫组化这种较传统的方法检测41例样品的HCMVIE，将结果与PCR结果对比。我们发现，两者的HCMV阳性率在统计学上无明显差异。kappa一致性检验也提示两种方法对于检测HCMV的结果是较为一致的。由此可见，dropin/outPCR对于检测肿瘤组织中的HCMV有一定的灵敏性和准确性。部分PCR与免疫组化不一致的结果我们认为是样品长期存放表面暴露于空气导致HCMV蛋白或核酸降解所致，因此，若用较新鲜的样品来做检测，则更容易出现有效结果，并且两种方法的一致率也会更高。接下来，我们打算研究HCMV感染与肿瘤类型以及胶质瘤WHO分级之间的关系。首先我们为了探究HCMV感染与否与肿瘤类型以及胶质瘤WHO分级是否有关，将PCR结果与肿瘤病理资料结合做统计分析，结果提示：HCMV是否感染与肿瘤类型及WHO分型无明显相关性。然后，我们研究了HCMV感染程度与肿瘤类型及WHO分型的关系。用免疫组化不同HCMV强度等级的结果与病理资料做相关分析，结果也提示HCMV感染程度与肿瘤类型及胶质瘤WHO分级无明显相关。因此，我们推26 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒讨论断，HCMV是否感染以及其感染强度并不取决于肿瘤的类型和胶质瘤的级别，在各种类型及不同级别的胶质瘤中可以出现不同程度的HCMV感染。有文献报道，星型[40]细胞更倾向于感染HCMV，但其只针对体外实验而言，本实验统计分析结果尚不支持该结论。近年有研究表明，HCMV表面膜蛋白可以通过和细胞表面的受体PDGFRα和EGFR结合来介导病毒入胞，从而引起感染。其证明了HCMV表面gHgLgO三聚体与细胞表面酪氨酸激酶受体PDGFRα可以特异性性结合，启动gB蛋白的膜融合作用，将病毒核衣壳释放如胞内。而另一种通路，HCMV表面膜蛋白gHgLULULUL五聚体[33]与细胞膜表面受体EGFR和HER2结合介导细胞胞吞作用这一机制却未得到证实。由此，我们提出以下猜想：两种细胞膜受体是否表达可能会决定HCMV是否感染细胞；两种细胞受体高表达时，HCMV感染程度越严重，而两种受体低表达时，HCMV感染程度轻。为了验证我们的猜想，我们将dropin/outPCR结果、HCMVIE免疫组化结果与PDGFRα和EGFR的免疫组化结果进行了相关分析。我们发现，HCMV是否感染与PDGFRα或EGFR是否表达无明显相关性，由此我们认为，PDGFRα和EGFR两种细胞膜受体并不会对HCMV感染起到决定性作用，其感染机制有待于进一步明确。然后，我们还发现，EGFR的表达量和HCMV的感染程度明显正相关，而PDGFRα的表达量与HCMV的感染程度未见这种关系。可见，EGFR的高表达可能提高了HCMV进入细胞的机会而造成了更严重的感染。通过上述结果，我们推测，gHgLgO-PDGFRα与gHgLULULUL-EGFR两种通路可能不是HCMV进入细胞的仅有的途径，尚存在其他途径与这两种通路共同介导HCMV的入胞，其感染机制尚需进一步研究。综上所述，本课题提出了一种灵敏度与准确度均较好的检测肿瘤标本中HCMV的方法，避免了传统方法繁琐的步骤和高昂的成本，为临床检验和基础研究提供了方便。除此之外，本课题还进一步阐释了HCMV进入细胞的机制问题，对细胞受体PDGFRα和EGFR与HCMV感染程度的关系做了进一步的验证。本课题组将在后续的研究中进一步研究HCMV的感染机制问题，为HCMV感染与胶质瘤的关系研究提供充足的理论依据。27 结论通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒结论1.dropinoutPCR可以用于检测胶质瘤样品中的HCMV，并且其灵敏性与准确性良好。2.HCMV是否感染、感染强度均与胶质瘤病理类型以及WHO分型无明显相关性。3.HCMV是否感染与PDGFRα和EGFR是否表达相关性不显著，HCMV感染强度与EGFR表达量显著正相关，而与PDGFRα表达量无明显正相关关系。28 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒参考文献参考文献1.OstromQT，GittlemanH，FulopJ，LiuM，BlandaR，KromerC，WolinskyY，KruchkoC，Barnholtz-SloanJS（2015）CBTRUSStatisticalReport:PrimaryBrainandCentralNervousSystemTumorsDIagnosedintheUnitedStatesin2008-2012.NeuroOncol17Suppl4:iv-1-iv62.doi:10.1093/neuonc/nov1892.OzerlatI.Neuro-oncology:Imagingmeasurementscanpredictoutcomeforgliomaafterradiotherapy.NatRevNeurol.2012，8（5）:238.doi:10.1038/nrneurol.2012.703.RadnerH，BlumckeI，ReifenbergerGandWiestlerOD（2002），ThenewWHOclassificationoftumorsofthenervoussystem2000.Pathologyandgenetics.Pathologe23:260-834.SwistonJ，HubbersteyA，YuGandyoungD（1995）DifferentialexpressionofCAPandCAP2inadultrattissues.Gene165:273-75.WenPYandKesariS（2008）Malignantgliomasinadults.NEnglJMed359:492-507.doi:10.1056/NEJMra07081266.RobertsonT，KoszycaB，GonzalesM.Overviewandrecentadvancesinneuropathology.Part1:Centralnervoussystemtumours.Pathology.2011，43（2）:88-92.doi:10.1097/PAT.0b013e3283426e867.FergusonSD.Malignantgliomas:diagnosisandtreatment.DisMon.2011，57（10）:558-569.8.DeorahS，LynchCF，SibernallerZAandRykenTC（2006）TrendsinbraincancerincidenceandsurvivalintheUnitedStates:Surveillance，Epidemiology，andEndResultsProgram，1973to2011.NeurosurgFous20:E1.doi:10.3171/foc.2006.20.41.E19.StuppR，HegiME，vandenBentMJ，MasonWP，WellerM，MirimanoffRO，CaincrosssJG，EuropeanOrganisationforR，TreatmentofCancerBrainT，RadiotherapyGandNationalCancerInstituteofCanadaClinicalTrialsG（2006）Changingparadigms--anupdateonthemultidisciplinarymanagementofmalignantglioma，Oncologist11:165-80.doi:10.1634/theoncologist.11-2-16510.SoderbergNauclerC．Doescytomegalovirusplayacausativeroleinthedevelopment29 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通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒综述人类巨细胞病毒感染与神经胶质瘤的关系研究进展闫可综述崔岗审校摘要：人类巨细胞病毒（HCMV）是一种广泛存在的病毒，自从在神经胶质瘤组织中发现该病毒以来，关于其感染与胶质瘤的关系逐渐引起了人们的关注和重视。