聚合酶链反应

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1、聚合酶链反应【实验目的】掌握基本PCR扩增方法及PCR反应条件优化。【实验原理】用PCR方法进行的基因扩增过程类似于体内DNA的复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的过程，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸三个步骤组成的不断重复的过程。每次重复的三个步骤称为一个周期，经过25～30个周期之后，PCR产物以指数方式增加可达106～107。目前，人们已根据各种用途设计了不同的特殊PCR，本实验介绍的是经典PCR技术。【实验材料】（一）模板DNA：模板可以是单链或双链；可以是染色体DN

2、A；亦可以是克隆的质粒DNA。本实验使用克隆的质粒pCDNA3.1-FHL2(1μg/μl)经100倍稀释作为模板。表PCR反应体系模板量以50ulPCR反应体系为例人基因组DNA0.1～1μg大肠杆菌基因组DNA10～100ng质粒DNA0.1～10ngλDNA0.5～5ng（二）2×TaqPCRMasterMix:0.1UTaqPolymerase/µl，500μMdNTPeach，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂，使用终浓度为1×PCRbuffer。适用于常规PCR反应、复杂模板如GC含量高（&am

3、p;gt;60%），有二级结构等的扩增和大规模基因检测。（三）引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。1.引物序列：本实验PCR扩增片段FHL2大小约851bp。P1（FHL2-M1）：5'-ggatccgtatgactgagcgctttgactg-3'P2（FHL2-M2）：5'-gcggccgctcagatgtctttcccacagtc-3'2.引物的浓度公司合成的引物通常为干粉，使用前应先离心，然后再打开管盖溶解。通常配成贮存液浓度100pmol/ul，-20℃保

4、存，使用浓度10pmol/ul，使用终浓度0.4pmol/ul。3.引物稀释计算示例：例一：⑴假设引物合成量为1OD，配成贮存液浓度100pmol/L；引物长度20nt；A/G/C/T平均分子量为324；因此，总分子量：20×324=6480⑵1OD260=33ug，引物浓度为33ug/6480=0.0050925um=5.0925nm=5092.5pm⑶引物稀释：5092.5pm/100pM=50.9ul，即用50.9ul去离子水溶解，贮存浓度为100pmol/ul。例二：直接法计算贮存浓度为100pmol/ul。预稀释引物的微升数（ul）=OD数×33×1000

5、0引物分子量【实验反应条件设置】1．循环温度及参数设置典型的PCR循环由三部分组成：①模板热变性②退火③寡核苷酸延伸⑴变性温度与时间:①由G+C含量决定；②由DNA分子长度决定⑵退火温度与时间:取决于引物的长度、浓度和G+C含量。引物长度为15～25时，退火温度可选用Tm-5℃，时间30sec。⑶延伸温度与时间:72℃10min。⑷循环数一般以20～30次为宜。【实验器材】0.2mlPCR管0.5离心管2400/9700PCR扩增仪冰盒台式离心机水平式凝胶电泳设备【实验步骤】一、配制PCR反应体系1