聚合酶链反应及相关技术

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1、第九章聚合酶链反应及相关技术上海交通大学樊绮诗聚合酶链反应于二十世纪80年代由K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。第一节聚合酶链反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第一节聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是DNA体外复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似第一节聚合酶链反应第一节聚合酶链反应一、PCR反应原理、反应过程和特点二、PCR的反应体系三、PCR的反应条

2、件四、PCR技术的质量控制一、PCR反应原理和反应过程1.原理DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C～95C退火（annealing）:40C～70C延伸（extension）:72C变性:DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板退火:引物与模板互补结合，形成杂交链延伸:按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3´端，TaqDNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链一、PCR反应原理和反应过程5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’

3、3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入试管中添加反应混合液及样本变性一、PCR反应原理和反应过程5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环延伸继续延伸一、PCR反应原理和反应过程5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5

4、’3’5’3’5’3’第n个循环2n个拷贝一、PCR反应原理和反应过程2.特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增反应一、PCR反应原理和反应过程二、PCR的反应体系参与PCR反应的主要成份:1.模板2.引物3.脱氧核苷三磷酸4.TaqDNA聚合酶5.镁离子浓度6.其它反应因素1.模板（template）基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA模板量：1000ng

5、、500ng、100ng、50ng反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增二、PCR的反应体系2.引物(primer)化学合成的寡核苷酸与模板特异地结合决定产物的特异性和长度二、PCR的反应体系设计引物的原则(一)两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18～25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物浓度：0.1～0.2μmol/L，浓度过高容易生成引物二聚体二、PCR的反应体系设计引物的原则(二)引物的碱基组成应平衡，C+G碱基含量在引物中的比例一般以45%～55%为宜引物

6、退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5´端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）二、PCR的反应体系3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加最适浓度：20～200μmol/L二、PCR的反应体系4.TaqDNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃～90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性二、PCR的反应体系Taq酶的作用:在模

7、板指导下，以dNTP为原料，在引物3´-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3´,5´-磷酸二酯键，使DNA链沿5´→3´方向延伸，催化DNA合成最适酶量：1～2.5U二、PCR的反应体系TaqDNA聚合酶无3´→5´外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，因此扩增的片段越长，错配的机率越高二、PCR的反应体系耐热的高保真DNA多聚合酶：PwoDNApolymeraseTthDNApolymerasePfuDNApo

8、lymerase高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、PCR的反应体系5.镁离子浓度对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，影响酶的活性dNTP浓度为200μmol/L时，MgCl2浓度为1.5mmol/L较宜二、PC