近年来，关于该问题的研究取得了良好的进展。目前研究证明，胶质瘤组织可以检测到人类巨细胞病毒，并且此病毒在胶质瘤的发生发展中起到一定作用。本文对目前该问题的研究现状进行了较为系统的综述，以期为该领域的进一步研究提供参考。关键词：人类巨细胞病毒（HCMV），胶质瘤HCMV又叫做人类疱疹病毒第五型，是一种DNA病毒，属于β疱疹病毒家族。[1-2]有研究报道，这种病毒对唾液腺及网状内皮组织有高度的亲嗜性。流行病学调查[3]显示，其在人群中的血清阳性率为80%。先天性的HCMV感染可能导致新生儿的[4]先天性缺陷。而在免疫功能正常的成人中，HCMV表现为潜伏性感染，而无明显临床症状。在一些免疫抑制的人群中HCMV感染才会表现出临床症状。关于HCMV感染与胶质瘤的关系是当今研究的热点问题。HCMV导致肿瘤发展的致病机制尚不清[5-10]楚，但有报道表明，HCMV可以通过肿瘤调节作用，促进细胞恶性转化，持续提供增殖信号，抑制细胞凋亡，促进新生血管生成，介导炎症反应等来促进胶质瘤细胞的生长，增强其迁移和侵袭的能力。1.检测肿瘤组织中的HCMV的方法在目前的研究中，比较有争议的是肿瘤细胞中是否存在HCMV的问题。有文献[11-13]报道在大部分胶质瘤组细胞中都可以检测到HCMV，也有文献否定这一结论[14-16]。这是由于不同检测方法检测的阳性率不尽相同，而且缺乏对具体阳性指标的统一定义。Scheurer等人在实验中，选出了最优的检测手段来检测肿瘤组织中的[17]HCMV。包括一些实验室常用方法可从组织或血液样品中检测到该病毒，检测对象34 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒综述为其核酸或蛋白。这些方法灵敏性、准确性较为良好，方便省时，检测仅需微量样品即可完成。1.1核酸水平的检测人类巨细胞病毒属于DNA病毒，因此在样品组织中检测到其基因组DNA或部分基因组DNA，以及转录产物RNA即可确定组织中有HCMV感染。常用方法有：1）巢式聚合酶链反应（nestedPCR）：通过从肿瘤组织的基因组DNA中扩增出HCMV片段来确定是否存在该病毒感染。BornaliBhattacharjee等人对16例不同级别[18]胶质瘤样品进行检测，有14例阳性结果（94%）。通常石蜡包埋组织提取DNA的量较少，普通PCR难以扩增出目的片段，而使用巢式PCR通过两轮反应即能得到特异性片段，提高了阳性率。此方法缺点是容易污染而造成假阳性结果，对操作环境要求较高。2）实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）：该方法可定量检测组织或血液中HCMV的拷贝量。Mitchell等人对20胶质瘤手术病人全血样品进行检测，得到16[13]例阳性结果（80%），而其余正常人血样中未发现HCMV。Bhattacharjee等人从6例肿瘤组织中扩增出HCMVUL123基因外显子内100-bp的片段，并测得病毒拷贝量16[18]在365-10个/500ngDNA之间。3）原位杂交（ISH）：将针对HCMV的特定核酸探针与组织切片中的病毒核酸进行杂交，可对病毒核酸进行精确定量定位。Mitchell等人首先用免疫组化检测到切片中HCMV的IE1蛋白，然后在同一位置用核酸探针检测该蛋白核酸，结果为100%阳性，证明IE1及其特异性核酸可以被检测到，而在坏死区和肿瘤周边正常脑组织未[20]发现HCMV核酸。1.2蛋白水平的检测蛋白检测的阳性率通常高于核酸，灵敏度与准确度均较高。因病毒核酸在福尔马林固时或长期放置后容易断裂和降解，且DNA提取时难免造成核酸的损失和破坏，而蛋白则相对更加稳定，因此是检测HCMV最为可靠而有效的方法。常用方法有免疫印迹法和免疫组化法：1）免疫印迹（Westernblot）：可以定性定量检测样品中病毒蛋白表达水平。有文献报道从12例胶质瘤样品中检测到HCMV的IE1和pp65抗原9例，然后对其中部[18]分样品进行gB55蛋白检测，其结果全部为阳性。