资源描述：
《聚合酶链反应-医学ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、聚合酶链反应(PCR)一.概述聚合酶链(PCR)技术是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法.又称无细胞克隆技术.在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率.目前PCR已广泛应用到分子生物学研究的各个领域.具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点.1869年FriedrichMiescher发现DNA.1953年Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构1958年MatthewMeselson和FranklinStahl论证了DNA的半保留复制方式
2、。1960s中期从细胞中分离基因1960年代末和70年代初有了基因的体外分离技术.1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室的KaryMullis及同事于1985年发明了PCR技术;最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断.随后使用了1976年分离的热稳定性TaqDNA聚合酶,使PCR操作大为简化,并使PCR自动化成为可能;1987年完成了自动化操作装置,使PCR技术进入实用阶段.PCR技术作为一种方法学革命,大大推动分子生物学各有关学科的研究.现在生物医学中都在使用
3、PCR检测人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断疾病铺平了道路.同时PCR方法同DNA测序法结合起来成为研究动植物分类学的一种革新工具.二.聚合酶链反应PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。*在体外一被测靶基因为模板,于引物存在下通过聚合酶作用,反复多次对该靶基因选择性扩增,使被测的单拷贝基因成为超拷贝基因.*PCR操作范例在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTP、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物.循环时:模板DNA94
4、℃变性1min,引物与模板40～60℃退火1min,72℃延伸2min.循环25～40圈在首次循环前模板预变性3～5min;在末次循环后,样品仍需继续延伸3～5min以上,确保扩增的DNA为双链DNA.经此循环扩增后使被测的单拷贝基因成为超拷贝基因.三.聚合酶链反应原理PCR反应重复进行DNA复制的过程,使DNA得以扩增.每一次复制包括3个步骤:变性、退火、延伸.PCR反应基本要素:模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶、Mg2+、缓冲体系.加热使双链DNA解开螺旋↓在退火温度条件下引物同模板DNA杂交↓在Taq
5、DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物↓重复上述变性→退火→引物延伸过程至25-40个循环。靶序列被扩增上百万倍，达到体外扩增核酸序列的目的。PCR原理示意图加热，变性模板DNADNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成两条单链DNA温度下降，退火引物与模板DNA杂交引物延伸形成两条与模板DNA完全一致的DNA链经过若干个循环后，模板DNA大量扩增假设:扩增效率为“R”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为:y=(1+R)n扩增30个循环n=30若R=100%，则y=(1+100%)30=230
6、=1073741824(>109)若R=80%，则y=(1+80%)30=1.830=45517159.6(>107)由此可见,其扩增的倍数是巨大的,将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色紫外照射下可见DNA的特异扩增区带.四.聚合酶链反应体系PCR反应基本要素:模板DNA、引物、Mg2+、缓冲体系、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶.1.模板DNA:即为要被复制的核酸片断,包括基因组DNA和RNA、质粒DNA、线粒体DNA等.模板要求:(1)不可含有过多RNA.(2)应避免蛋白质或其他杂质的存在.模板纯化目的：除去影响PCR反应
7、的杂质，暴露模板DNA。反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增.传统的DNA纯化方法：采用去垢剂破坏细胞组份，蛋白水解酶消化去除蛋白质，最后用有机溶剂去除蛋白质和细胞膜成分，用乙醇沉淀核酸。快速的DNA纯化方法：用高温低渗液体（如水煮沸）溶解细胞，直接用于PCR扩增。2.引物引物为化学合成的寡合苷酸.PCR的效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板DNA的特异结合；二是多聚酶对引物的有效延伸,因此引物决定PCR扩增产物的特异性和长度.设计引物的总原则：提高扩增的效率和特异性。引物设计基本原则:(1)反应需有两条引物
8、,分别设在被扩增目的片断两端,并分别与模板正负链序列互补.(2)引物的长度:15～30bp,最佳为18～25bp.引物过长:①容易产生寡合苷酸的链内互补,形成发夹结构,影响引物和模板之间的互补.②将会提高退
