论山楂叶粗品多糖的分级纯化及纯度测定

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1、论山楂叶粗品多糖的分级纯化及纯度测定　　摘要：将山楂叶中的水溶性多糖成分提取出来，然后通过Sevage法来除去其中的蛋白质，用透析法来除去低分子量物质，再通过离子交换柱和凝胶柱洗脱来进行进一步的分离纯化。通过电泳、凝胶柱层析和高效液相凝胶色谱法来测定多糖精品的纯度，证明其纯度很高。 关键词：山楂叶粗品多糖纯化纯度测定 一、对山楂叶粗品多糖的分级纯化 材料与方法 　　在这里，我们是用过离子交换柱和凝胶柱来达到纯化多糖样品的目的。采用的离子交换柱为CM-纤维素柱，凝胶柱则为SephadexG-100。我们采用的是先过离子柱洗脱再过凝

2、胶柱洗脱。 1.材料 1.1仪器 　　玻璃柱(规格为Ф2×30cm),玻璃柱(规格为Ф2×100cm），LC-10ATSHIMADZU液相泵2台(一作主泵A,一作副泵B)，BSZ-100自动分布收集仪，收集管,756MC紫外分光计 1.2试剂 　　5mM的NaAC溶液，1N的NaCL，0.1NNaCL溶液，水为经过脱气过滤处理的去离子水。0.1g蒽酮与50ml浓硫酸混合成的蒽酮－硫酸液，均为分析纯。 1.3其它材料 CM－纤维素填料 SephadexG-100凝胶填料 两者均为进口。 2.实验方法 2.1过CM－纤维素离子交换柱

3、 　　先将CM－纤维素填料装入玻璃柱中，以5mM的NaAC洗脱液将两个液相泵(A泵和B泵)与柱联接成一真空系统，以0.5ml/min的流速平衡一天，之后即可上样，采用梯度洗脱，母液为5mM的NaAC溶液，梯度液为1N的NaCL溶液，上样量为5ml，流速0.5ml/min，隔15min收集一管，从第20管开始进行梯度洗脱。每隔两管用蒽酮－硫酸法监测[以管号为横坐标，620nm处紫外吸收值为纵坐标作图]，分别按相关峰位收集并冻干。之后取主要产物过SephadexG-100柱进行进一步的分离。 2.2过SephadexG-100凝胶柱

4、　　将SephadexG-100凝胶填料装柱，再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来，以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml，用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。 结果与分析 1.过CM－纤维素离子交换柱结果 　　山楂叶粗品多糖KS经过CM－纤维素柱梯度洗脱，分别按相关峰位收集并冻干之后，得到四个组分：KS1、KS2、KS3、KS4。其中，KS1占14%，KS2占25%，KS3占52%，KS4占9%，均为白色

5、絮状物。这里，KS3是主要组分。 　　2.过SephadexG－100凝胶柱洗脱结果 　　当KS3经过SephadexG-100柱洗脱，按相关峰位收集并冻干之后，可分成两个组分KS3′、KS3″。KS3′占28%，KS3″占72%。这里，根据含量比例大小的比较，KS3″为主要产物。 　　图2山楂叶多糖粗品过CM-纤维素柱洗脱曲线 　　Fig2ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharideextractonCM-cellulosecolumn 　　图

6、3山楂叶多糖过SephadexG-100凝胶柱洗脱曲线 　　Fig3ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharideextractonSephadexG-100column 二、纯度测定 　　这里，纯度的测定方法我们是采用了醋酸纤维薄膜电泳法、SephadexG-200凝胶过柱法和高效液相凝胶色谱法；分子量的测定则是采用了高效液相凝胶色谱法。 材料与方法 1.仪器 　　DYY—Ⅲ型水平电泳槽、美国产BIO-RAD电泳仪、冰箱，Waters液相色谱仪、R

7、ID-6A示差检测器，柱为MACROSEPHEREGPC，LC-10ATSHIMADZU液相泵、756MC紫外分光计，Waters510液相泵，5ul微量进样器。 2.试剂 2.1测纯度所需试剂 2.1.1醋酸纤维素薄膜电泳所需试剂 　　硼酸盐溶液：0.2N硼酸溶液及KCL溶液各125ML，0.2N氢氧 　　化钠溶液219.5ML混合后加水稀释至1L。 　　氧化液：1.2g高碘酸溶于30ml水中，加入15ml0.2N醋酸 　　钠溶液及100ml乙醇，置暗处，可使用数日。 　　还原液：5gKI+5gNa2SO3溶于100ml水，加

8、入150ml乙醇 　　及2.5ml2NHCL，随加随搅动，现用现配。 　　染色液：2g碱性品红溶于400ml沸水中，冷至50℃过滤， 　　通入二氧化硫气体至褪色，密封后置暗冷处保存， 如溶液变红，则不能使用。 　　冲洗液：1ml浓盐酸加0.4g偏重