35 综述通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒2）免疫组化（immunohistochemistry）：是检测HCMV最传统，最可靠的方法，[11-13]因其具有较高灵敏度准确度而被广泛应用。目前研究报道已可以检测IE1,US28,pp65,gB,HCMVIL-10,和pp28等病毒蛋白。其中IE1测出率最高而最为常用，其[11-13,22]阳性率可达100%。Scheurer等人在50例肿瘤样品中检测IE1-72蛋白，发现在胶母细胞瘤中，该蛋白表达于肿瘤细胞核及核周胞质，阳性率100%，而且在其他肿瘤如低级别胶质瘤、退行性神经细胞瘤，以及一些星型细胞瘤，少突细胞胶质瘤，[13,21]室管膜细胞瘤都有该蛋白表达。Mitchell也在胶母细胞瘤样品中检测到IE1和[13]pp65，阳性率分别为93%和91%。1.3其他方法如电镜成像，病毒DNA测序，酶联免疫吸附法，流式细胞计量术等理论上都可[24-25]以成为HCMV的检测方法，但因成本高昂或准确度低而极少使用。2.HCMV感染细胞HCMV可以感染多种类型的细胞，有研究报道在前列腺癌，直肠癌组织中也有[17,19]HCMV感染。关于其感染机制的研究也取得了一定进展。Cobbs等人证明病毒胞膜蛋白gB和细胞受体PDGFRα可以共介导病毒入胞，启动PI3K/Akt信号通路，对[26]肿瘤细胞生长和侵袭产生促进作用。最近Kabanova的研究证明，病毒表面膜蛋白gHgLgO三聚体可以与细胞表面酪氨酸激酶受体PDGFR-alpha结合来介导gB的膜融合作用使病毒进入胞内。其还提出另一种可能性：病毒膜蛋白gHgLULULUL五聚体可以与细胞表面酪氨酸激酶受体ErbB1和ErbB2结合导致其磷酸化，结果使细胞发[27]生胞饮作用而介导病毒入胞内，但该通路还未被证实。PDGFRα受体和ErbB1受体广泛分布与各种细胞膜表面，如上皮细胞、内皮细胞、造血前体细胞，神经细胞，星型细胞和胶质细胞等，因此以上研究结果也解释了为何HCMV可以感染不同种类[27-29]的细胞。目前关于HCMV感染属于裂解性感染还是潜伏性感染尚无定论，部分实验室存在矛盾报导。在胶质瘤样品和胶质瘤干细胞内尚未发现裂解性感染标志，即在核内表达病毒蛋白组分IE1和IE2，组织切片上呈现典型“猫头鹰眼”样，其参与调节病毒复[31]制相关的基因转录，从而启动病毒复制。而潜伏性感染标志为组织内存在病毒基因组基因，而无裂解感染相关基因表达，这一机制目前尚未明确。此外由于组织内多存[30]在IE基因表达迹象，提示肿瘤组织中可能无HCMV潜伏性感染。36 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒综述3.HCMV在胶质瘤发生发展中的作用3.1肿瘤调控作用[32,33]HCMV是目前已知可以导致先天性缺陷的病原体，然而在调节其调控脑肿瘤发生发展的机制还知之甚少。HCMV具有240kbp的基因组，编码大约250种蛋白，分子量在10-200kDa之间。其基因表达可分为超早期，早期和晚期三个阶段。完整的病毒颗粒包括内部的DNA和外层的核衣壳及含有33个膜蛋白的病毒包膜，其中一些蛋白是经过翻译后修饰的，如糖基化修饰。其中最常见的糖蛋白是UL38，UL54[34]（DNA聚合酶），UL97等，这些糖肽有助于介导病毒入胞和中和抗体。但有证据表明这些病毒产物可以影响细胞的行为，如UL10可以下调HLA-G水平，抑制NK[35][36]细胞的杀伤作用；UL38可以激活ATF4和JNK，抑制了内质网介导的细胞死亡。[37]病毒基因组编码12个病毒miRNA，其中一些具有潜在的肿瘤调节作用。此外，HCMV还可以直接调节细胞的增殖，肿瘤细胞侵袭，抑制凋亡，促进新生血管生成和免疫抑制。3.2产生持续增殖信号，激活细胞周期Cobbs等人发现HCMVIE可以在胶质母细胞瘤中持续表达，为了研究这种现象造成的影响，他们对胶质母细胞瘤细胞系（U87，U251，LN229，UL118）中的IE表达水平及细胞行为进行了评估。