聚合酶链反应及基因突变检测方法

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1、聚合酶链反应及基因突变检测方法上海交通大学医学院刘湘帆讲师聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C~95C退火（annea

2、ling）:40C~70C延伸（extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。PCR原理5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反应混合液及样本变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入试管中延伸5’3’5’3’5’3’5’3’继续延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环PCR原理5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环

3、4个拷贝第三个循环8个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n个循环2n个拷贝PCR原理94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendThePolymeraseChainReaction(PCR)1820-30X94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendCycle#2NIH20-30X二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要

4、成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。1模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等模板DNA需较高的浓度RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引物（Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物

5、的碱基组成应平衡引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）引物浓度：0.1~0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20~200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性

6、Taq酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。最适酶量：1-2.5U（酶量过多，导致非特异性扩增）TaqDNA聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。耐热的DNA多聚酶：PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolyme

7、rase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2~10倍。5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH=7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin、