三节聚合酶链反应

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1、第三节聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。1PCR2原理：1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；2）反应体系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3）反应程序：变性94~95oC复性延伸37~55oC70~72oC72oC延伸10minDNA扩增100万倍3PCR扩增4PCR特点及应用：特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠

2、，快速；2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断;缺点：（1）需靶DNA序列的信息；（2）产物短小，DNA复制不精确。5PCR相关技术：1.增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产

3、物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。62.巢式PCR（nestPCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。7在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显

4、子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3、多重PCR84.RT-PCRRT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。9RT-PCR10RT-PCRcDNA11五、单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。通常与

5、PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。12PCR-SSCP过程：---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子.解链构像DAN原理过程13第二节DN

6、A多态DNA多态（DNAPolymorphism）：群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常用做遗传分析中的标记。除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。14DNA分析中常用的多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。15一、序列多态

7、（或点多态）限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。16AlleleII产生了新的酶切点AlleleIAlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8KbRFLP—Southernblot检测结果17AlleleII酶切位点消失18

8、二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，variablenumbertendomrepeats,VNTR）重