结果发现IE的水平会显著影响细胞的增殖。MAPK[38]和AKT信号通路的激活通常是造成这种持续增殖的机制。此外，肿瘤调节蛋白可[3940]以抑制细胞分化，并通过和p53，Rb和细胞周期蛋白相互作用介导细胞分裂，。在正常的细胞中，如果存在磷酸化的pRb，pRb/E2F复合物会被CDK2和CDK4破坏，[42-43]并且E2F会起到转录抑制因子的作用。而在HCMV感染的细胞中，病毒会通过[41]破坏pRb/E2F通路来抑制细胞通过G1/S临界点。除此之外，CMV还会通过激活[44]ERK，AKT，WNT和NFκB通路来调节被感染细胞的增生性表型。另一方面，据Straat等人报道：HCMV感染细胞后会导致本构端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达和端粒酶的激活。他们评估了端粒酶的调节因子Sp1的活动。通过对纤维母细胞（MRC5）的基因芯片分析，发现在HCMV感染发生后，Sp1和IE1会促进hTERT表达，[25]免疫组化结果也提示IEA和hTERT的表达有直接关系。3.3抑制细胞凋亡和自噬很多病毒都会表达一些特异性蛋白来避免病毒介导的细胞死亡，从而保证它们复37 综述通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒制周期的完整。在HCMV病毒中，存在凋亡和自噬两种机制可以导致细胞死亡。相对于自噬而言，凋亡是一个高耗能的过程，需要ATP及细胞凋亡酶的激活。和其他[20]疱疹病毒类似，HCMV基因组也可以编码Bcl-X1和Flip这样的细胞调节因子。据Zhu等人报道，HeLa细胞中IE1和IE2的表达产物蛋白可以通过通过TNFa来介导细[45-46][47]胞凋亡抑制。此外，这些病毒蛋白还抑制了PI3激酶通路介导的凋亡作用，这[48-49]种通路同样在HCMV感染时也起作用。GoldMacher，Sharon-Friling等人也报道[50-52]UL37和US28在HCMV感染细胞的过程中起到了抑制凋亡的作用。总而言之，HCMV会产生各种倾向于组织细胞死亡的蛋白，这些产物会通过延长HCMV的复制周期和释放病毒颗粒的方式来延长被感染细胞的生存时间。HCMV还可以通过内质[53]网应激（ERS）来组织细胞死亡。ERS可由DNA损伤，未折叠蛋白质反应导致的[54]内质网超负荷（UPR），以及钙离子平衡紊乱而引起。UPR和ER的积累效应可以引起JNK通路的激活，从而进一步引起线粒体促凋亡机制启动。HCMV可以引起ERS，并通过抑制JNK磷酸化作用来启动UPR。细胞在持续应激状态下便会消耗能[55-56]量，从而抑制了凋亡的发生。细胞自噬作用会导致细胞成分在应激反应的情况下空泡化，这是一种细胞的自我保护机制，从而提高生存能力。细胞蛋白如BECN1和ATG5在调节细胞凋亡的同时会对特定的刺激信号做出反应来调节细胞自噬作用，细胞凋亡与细胞自噬的关系往往[57]是模糊的。有文献报道：在初级纤维母细胞感染的早期，HCMV会表达BCL-12来抑制细胞自噬。被感染的细胞会表现出抵抗自噬作用发生的倾向，这就说明HCMV具有抵抗细胞自噬作用的能力。他们还发现了病毒可以编码这种类型的蛋白，并且可[58]以通过和BECN1和TRS1蛋白相互作用来抑制自噬的发生。3.4促进新生血管生成HCMV感染对于肿瘤血管的影响可以用内皮细胞潜在的复制能力来予以评估。有文献提到HCMV对内皮细胞有高嗜性，这一过程导致了内皮细胞被感染以及释放血管生成因子。有些报告也提到HCMV感染会导致IL-6，GM-CSF这样的血管生成[59-60]因子的释放。US28可以在血管内皮中表达，而在胶质母细胞瘤中也发现了该蛋[22]白的表达，它是一个在病毒感染早期由HCMV编码的G蛋白偶联受体，其基因序列与人类细胞因子受体CCR1和CX3R同源，并且可以结合CCL2，CCL5，CX3CL[61]等。US28在NIH3T3细胞中的稳定表达引起IL-6和VEGF的产生，将这些细胞38 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒综述[62]移植到裸鼠会导致肿瘤的形成。