用固相萃取和高效液相色谱法测定烟草中糖的研究.

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1、用固相萃取和高效液相色谱法测定烟草中糖的研究.用固相萃取和高效液相色谱法测定烟草中糖的研究.　　摘要本文研究了用固相萃取和高效液相色谱法测定烟草中糖的方法。烟草中的糖用水超声震荡浸取；然后用WatersSep-pakC18固相萃取小柱预分离，以WatersCarbohy-drate糖分析柱为固定相分离，75%乙腈为流动相分离，示差折光检测器检测测定。方法用于几种烟草样品中糖含量的测定，结果令人满意。关键词高效液相色谱法糖烟草1引言烟草中的水溶性糖主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和麦芽糖等，它们是影响烟草吸味的最重要化学成

2、分之一[1,2]，目前烟草中的糖的测定方法主要有氧化还原滴定法，分光光度法，连续流动分析和高效液相色谱法等[3]。但是氧化还原滴定法和分光光度法只能测糖的总量。液相色谱法是较可靠的糖测定方法，我们曾研究过用WatersSugar-Pak-1糖分析柱测定烟草中的糖，但蔗糖和麦芽糖不能完全分离[4]。本实验研究了用WatersCarbo-hydrate糖分析柱分离测定了烟草样品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和麦芽糖，五种糖均能达到基线分离。并建立了用水超声浸取，固相萃取预分离的样品前处理方法，获得了满意结果。2实验部分2.1

3、主要仪器和试剂美国安捷伦公司高效液相色谱仪，HP1100四元泵，HP1100自动进样器，HP1100示差折光检测器和色谱工作站；色谱纯乙腈；蔗糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、果糖标准。2.2色谱条件色谱柱：WatersCarbohydrate色谱柱；流动相为75%乙腈，流速为1.5ml/min；柱温35℃；进样量20μL。2.3样品处理准确称取烟草样品约0.500克，用50mL水在40-50℃下超声萃取30min，过滤，弃去最初的约10mL滤液，收集后面的滤液。取5mL通过预活化好的Sep-PakC18固相萃取小柱，弃去最初

4、的2mL，收集后面的3mL用4.5μm滤膜过滤，取20μL进样分析；在该条件下，标样和烟草样品的色谱图见图-1。 　　3结果与讨论3.1检测器的选择由于待测定物在紫外光区无吸收，而且待测物在样品中的含量较高，故选用示差折光检测器检测。3.2流动相和柱温的选择WatersCarbohydrate钙型阳离子交换柱为分离糖和多羟基化合物专用柱，该柱用75%的乙腈水溶液作流动相，柱温要求控制在℃之间，实验选用柱温为35℃。3.3样品前处理烟草样品中的糖一般按文献[3]的方法用80%乙醇提取，该方法需用醋酸铅沉淀单宁，蛋白质等干扰

5、物，过量的铅还需用草酸钾除去，操作麻烦。我们试验了新的样品前处理方法，由于待测的几种糖都易溶于水，所以实验选用水为提取剂。试验了振荡浸取和超声浸取对糖提取率的影响，在相同时间内超声浸取溶出率明显高于振荡浸取，故实验选用超声浸取，室温下糖溶出慢，升高温度可加速糖的溶出，但温度过高会加快蔗糖和麦芽糖水解，使蔗糖和麦芽糖回收率偏低，且葡萄糖，果糖回收率偏高；故实验选择浸取温度为40～50℃，在该温度下超声浸取25min以上可使糖完全溶出，故实验选用超声浸取30min。糖提取液应在最好当天测定，如放置过夜会因多糖水解导致葡萄糖测

6、定结果稍有偏高。烟草样品提取液中除了糖外，还含有少量其它成分，如单宁、多酚、蛋白质、油脂等。这些物质易腐蚀色谱柱且影响分离，所以在进样之前要预分离这些成分。我们采用Sep-PakC18固相萃取小柱预分离单宁、多酚、蛋白质、油脂等成分。用WatersSPE真空提取装置，每次可同时处理20个样，小柱活化和样品富集的流速均为10ml/min，小柱用5ml乙醇浸润，再用10ml水洗去乙醇，样品以10ml/min的流速通过小柱，弃去最初的2ml，收集后面的3ml用4.5μm滤膜过滤，取20μl进样分析，这样可有效地除去单宁、多酚、

7、蛋白质、油脂等水难溶成分和颗粒成分。3.4回归方程、相关系数及检测限分别配制浓度约为5mg/ml，lmg/ml，0.2mg/ml，0.04mg/ml的标准溶液，进样后计算出不同浓度的峰面积，计算出回归方程。回归方程为见表1。根表1回归方程、相关系数及检测限组分 　　据信燥比S/N=3，测得个组分最低检测浓度，结果见表1。表2方法精密度及回收率 　　2.5回收率实验及精密度取烟草样品按本文2.3处理，在相同色谱条件下测定5，结果见表22.6样品分析及结果用本方法测定了六种烟草样品中的糖，各糖回收率在98-102%之间，相对

8、标准偏差在0.55-0.82%之间。结果令人满意。4结论本方法用WatersCarbohydrate色谱柱高效液相色谱法测定烟草样品中的糖，并用水超声浸取提取样品中的糖，方法简便快速，结果可靠，样品可实现批量处理，可满足大量样品分析的要求，提高了工作效率。参考文献：1金闻博，戴亚编著.烟草化学.XX：清华大学出版社，