US28对于细胞内的影响包括上调细胞周期蛋白D1和NF-κB.NF-κB的激活会导致IL-6的产生，进而通过自分泌或旁分泌作用激活信号[22]转导和转录激活3通路（STAT3）。STAT3通路是肿瘤发生、胶质瘤中的免疫抑[63-64]制的关键分子中心。其在鼠神经前体细胞中激活会导致高级别胶质瘤的发生，以[65]及VEGF的表达和新生血管生成。3.5病毒介导的炎症反应和免疫抑制HCMV的毒力作用可以介导免疫逃逸作用，其可以通过多种机制来避免宿主细[66-67,69-70]胞引起免疫应答并促进免疫抑制。HCMV还可以通过表达ROS，RNS，和COX-2来引起慢性炎症反应。HCMV蛋白可以阻碍CTL和NK细胞识别和抗原提呈的过程。UL63（pp65）表达HCMV病毒蛋白IE1；US2可以介导HLAⅠ型和Ⅱ型的降解；US3可以保护内质网中的Ⅰ型分子；US11可以破坏Ⅰ型的肽链；UL16通过使配体ULBPs与受体NKG2D结合来抑制NK细胞的识别作用。HCMV还可以产生于[68]UL111A类似的IL-10来介导细胞PGE-2和TGF-β的表达来抑制NK细胞的应答。在炎症和免疫抑制的环境中，终末分化的未成熟骨髓细胞转变为成熟的巨噬细胞和树[71-72]突状细胞可以重新激活病毒。近期研究表明，在胶质母细胞瘤中，与肿瘤相关的[74]巨噬细胞和小胶质细胞都存在HCMV的感染。Cheeran等人也发现被感染的星型[73]细胞会引起MCP-1和1L-8细胞因子的分泌来吸引小胶质细胞。还有报道表明,HCMV对CD133+的肿瘤干细胞（CSC）有高嗜性，并且对巨噬细胞有亲嗜性。研究表明，在感染HCMV后，肿瘤起始细胞产生的CMVIL-10激活了单核细胞介导免[74-75]疫抑制的表型产生，这一过程和肿瘤相关的巨噬细胞和树突状细胞类似。3.6HCMV维持胶质瘤干细胞的干性胶质瘤干细胞（GSC）可以促进肿瘤的生长，是癌细胞的主要亚型。目前已知胶质瘤干细胞具有多能性，即有一定致癌性，这些细胞对目前放化疗疗法具有抵抗性。据报道在实验条件下的胶质瘤模型中，CD133+的肿瘤干细胞会提高生存能力。CD133+的神经前体细胞对HCMV有易感性，这也解释了为何脑肿瘤中会存在[76]HCMV。有文献报道，HCMV阻止被感染的前体细胞转变为神经元细胞和星型细胞，但不影响胶质细胞的转变。尽管实验数据支持神经元细胞和胶质细胞都能感染[77]CMV，并且可以作为脑内CMV的储存库，但NPC转变为GSC的机制尚不清楚。目前，有证据表明Sox2的产生对GSC的维持至关重要。感染CMV的GSC不仅比39 综述通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒[78]未感染的GSC生存时间更久，而且Sox2可以明显上调重要的干性调节因子。Cobbs等人也证明了CMV的IE蛋白也可以在GSC中表达，并且CMVIE1表达异常可以引起Sox2和巢蛋白表达增加，二者都是胶质母细胞瘤重要的干性标志。此外，实验还表明，减弱GSC中IE1的表达会抑制Sox2的表达、肿瘤形成，和减少细胞生存[79]时间。40 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通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒攻读硕士期间公开发表的论文攻读硕士期间公开发表的论文创作完成待发表论文：KeY,GangCui*,JianC,ZhenB,ULgeneofhumancytomegalovirusisdetectedinhumangliomasandrelationshipbetweeninfectionofHCMVandexpressionofPDGFRαandEGFR.49 中英文缩略词表通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒中英文缩略词表英文缩写英文全文中文译文ASTastrocytoma星型细胞瘤DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺EGFRepidermalgrowthfactorreceptor表皮因子生长受体EDTAesthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EMependymoma室管膜瘤EMBMependymoblastoma室管膜母细胞瘤GBMglioblastomamultiforme多形性胶质母细胞瘤HCMVhumancytomegalovirus人类巨细胞病毒IEimmediateearlyprotein立早期蛋白IDH1isocitratedehydrogenase1异柠檬酸脱氢酶1IHCimmunohistochemistry免疫组织化学LGGlowgradeglioma低级别胶质瘤MGmeningioma脑膜瘤LMTmetastatictumorfromlungcarcinoma肺癌转移瘤NBnormalbraintissue正常脑组织OAoligoastrocytoma少突星型细胞瘤OLIGoligodendroglioma少突细胞瘤PDGFRαplatelet-derivedgrowthfactor血小板衍生生长因子receptoralpha受体αPBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PBSTphosphatebufferedsalinetween磷酸盐缓冲液吐温PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应RMTmetastatictumorfromrectalcarcinoma直肠癌转移瘤SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SCLCMTmetastatictumorfromsmallcelllungcancer小细胞转移瘤50 通过中途进退式聚合酶链反应检测胶质瘤中的人类巨细胞病毒致谢致谢岁月如歌，光阴似箭，在苏州大学三年的学习生活即将接近尾声。这几年的时光既漫长又短暂，其中充满了酸甜苦辣，更有收获和成长。几年来，感谢陪我一起度过美好时光的每位良师益友，正是你们的帮助，我才能克服困难，正是你们的指导，我才能解决疑惑，直到学业的顺利完成。首先，我要衷心感谢恩师崔岗教授。感谢我的导师在这三年里对我的谆谆教诲和无微不至的关怀，感谢导师在我学习期间给予我的鼓励和信任，感谢导师悉心传授我丰富的科研及临床知识，感谢导师严格要求我养成严谨务实的工作作风和谦虚和善的为人之道。恩师渊博的专业知识、丰富的临床经验、严谨的治学态度、精湛的手术技艺、执着的敬业精神和高尚的人格永远都是我学习的榜样和奋斗的目标！衷心感谢周岱教授，惠国祯教授，朱凤清教授，王中教授，孙春明教授，张世明教授，周幽心教授，虞正权教授，李向东教授，陈罡教授，感谢李金泉主任、祁震宇主任、孙雪波主任、叶明主任、朱昀主任、孙晓欧主任、邵忠主任、黄煜伦主任、黄亚波主任、高薇主任、朱巍巍主任、李吻主任、张健主任、冯鸣主任，感谢陆挺、吴江、周鹏、周雷、王晶、刘建刚、毕永峰、吴瑜、马超、尤万春、张铁军、陆晓诚等各位老师的无私指导和帮助。衷心感谢神经外科张海英、沈梅芬、颜琪，徐颖护士长老师及全体护士老师给予的鼎力支持和帮助。衷心感谢师兄包赈，杨理想，陈周青，徐祥，王伟、李兵、汪洋，感谢同窗好友卢冰、徐力、窦阳、田孝迪、王奕斌、周峰、卜计源、孙亮、周亮、卢忠胜、余仁春、胡圆、翟伟伟等在学习、工作和生活中给予的帮助和支持。需要特别感谢的是我的父母。父母的养育之恩无以为报，他们是我十多年求学路上的坚强后盾，在我面临人生选择的迷茫之际，为我排忧解难，他们对我无私的爱与照顾是我不断前进的动力！最后感谢答辩委员会的老师和参与评审论文的老师，感谢你们在百忙之中对这篇拙作的指导、帮助和包容。51 Ｉｒ—＇１学苏！１呔１硕士学位论文．：＜专业学位｝－ｉ：：：■：，．４．，１￥灌ｉ錢ｔＪＪ
